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乳铁蛋白肽的研究现状及进展

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乳铁蛋白肽的研究现状及进展 高海燕,等:乳铁蛋白肽的研究现状及进展 一 15一 乳铁蛋臼肽酌研究现状及进展 高海燕 郭荣富 (云南农业大学动物营养与饲料重点实验室,云南 昆明 650201) 摘 要:乳铁蛋白肽(Lactoferricin,Lfcin)具有杀菌、抗病毒、抗真菌等多种独特的生物 学活性,本文综述了其结构、生物学功能、国内外研究动态及其应用前景,提出了其研究中存 在的问题及相应对策。 关键词:乳铁蛋白肽;结构;生物学功能 A New Type of Antibacterial Peptide——Lactoferri...
乳铁蛋白肽的研究现状及进展
高海燕,等:乳铁蛋白肽的研究现状及进展 一 15一 乳铁蛋臼肽酌研究现状及进展 高海燕 郭荣富 (云南农业大学动物营养与饲料重点实验室,云南 昆明 650201) 摘 要:乳铁蛋白肽(Lactoferricin,Lfcin)具有杀菌、抗病毒、抗真菌等多种独特的生物 学活性,本文综述了其结构、生物学功能、国内外研究动态及其应用前景,提出了其研究中存 在的问题及相应对策。 关键词:乳铁蛋白肽;结构;生物学功能 A New Type of Antibacterial Peptide——Lactoferricin Gao Haiyan Guo Rongfu (Animal Nutrition and Feed Laboratory of Yunnan Province,Kunming 650201) Abstract:Lactoferricin has various biological functions to human and an imals,such as bacte— rial killing.fungal resisting and viral inhibition an d so on.This review discussed the structure, function and progress of study Oil lactoferricin at home an d abroad.In addition,some problems an d opinions on the study of lactoferricin were put forward. Key W ords:La ctoferricin;structure;function 目前抗生素作为饲料添加剂的弊端已经 日 益为人们所重视,限制抗生素的使用已不可逆 转,因此如何寻找抗生素的替代品已是各国动物 营养学家最为关注的焦点。近年来抗菌肽由于 自身的优点成为抗生素的替代品,并已成为学术 界研究与开发的热点,其中乳铁蛋白肽(Lacto— ferricin,Lfcin)因其强大的生物学功能而备受关 注,最初是由Bellamy等⋯从乳铁蛋白水解物中 分离到一种乳铁蛋白多肽,即牛乳铁蛋白肽(Lf- cin B),此后相继在人、小鼠、山羊、猪 等动物 乳铁蛋 白中证明存在 Lfcin的同源物。Lfcin是 靠近乳铁蛋白N一端,具有比LF强400多倍的 抗菌活性⋯,并具备 LF的所有生物学活性,如 抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫 反应等。后研究发现,Lfcin与乳铁蛋白的功能 密切相关,除不能结合铁离子外,不含稀有氨基 酸和外源化学成分,是一种安全健康 的产品。 Lfcin由于具有强大生物学功能及安全性等优点 显示了其替代抗生素的巨大潜在优势。因此,本 文就其近年来关于Lfcin的结构、功能、作用机制 的研究进展进行综述。 