动物克隆

nullnull动物克隆技术 null一、胚胎工程 二、胚胎移植技术 三、动物克隆技术 四、核移植技术的应用null一、胚胎工程1、受精卵 胚胎 胚胎分裂、着床 着床前胚胎－“胚胎” 着床后胚胎－“胎儿” 胚胎细胞 体细胞四细胞囊胚胎儿成体受精卵null两性配子的结合 细胞分裂 细胞分化 胚层形成和组织发生 器官系统 新的个体 特定基因表达 2、动物胚胎学null 输卵管 ，输卵管液 子 宫 Mammal Embryo Bio-engineering出生 培养箱，培养液 子 宫 人 造 子 宫 出生 3、动物胚胎工程null动物胚胎工程定义 对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化。这一综合技术，统称为胚胎生物工程，或简称为胚胎工程（embryo engineering)。 广义而言，胚胎工程包括所有的对配子和胚胎的操纵以及人为地干预的现代方法。Mammal Embryo Bio-engineeringnull4、动物胚胎工程主要技术体外受精、显微受精与体外培养技术 胚胎移植技术 卵母细胞与胚胎冷冻保存技术 嵌合体动物制备技术 性别选择与鉴定技术 转基因动物制备技术 克隆技术null二、动物胚胎移植技术null供受体的情期同步，超数排卵与受精，受精卵的回收，胚胎质量的评价，移植，妊娠，动物（或人）出生null波尔山羊手术冲卵null检 卵null4细胞2细胞波尔山羊胚胎null波尔山羊胚胎移入奶山羊输卵管null移植后缝合的创口null40日龄B超诊断图null波尔羊羔与其养母 （莎能奶山羊）null动物的胚胎移植技术应用非常广泛，……试管婴儿人的胚胎移植？ 第一代试管婴儿（IVF） 第二代试管婴儿（ISCI) 第三代试管婴儿（遗传病诊断）北京时间10月4日下午5点30分，2010年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，英国科学家罗伯特·爱德华兹（Robert Edwards）因发展体外授精疗法获奖。 罗伯特?爱德华兹1925年出生于英格兰曼彻斯特。二战中服完兵役后，他进入威尔士大学和爱丁堡大学学习生物学，1955年获得博士学位，论文内容为小鼠胚胎发育。1958年他成为英国国立医学研究所研究人员，开始了对人类授精过程的研究。从1963年开始，爱德华兹相继在剑桥大学和Bourn Hall诊所（世界首个试管授精中心）工作。Bourn Hall由爱德华兹和Patrick Steptoe所建立，爱德华兹担任其研究主任多年。爱德华兹同时还是授精研究领域多本顶尖期刊的编辑。爱德华兹目前是剑桥大学名誉退休教授。 早在1950年，爱德华兹就认为IVF可以有助不育症的治疗。通过系统的研究工作，他发现了人类受精的重要原理，并成功实现人类卵细胞在试管（或者更确切地说，是细胞培养皿）中受精。1978年7月25日，世界上第一例试管婴儿的诞生，就是对爱德华兹的不懈努力的最好表彰。在接下来的几年内，爱德华兹和他的同事将IVF进行改良，并将其与世界分享。到目前为止，因为IVF而得以出生的人大约有四百万，他们中的许多人现已成年，甚至有的已为人父母了。在罗伯特?爱德华兹的引领下，对IVF疗法的研究获得了许多重要发现，一门新医学领域也由此诞生。他的贡献代表着现代医学史上的一座里程碑null三、克隆技术null（一）克隆概念null1、何为克隆？null我们生活中还有:??? null我们生活中还有:??? null四细胞 囊胚 胎儿 成体 2、什么是有性繁殖？与无性繁殖的区别null3、实现哺乳动物无性繁殖的途径？第一种途径：孤雌生殖 第二种途径：胚胎分割 第三种途径：细胞核移植 null第二节 胚胎分割 胚胎分割是指把着床前胚胎经过切割一分为二、或一分为四、乃至一分为八，然后把这种半胚，1/4胚、和1/8胚移入受体生殖道后发育成个体。 关键：一是分割后的胚胎能否发育成个体； 二是分割后获得的效率。 null1、分割后的胚胎能否发育成个体*每个受体仅移一个半胚 null2、分割后获得的效率 (理论能够提高一倍）*分割：每个受体移二个半胚；整胚移植：每个受体移一个胚胎. 表明,按每个胚胎的产犊数，胚胎分割的产犊效率较整胚移植可提高20%左右,其效率的提高主要表现在妊娠率的提高,显然是和每头受体移植胚胎数有关。其次是半胚移植后的同卵双胎。 乳牛胚胎分割和常规整胚胎移植效率比较 null3、胚胎分割方法 （1)针切割 null（2)刀切割 null3、胚胎切割中存在的问题 （1）切割胚胎的发育期：显然胚胎切割后的存活率是和胚胎具有的细胞数有关。 （2）胚胎分割次数和分割胚的发育;从理论上讲分割次数越多其可获得的同卵多胎越多,事实上胚胎最终发育成个体必须有一个最低细胞数. null（3）胚胎质量：用于分割的胚胎其质量显然影响效率 （4）分割胚胎在体外操作时间: 在胚胎质量良好和合适的培养条件情况下,分割胚胎在体外的时间并不影响半胚的出生率；null5、胚胎切割的在家畜生产中的应用（1）分割胚可以发育成个体.半胚能提高生产率,四分胚和八分胚则因分割胚细胞数减少而降低,无实用价值。 （2）胚胎分割可获同卵双胎(克隆动物)其效率在30%左右。首选是把一个卵对切后二个半胚同移于一个受体。 （3）胚胎分割技术可用于胚胎的基因型鉴定。