模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究

模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究 刘妍妍 1，2，李良玉 3，张丽萍 1，3 （1. 黑龙江八一农垦大学 生命学院，黑龙江 大庆 163319；2. 吉林大学 生物与农业工程学院，吉林 长春 130022； 3. 黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319） 摘要：利用模拟移动床从纳豆激酶发酵液中分离纯化纳豆激酶，通过单柱试验计算出模拟移动床的分区方式及初始 参数，利用正交试验方法优化参数，最终所得纳豆激酶的纯度为90%，收率为85%，活性为（8 000±50） IU/mg。 关键词：模拟移动床；纳豆激酶；分离纯化 中图分类号：TQ925 文献标志码：A doi：10.3969/jissn.1671-9646（X）.2011.11.007 NattokinaseSeparationandPurificationbySimulatedMovingBed Chromatography LiuYanyan1,2，LiLiangyu3，ZhangLiping1,3 （1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing，Heilongjiang 163319, China； 2. Biological and Agricultural Engineeing College, Jilin University，Changchun，Jilin 130022，China； 3. Agri-food Processing and Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing， Heilongjiang 163319，China） Abstract： In this paper, the conditions of nattokinase separation and purification with simulated moving bed（SMB） chromatographyarestudied. Thezoningmodeand original parameters are calculated by single chromatographic column tests and the optimum parameters are optimized by orthogonal tests. The nattokinase is separated and purificated under this condition， andnattokinaseisreceivedinextractportwithpurity90%,recoveryrate85%andenzymaticactivity（8000±50） IU/mg. Keywords：simulated moving bed；nattokinase；separation and purification 纳豆激酶（NK） 是在大豆发酵过程中或在纳豆 激酶专门培养基中由纳豆枯草杆菌（Bacillus Subtilis natto） 产生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白 成小肽和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样 可直接溶解血栓[1]，还具有降低血液黏度、降血脂、 降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常 形态的功能[2]。 研究明，纳豆激酶是一种溶栓效果十分显著， 并且能够预防和抑制血栓产生与扩增的具有潜在药 用价值的物质。近年来，国内外纳豆激酶分离纯化 的相关研究很多，主要有：层析法、磁性微球分离 法、集成化分离技术，包括双水相亲和分配技术、 扩张床吸附技术、混合模式扩张床吸附技术等。以 上分离方法虽然工艺简单，实验条件容易控制，在 纳豆激酶分离纯化中得到了广泛应用，但至今都停 留在实验室研究阶段，而且总产率较低，多为间歇 操作，生产效率难以提高，从而造成纳豆激酶分离 纯化的成本很高，难以实现工业化生产[3]。因此，如 何找到一种适合于工业化生产的工艺及配套设备也 就成为了一个难题。 模拟移动床色谱分离技术是一种高效、先进的 分离纯化技术，属于工业高新技术。目前，在“精 细分离”领域有广泛的应用市场，在国外已遍及石 油化工、食品、精细化工、生物发酵和医药等领域 应用。因此，本试验利用模拟移动床技术分离纯化 纳豆激酶，制备出高纯度的纳豆激酶，并为其产业 化提供技术支持。 1 材料与方法 1.1试验材料 纳豆激酶发酵液，自制；树脂，陶氏、三菱等 公司提供。 收稿日期：2010-05-25 基金项目：黑龙江省农垦总局科技项目（HNKXIV-06-05a）。 作者简介：刘妍妍（1979- ），女，黑龙江人，在读博士，研究方向：农畜产品加工。E-mail：spxylyy@126.com。 文章编号：1671-9646（2011） 11-0029-04 第11期（总第262期） 农产品加工·学刊 No.11 2011年11月 Academic Periodical of Farm Products Processing Nov. 