1 Lfcin的结构 乳铁蛋白肽(Lfcin)是 LF在酸性环境下经 胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽,LfcinB是从 BLF的N端(17—41)被水解下来的25个氨基 酸残基,其顺序为:Phe—Lys—Cys—Arg—Arg— Trp——Gin——Trp ——Arg—-Met—-Lys-·Lys-·Leu—- Gly—Ala—Pro—Ser—Ile—Thr—Cys—Val—Arg — Arg—AJa—Phe【3J ,其中的 11个氨基酸残基具 有与完整的LfcinB相同的抗菌活性。l1个氨基 酸残基中的6个氨基酸残基 (LfcinB。一,)是 cinB的活性中心。人的乳铁蛋白肽(LfeinH)来 源于人乳铁蛋白的 1—45位氨基酸,公山羊乳铁 蛋白肽(LfeinC)为 l4—42片段。LfcinB分子中 l 8个氨基酸残基靠一个分子内二硫键结合而形 成一个环,LfeinH是 ll与 l2位氨基酸残基之间 一 l6一 中国饲料添加剂 2007年第7期(总第61期) 的肽键断裂,两个肽片段靠二者间的二硫键连接 成为一个分子。但研究明,二硫键在抗菌过程 中作用不大,被破坏后 LfcinB的抗菌活性并不 Argl 减弱 引。LfcinH和LfcinB的单字码一级结构和 二硫键形成的环状结构如图1[ 所示。 H RN硅R 嗽 T 一 Lfcin B K FKC-s— V 一 CIKPDSP10cI GRRRRsvQw 3A S L § r - CVRRAF 圈1 Lfein的一级结构和二硫键形成的环状结构 LfcinB的二级结构是在一级结构的肽链上 折叠而成,天然状态下包含 Ot一螺旋和 B一折叠 构象 J。LfcinB在 LF分子中呈 a螺旋结构,当 解离下来后 a螺旋结构消失,转变成以 B一折叠 为主的两亲性结构,其中疏水的Trp残基和带正 电荷的Arg和 Lys残基是相互分开的 ,这种结 构上的改变导致其两性分子更易靠近细胞膜,这 是其抗菌功能所必需的,也解释了 LfcinB抗菌 活性明显强于 LF的原因 。然而,LfcinB在溶 液中的这种分子结构具有很大的可变性,能够根 据其所处的外部环境形成特定的构型,LfcinB的 这种分子动力学性质可能与其所具有的多种生 理功能有关。LfcinH在人乳铁蛋白分子中也呈 a螺旋结构,但解离后 LfcinH的分子结构还不明 确。 BLF的立体结构是在二级结构的基础上折 叠成两个基本相等的叶(N一叶和 C一叶),每一 个叶状结构中含有一个与 Fe¨ 结合的部位,此 部位存在于_个很深的裂隙中。LfcinB的立体 结构远比BLF简单。为了进一步了解 LfcinB的 立体结构,Schibli等(1999)通过核磁共振技术 对 LfcinB的活性中心 LfcinB 一。的三维结构进行 了研究 ,结果见图2。 图2显示,碱性的Arg残基和疏水的Trp残 图2 l_fcinB4一 的三维结构(来源于Sshibli,1999) 基充分分离,形成了两性分子结构,Arg残基在 分子的一侧,Trp残基在分子的另一侧,Gin在分 子的中间。对含有25个氨基酸残基的LfcinB的 结构分析也表明,LfcinB也是两性分子结构;Trp 残基和带正电荷的 Arg和 Lys残基是相互分开 的 。以上结构特征与 LfcinB 一 和 LfcinB抗菌 抗病毒功能是分不开的。 2 Lfcin的生物学功能 2.1 抑菌、杀菌 LF的抗菌活性在其众多的生物学功能当中 最显著,而Lfcin的抗菌活性要高出LF400多倍, 故Lfcin的抗菌功效在其功能当中也占了很重要 的地位,同时预示了其替代抗生素的可能性。 Lfcin的抗菌谱广,包括许多 G 、G一病原菌及真 菌,例如埃氏大肠杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡 萄球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变 形杆菌、结肠耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、白喉棒 状杆菌、弯曲杆菌、链球菌、单核细胞增生李斯特 氏菌和产气荚膜梭菌;对引起消化道功能紊乱的 白色念珠菌有强烈的抑杀作用 引。对于细菌 有研究发现,E.coli(G~)的脂多糖和金黄色葡 萄球菌(G )的磷壁酸是 LfcinB的最初结合位 点。Lfcin在细菌表面的结合在杀菌活性中有重 要作用[I 。