nullNature, 2004, 428(22):860a、b,孤雌发育的小鼠； c,d 妊娠19.5d的孤雌发育的小鼠（死亡）； e,孤雌发育的小鼠自然繁殖的后代第三节 孤雌发育概 念：是指雌性生殖细胞不经受精作用而直接成胚的一种生殖方式.作为一种特殊的遗传生殖发育形式 null第四节 核移植动物null一、核移植动物制备方法制备核移植动物主要有三种方法null核移植动物制备方法－Ⅰnull去、移核操作过程图去核前去核中移核前移核中null融合体内培养的NT羊胚胎体内培养的NT羊胚胎null克隆猴技术路线克隆人？null核移植动物制备方法－Ⅱnull克隆动物制备程序－ⅢnullABCDDay 7 blastocyst without zona Handmade somatic cell cloned bovine embryos developing in WOWs at day 2 (a), day 3 (b), day 4 (c), day 6 (d) after reconstruction. null二、种间核移植何为种间核移植（克隆）？ 何为亚种间核移植（克隆）？ 为什么要做种间核移植？null三、核移植动物研究进展null（一） 异种体细胞核移植动物进展null供核:印度野牛 供质：家养奶牛卵母细胞 受体：家养奶牛CLONING，Volume 2, Number 2, 2000nullnature biotechnology • VOLUME 19 • OCTOBER 2001 供核: 殴洲盘羊 供质：绵羊 受体：绵羊nullSCIENCE VOL 300 18 APRIL 2003供核:白臀野牛 供质：家养奶牛卵母细胞 受体：家养奶牛null（二） 种内体细胞核移植动物进展－－核nullNature. 1997 Feb 27;385(6619):810-3. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells nullReconstituted embryos (left) after coculture with BRL cells in vitro or 2 days (X200). Rhesus monkey infants (right) produced by nuclear transfer technology. Biol Reprod. 1997 Aug;57(2):454-9. nullFull-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei Nature. 1998,394(6691):369-74. Cloned mice. a, The first surviving cloned mouse, Cumulina (born 3 October 1997) at four weeks (foreground) with her foster mother. b, Cumulina at 2.5 months with the pups she produced following mating with a CD-1 (albino) male. c, Two B6C3F1-derived, cloned, agouti young (centre) in front of their albino foster mother (CD-1), and a B6D2F1 oocyte donor (black, right). The two agouti offspring in the centre are clones (identical 'twin' sisters) of the agouti B6C3F1 cumulus donor shown on the left, and are two of the offspring described in series C (see text) nullTetra, a nonhuman primate quadruplet cloned from an eight-cell embryo by splitting Science. 2000 Jan 14;287(5451):317-9 nullPNAS, 97( 3): 990-995, 2000 The cloned calves and the 17-year-old bull used for cloning. Cloned calves from left to right: Pass 15-A, Pass 15-B, Pass 10-B, and Pass 10-C.nullCloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells Nature Biotechnology 2002, 366-369 (A) Cloned rabbit 0107 with corresponding controls: (A1) expression of the EGFP protein fluorescence (arrowhead) detected by confocal microscopy from hair follicles obtained from an ear biopsy at 1 month of age; (A2) the same under transmission light; (A3) amplifications of the EGFP transgene (PCR 2) and of the exon 10 of the CFTR gene used as DNA quality control (PCR 1) with expected fragment sizes of 240 bp for the CFTR gene and 350 bp for the EGFP transgene. This confirms that rabbit 0107 and its littermate 107b (who died 1 day after birth) were derived from the donor cumulus cell. (B1, B2) Three other rabbits from two different litters; rabbits in B1 have now proved to be fertile.nullTargeted disruption of the alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs Nat Biotechnol. 2002 Mar;20(3):251-5 nulla, Adult female cat that supplied cumulus cells for nuclear transplantation. The cells were cultured in DMEM/F12 medium for 5 days at 37 °C until confluent; micromanipulation was used to enucleate ova obtained after routine ovariohysterectomy and to transfer the donor's cumulus cells into the perivitelline space. Enucleated ova and cumulus cells were fused by electrofusion; a second electropulse was applied to activate the oocytes. b, The surrogate mother, a synchronized recipient of three cloned embryos, produced one cloned kitten, which was delivered by caesarian section 66 days after embryonic transfer. For further details, see supplementary information.A cat cloned by nuclear transplantation Nature 415, 859 (21 February 2002) | doi: 10.1038/nature723nullProduction of cloned goats after nuclear transfer using adult somatic cells Biol Reprod. 2002 Jan;66(1):199-203. a) Granulosa cell donor (ID no.356). b) Granulosa cell clone (GC2.1) derived from the donor goat shown in a. c) Granulosa cell donor (ID no. 358). d) Granulosa cell clones (GC2.3, GC2.4, GC2.5, and GC 2.6) derived from the donor goat shown in c.nullwww.sciencemag.org SCIENCE VOL 301 22 AUGUST 2003 1063A Mule Cloned from Fetal Cells by Nuclear Transfer Cloned mule foal, named Idaho Gem, born on 4 May 2003. Photograph taken 5 May 2003; copyright Phil Schofield, University of Idaho.