对于真菌,除个别 G ,生长在 1% 蛋白胨培养基或 Sabouraud葡萄糖培养基的真 菌、G 和 G一在较低 LfcinB浓度下均不能生长, MIC为 101xg/mL左右u 。Bellamy等⋯(1992) 研究了28个菌株对 LfcinB的敏感性,所选待测 菌株包括 G 、G 、杆菌、球菌、专性需氧菌、兼性 厌氧菌、专性厌氧菌,测定了在蛋白胨基础培养 基和 YPG培养基上 Lfcin的有效抑菌浓度。结 高海燕,等:乳铁蛋白肽的研究现状及进展 一 17一 果表明,随菌株和培养基变化其有效浓度在 0.6 — 150~/mL范围内不等,并且得出G 比G一对 Lfcin更敏感。除此之外,Lfcin对真核微生物如 霉菌、酵母也具有抑制作用。 2.2 抗病毒 近年来的研究表明:LfcinB可以抑制细胞巨 化病毒和 HIV、疱疹 1型和 2型病毒、肝炎病毒 和流感病毒、腺病毒和轮状病毒等,降低对宿主 的感染力,抑制病毒颗粒复制。有研究表明,Lf- cinB在病毒感染的第一个阶段吸附过程中起作 用 引¨,因此推断 LfcinB可能与病毒结合,从而阻 断病毒与宿主细胞的结合。Q一螺旋结构的抗 菌肽,如 Magainins和LL(37)对 HSV一1和 HSV 一 2病毒没有作用,而一些 B一折叠结构的抗菌 肽,如 Defensin、Proleginins和LfcinB则能够抑制 这两种病毒和 HIV对宿主细胞的感染。因此推 断,LfcinB作为一种阳离子型抗菌肽,其 B一折 叠结构在抗病毒过程中起重要作用 ¨,即 Lfcin 带正电荷、疏水集团和环状结构等因素都与其抗 病毒“吸附一封闭”机制有关 ,¨]。 2.3 抗寄生虫 Lfcin对于某些鞭毛虫、鼠弓形体、兔肝艾美 虫等具有一定抑制作用。有研究表明,Lfcin能 抑制贾第鞭毛虫的生长,并将在培养基中生长的 虫体杀死-1 。因为 Fe¨ 可减弱 LF和 Lfcin对 其抑制效应,而 Lfcin不含 Fe¨ 结合中心恰好是 其抑制贾第鞭毛虫的机制所在。Turchany-】刮等 (1997)也证实了Fe¨ 可降低 LF或 Lfcin与贾第 鞭毛虫的结合能力,表明Lfcin对其抑制作用与 贾第鞭 毛虫对 铁 的利 用有关。Tanaka[17]等 (1995)发现 Lfcin可抑制体外环境下的鼠弓形 虫生长。Omatau 等(2001)试验表明,LfcinB可 有效减弱弓形体、兔肝艾美虫等病原虫对宿主细 胞的感染力。每天饲喂 5.0rag或皮下注射0.1 mgLfcinB给感染弓形虫的小鼠无一死亡,对照组 死亡率达 80%,此外处理组脑组织感染寄生虫 量显著低于对照组,结果表明 LfcinB可有效抑 制弓形虫对宿主的侵染。 2.4 对内毒素的作用 Lfcin对于内毒素的作用体现了其调节免 疫与消炎的功效。脂多糖(LPS)是 G一细菌细 胞膜上的主要成分,包括许多内毒素类物质 都属于 LPS类 ,在通常情况下,LPS在细菌死 亡或增殖时被释放出来,然后会导致免疫反 应。Lfcin作为一种阳离子型抗菌肽 ,能与带 有负电荷的免疫原结合 ,封闭其抗原性,阻断 其对机体的免疫刺激作用,因此可以与 LPS 靠静电作用结合 ,使其毒性丧失。近来研究 表明,一些阳离子型抗菌肽 ,如嗜中性粒细胞 颗粒释放的 、B防御素,能够与免疫细胞膜 上的趋化因子受体结合 ,发挥免疫趋化因子 的这种趋化作用。带有强正电荷 LfcinB同样 也可能通过趋化性来达到调节免疫反应和消 炎的功能。众所周知,蛋 白质或多肽在初生 哺乳动物消化道内可被完整吸收并转运 ,而 对于正常动物或人 ,二肽、三肽 由特异性转运 载体吸收,多肽则很难以非特异性吸收形式 进入血液。LfcinB作为一种由25个氨基酸残 基组成 的多肽同样难 以吸收,确有研究结果 表明口服 Lfcin可调节机体免疫水平分子、辅 助杀死体内致病细菌、原虫或病毒等 ¨2。 , 故其作用的实现方式成为现在的研究热点。 有报道小肠刷状缘膜和肠道淋巴细胞存在 LF 特异性结合受体 ,而 Lfcin在 LF与受体结合 中起关键作用 ¨,Lfcin可与人多形白细胞作 用促进释放干扰素 一8 ,由此人们推测,Lf_ cin是以受体介导形式被小肠黏膜特异性吸收 或者通过与消化道 中的淋巴组织作用,增强 细胞免疫反应,间接提高宿主抵抗力。 