骡nullNATURE| VOL 424 | 7 AUGUST 2003 |The cloned foal, named Prometea, with its genetically identical mother seven days after birth. The cells used for cloning were derived from a skin biopsy of the mare. The enucleated oocytes were obtained by in vitro maturation and removal of the nucleus from oocytes recovered from horse ovaries from an abattoir. After embryo reconstruction by micromanipulation and cell fusion, the cleaved embryos were cultured in vitro to the blastocyst stage. Two of the derived embryos were transferred into the mare donor of the cell line. A single pregnancy was established and was carried to term with the birth of a female foal who is genetically identical to her surrogate mother.nulla, Snuppy, the first cloned dog, at 67 days after birth (right), with the three-year-old male Afghan hound (left) whose somatic skin cells were used to clone him. Snuppy is genetically identical to the donor Afghan hound. b, Snuppy (left) was implanted as an early embryo into a surrogate mother, the yellow Labrador retriever on the right, and raised by her.Dogs cloned from adult somatic cells Nature. 2005 Aug 4;436(7051):641 nullCloned ferrets produced by somatic cell nuclear transferDev Biol. 2006 May 15;293(2):439-48. Epub 2006 Apr 3. Fig. 2. (A) Two cloned sable coat-color female ferret pups, Libby and Lilly (at 7 weeks of age), produced by SCNT and ET into an albino surrogate Jill. (B) Lilly with her 6 newborn pups. (C) Libby with her 10 newborn pups.null（三）上海转基因研究中心 获得的克隆动物nullSP3179号波尔羊克隆羊SP3179CB-1CB-2CB-3CB-4CB-5CB-6CB-7null138号杂交一代波尔羊克隆羊 138CO-2CO-4CO-6CB-1OCO-12CO-14CO-16CO-8nullNo.1No.2No.3No.4No.5No.6No.7No.8No.9杂交二代波尔羊克隆羊No.10No.11No.12No.13No.14No.15null基因打靶体细胞克隆羊null四、影响核移植动物成功率的因素null 卵母细胞去核率 约70% 移核成功率 约90% 融合率 约80% 重构胚发育成囊胚 约30% 移入受体母畜产生后代 约30% 核移植最终获得后代 约3.8%核移植流程中各步骤的参数null（一）核移植操作技术 （二）供核细胞 （三）供质细胞－卵母细胞 （四）核移植胚胎的着床及着床后的发育 （五）分娩与克隆动物的出生后护理影响核移植动物成功率的因素null（一）核移植操作技术对克隆效率的影响null1、去核：（盲去、荧光下去核、化学去核、切割） 移核：胞质2、融合：电融合、仙台病毒3、激活4、NT胚胎的培养5、NT胚胎移植 带下null（二）供核细胞对克隆效率的影响因素1、供核的分化程度对克隆效率的影响（1）胚胎细胞－－胚胎分裂球（64-囊胚） （2）胚胎干细胞（ES细胞） （3）体细胞（颗粒细胞、成纤维细胞）null1、供核的分化程度对克隆效率的影响null2、供核的类型对克隆效率的影响null（三）供质细胞－供质卵母细胞对克隆效率的影响2-细胞胞质 受精卵胞质 MII卵母细胞（In Vivo and In vitro）nullSerial Pronuclear Transfer Increases the Developmental Potential of In Vitro-Matured Oocytes in Mouse Cloning1nullnull（四）核移植胚胎的着床及着床后的发育1、着床或妊娠率：受体的同步性2、着床后的发育率null（五）分娩与克隆动物的出生后护理1、妊娠期2、分娩与助产3、刚出生克隆动物的护理nullMammal Embryo Bio-engineering四、核移植技术的应用第一个方面：在基础理论问题的研究 第二个方面：在动物生产上的应用 第三个方面：在生物医药上的应用null第一个方面：在基础理论问题的研究，如： 核质之间的相互作用 卵裂开始到着床前的发育－－母源性基因调控胚胎细胞全性的调控到胚胎基因的调控； 器官形成与组织发生的研究－组织发生的分子机制、基因表达的时空调的研究等Mammal Embryo Bio-engineeringnull第二方面：在动物生产上的应用 (1)挽救濒危动物Mammal Embryo Bio-engineeringnull (2) 快速扩大优质种畜群Mammal Embryo Bio-engineeringnull (3) 改造和培育动物新品种 －－转基因动物克隆动物 生长快的动物（含人生长素基因的转基因小鼠） 动物乳腺生物反应器（含人蛋白基因的转基因家畜） 抵抗某些传染病的动物品种，如不感染疯牛病的转基因牛羊等 Mammal Embryo Bio-engineeringnull第三个方面：在生物医药上的应用 (1) 生产人用珍贵蛋白（家畜生物反应器）nullMammal Embryo Bio-engineering(2) 提供人类器官移植用组织器官---治疗性克隆null----供人类器官移植用猪器官克隆出可用于人体器官移植的猪-英国Targeted disruption of the s1,3 galactosyltransferase gene in clone pig. Nature Biotech. 2002, Mammal Embryo Bio-engineering四、精子介导法四、精子介导法将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 717–723nullnull最引人注目的报道是意大利学者Lavitrano 等在小鼠上进行的研究, 他们将获得的小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起37℃孵育30min 后, 再与成熟卵子进行体外授精, 这样得到的胚胎在2- 细胞期移植入受体鼠的输卵管内, 在受体鼠产出的250 只体外受精鼠有30%(70/250)为阳性个体。实验还发现阳性个体中转入的基因可以稳定地整合入生殖细胞系, 而且在转基因的后代个体的组织器官中, 特别是在尾组织和肌肉组织中可检测到CAT 基因的表达。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 717–723 在Lavitrano 的文章发表不久, Binster 等根据Lavitrano 的实验, 用近10 种基因结构、6个不同品系的小鼠、多种培养液和不同基因浓度在得到的1 500 只小鼠中没有阳性结果, 这使人们对精子载体法变得谨慎和怀疑. null SMGT 方法离不开精子。精液来源、精液品质、精清、精子质膜和精液处理方法等构成了SMGT 方法的精子因素。同时,SMGT 方法被认为制备转基因小鼠、猪、兔、羊.精子载体转基因机理精子载体转基因机理精子携带外源DNA 的条件 Spadafora 等1998 年的研究结果表明, 几乎所有动物的精子都具有与外源DNA 结合的能力,但只有附睾精子和经洗涤去除精清的射出精子才能够有效携带外源DNA, 这说明精清中的某些成分强烈抑制外源DNA 的结合。在自然受精时, 因为精清对精子的保护作用, 杜绝了外源遗传物质对遗传稳定性的干扰, 避免了物种的变异。目前,已在哺乳动物精清中和低等动物(如海胆)的精子表面发现了一种颉颃DNA 结合的抑制因子(称为IF- 1), 来源于海胆精子的IF- 1 的提取物经纯化分析, 确定它是一种37 kDa 的糖蛋白. □精子结合外源DNA 的核内化过程 核内化的发生是在结合的最初几分钟开始并有精子细胞膜上CD4 分子进行信号传导, DNA 结合蛋白(DBP)与外源DNA 形成的核蛋白复合体(DBP/DNA)是产生核内化的触发信号, 使得DNA/DBP/CD4 复合体进入精子内并穿过核孔抵达核基质区, 此时DNA 与DBP/CD4 解离, DBP和CD4 分子返回精子细胞膜, 继续介导其他的外源DNA 进入精子细胞核内, 而外源DNA 则与核基质(MAR)区在染色体的拓朴异构酶的作用下发生外源基因的整合。精子与外源DNA 结合的因素精子与外源DNA 结合的因素DNA 片断的长短, 大片段(7kb)较小片段(150～750bp)更容易被精子所摄取 DNA、多聚阴离子、低等电点的蛋白质等物质与精子相结合的过程中这些分子的电荷密度具有决定意义。分子电荷性的重要性最近已得到进一步证实: 精子- DNA 复合体可以很容易地被高盐溶液(250～700mmol/L NaCl 离子梯度)分开[14]。由于多聚阴离子物质在精子头部结合部位相同, 因此存在一种特殊底物蛋白即DNA 结合蛋白(DBP), 这种蛋白充当精子和核酸相互作用底. 正常生理条件下, 动物排出的精液中含有特异的抑制因子IF- 1, 使精子失去了与外源DNA 的结合能力。对精子和附睾精子的清洗可提高精子与DNA 结合效率. 精子获能是一个极其复杂的生理过程, 受多种因素的影响, 其中与Ca++、K+、Na+ 等离子的浓度密切相关.小结小结nullThank you