2.5 调节基因表达 蛋白激酶Ⅱ(CK2)是一种广泛存在于真核 细胞中的一种多功能 Ser/Thr蛋白激酶,在 DNA 复制与转录过程中起重要作用。大量研究表明, Lfcin能够作为第二信使启动某一信号转导通 路,调控基因表达。Lfcin能够与CK2结合,增强 其活性,特异性磷酸化一些介导或调控因子,影 响细胞功能,如促进骨髓细胞增殖、中性淋巴细 胞激活、促进细胞分化等 J。同时,Lfcin可以 直接作为转录因子,调控基因表达,Kanyshkova 等发现牛乳铁蛋白N端一段具有抗菌性质的多 一 18一 中国饲料添加剂 2007年第7期(总第6l期) 肽能与 DNA结合,Lfcin也能与 RNA结合,干预 细胞功能 J。 2.6 其 他 Lfcin作为一种新型抗菌肽具备多种生物学 功能,除上面介绍的以外,还对肿瘤细胞有抑制 作用、可与多种抗生索协同作用、具有乳化功能 及抗氧化作用。与正常细胞相比,癌细胞成分也 有所改变,其中一些种类的癌细胞质膜上含有的 磷脂头部成分由磷脂酰丝氨酸(PS)组成,而正 常细胞仅在质膜胞液才含有 PS。PS与磷脂酰 甘油相似,带有净的负电荷,因此推测,Lfcin对 肿瘤细胞的抑制作用与其细胞膜上的PS等负电 荷成分有关。I~cin的两亲性决定其具有可促进营 养物质消化吸收的作用 ]。机体内氧自由基的过 剩被认为衰老或疾病的征兆,通常铁等金属离子可 起催化作用,加速氧自由基的产生,LF可螯合铁离 子,抑制脂质氧化作用。Lfcin虽不能与Fe¨ 结合, 但有研究表明,Lfcin同样能抑制铁离子的催化作 用,阻断脂质体氧化,减少自由基产生 ]。 3 Lfcin目前存在的问题及应用前景 Lfcin作为一种多生物学功能的新型抗菌肽 有着异于传统抗生素的抗菌机理,广泛存在于动 物多种组织及粘膜层,参与机体的非特异性体液 免疫反应,并已经作为一种免疫增强剂广泛应用 于提高人体非特异性免疫功能。近年来大量的 研究使人们对 Lfcin的结构、生物学功能及其分 子机制有了一定的认识,但还存在以下一些问题 没有定论。 1)LfcinH的空间结构、Lfcin与质膜结合后 的构向变化以及调节免疫反应、增强机体抵抗力 的分子机制等。 2)对于 Lfcin的制备,目前可由 LF水解后 离心,但此法工艺复杂,回收率低,成本高,故 cin的制备及来源问题是制约其研究和应用的关 键环节,当然这些也是 Lfcin研究的热点。 3)目前研究认为可以利用基 因工程技术 在家畜乳腺反应器或微生物 中高效表达 Lf. cin来解决,使之成为新一代肽类抗菌药的 来源。另外,与传统抗生素相比,其抗菌活 性还不够理想。专家认为可根据 Lfcin结构 与功能的关系改造 Lfein和设计新抗菌肽分 子,以满足需要 ,当然还需进一步研究 Lfcin 结构与活性的关系和作用机理,为改造和设 计提供足够的理论依据。 Lfcin广泛而独特 的生物学功 能和理化 特性预示 了其在饲料工业中应用 的独特优 势。 1)它不含稀有氨基酸和外源化学成分,是 健康安全产品。 2)在消化道中稳定,免疫原性小,水溶性 好,广谱杀菌,可耐受蛋白酶及肽酶降解。 3)具有良好的热稳定性,可耐受酸、高温高 压处理,因此在饲料加工和储存过程中仍能持续 发挥其功能,保证饲料品质,延长贮存期。 4)Lfcin具有抗真菌和抗脂质氧化的作用, 因此可用作防霉剂和抗氧化剂。 综上所述,Lfcin因其独特的生物学功能及 应用前景显示了其良好的开发潜力,在人们呼唤 自然、要求健康的呼声 日益高涨的情况下,Lfcin 将在开发新型的保健促生长剂方面显示其重要 的应用价值,期望尽快实现新一代肽类抗菌药的 产业化,这对我国畜牧业可持续发展乃至国民经 济和社会发展都具有重大意义。 参考文献 [1]Bellamy W,Takase M,Yamanchi K,et a1.Identification of the bactericidal domain of lactoferrin.Biochem et Bio- phy Acta,1992,1121:130—136. 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