农产品加工·学刊 2011年第11期 1.2 试验设备 Φ16×500 mm型不锈钢柱、XZ12—1.2L型模拟 移动床，大庆宏源分离技术研究所提供；T6型紫外 可见分光光度计，新世纪北京普析通用仪器有限责 任公司提供；台式离心机，北京京立离心机有限公 司提供。 1.3 检测方法 1.3.1 纳豆激酶活性的测定 采用纤维蛋白平板法。依照Astrup等人[4]报道的 纤维蛋白平板法，测定方法如下：将琼脂糖、血纤 维蛋白原（Fibrinogen） 溶液和凝血酶溶液按一定比 例混合，制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品点样 于平板上，37℃恒温孵育，测溶解圈直径，并以尿 激酶作品对照绘制标准曲线，以测得纤维蛋白 溶解圈面积来表示纳豆激酶的活性。 1.3.2 纳豆激酶含量的测定 采用考马斯亮蓝法 （Braford）[5-6]。方法如下： 取一定量的纳豆激酶样品，用0.15 mol/L NaCl配成 100 mL 样品溶液。取 4 支试管，其中一支加入 0.15mol/L的NaCl溶液1mL（空白对照），另3支中加 入样品1mL，然后每支试管加入5mL考马斯亮蓝试 剂，立即混匀。1h内以1号管为空白对照，在波长 595nm处比色，并通过标准曲线确定纳豆激酶含量。 1.4 试验方法 模拟移动床的色谱分离系统常可分为 4 个区， 每区都有各自特有的流速。在相对于全程分离系统 中，一旦达到稳定的浓度曲线，它将会在再循环流 的助动下缓慢流过系统。在系统分离中保持浓度稳定 是通过移动料液入口和解吸剂注入进口位置以及产品 和副产品的出口位置来实现的[7]。进出料位置的变换 是关键技术，其由多孔旋转阀或自控阀来实现。 模拟移动床工作原理见图1。 模拟移动床技术的过程设计主要是为了减少试 验次数，利用数学模型的方法可以来获得其最佳操 作参数。采用相应的TMB模型，TMB模型则假设了 柱内两相的真正逆流，由于忽略了循环口的切换， 因而可以得到一个连续逆流吸附过程的平衡方程， 大大简化了模型，模型较为简单求解方便。研究认 为SMB和TMB两个模型之间只有很小的差别，而且 两者模拟预测的产品纯度及收率也极为接近。因此， 利用TMB模型就可以有效地进行SMB运行过程的研 究。本文主要采用了基于TMB的优化策略，来实现 SMB运行参数的设计。 1.4.1 纳豆激酶粗酶液的制备 将经过深层液体发酵第 2 天产生的发酵液在 4 000 r/min下离心20 min，得到上清液，再将得到 的上清液进行抽滤，可得到滤液。抽滤的目的是防 止杂质堵塞滤膜。 1.4.2 进样量对纳豆激酶分离的影响 取处理好的树脂装制备柱，温度为35℃，洗脱 流速为 1.5 mL/min，进样量分别为 5，10，15，20， 25 mL，以分离度为指标，研究进样量对纳豆激酶分 离的影响。 1.4.3 洗脱流速对纳豆激酶分离的影响 取处理好的树脂装制备柱，温度为35℃，进样量 20mL，洗脱流速分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL/min， 以分离度 R为指标，研究洗脱流速对纳豆激酶分离 的影响。 2 结果与分析 2.1 单柱试验结果与分析 2.1.1 进样量对纳豆激酶分离影响的研究结果 进样量对纳豆激酶分离影响见图2。 由图2可知，随着进料量的增大，纳豆激酶分 离度逐渐减小。由于进料量的增加，柱吸附纳豆激 酶效果差、吸附能力下降，导致分离度降低。因此， 在保证分离度较高的情况下，兼顾生产效率，确定 20 mL为最佳进料量。 2.1.2 洗脱流速对纳豆激酶分离影响的研究结果 洗脱流速对纳豆激酶分离影响见图3。 由图 3 可以看出，随着洗脱流速的不断增大， 分离度呈下降趋势。在低洗脱流速下，吸附剂对纳 豆激酶的吸附充分，分离效果好；洗脱流速快，使 组分在柱中的停留时间短，溶液中的离子来不及扩 散到树脂内部，分离时间短，分离效果差。综合考 虑，选择洗脱流速为1.5 mL/min。 2.2 模拟移动床分离纳豆激酶各区分配方式的确定 根据SMB与TMB间的等效性和转换关系，考虑 图1 模拟移动床工作原理 图2 进样量对分离度R的影响 30· · 2011年第11期 树脂对纳豆激酶吸附特性，水洗的流速和水洗的效 果，以及树脂柱和设备的实际操作性能，确定模拟 移动床色谱分离区各区的分配方式。 模拟移动床分离纳豆激酶各区分配方式见表1。 表1 模拟移动床分离纳豆激酶各区分配方式 2.3 模拟移动床分离纳豆激酶各区分配方式的确定 根据单柱动态试验结果和TMB模型的物料平衡 方程推算所得初始工艺参数。 纳豆激酶SMB初始工艺参数见表2。 表2 纳豆激酶SMB初始工艺参数 2.4 模拟移动床分离纳豆激酶的正交试验 根据推算的初始工艺参数，以纳豆激酶活性为 指标进行正交试验对模拟移动床分离纳豆激酶的工 艺参数进行优化。 正交试验因素与水平设计见表3，正交试验结果 与分析见表4。 根据表3中极差值的大小，进行因素影响程度 的比较，结果表明，3 因素对试验的影响顺序为： C＞B＞A。方差分析见表5。 通过方差分析可以看出，C 因素影响极显著 （p<0.01），B因素影响显著（p<0.05），而A因素影响 不显著（p>0.05）。再对 C，B因素进行多重比较分 析，根据优化结果及实际情况，最后优化的模拟移动 床分离纳豆激酶的工艺参数为：进料速度6 mL/min， 洗脱速度10 mL/min，循环速度21 mL/min。 2.5 验证试验 以上述分区方式和初始工艺参数进行验证试验， 试验首先进行模拟移动床的平衡，然后以24 h为1个 周期，连续试验7个周期，结果SMB分离纯化纳豆 激酶纯度可达90 %以上、收率为85 %以上，所得纳 豆激酶活性（8 000±50） IU/mg。 3 讨论 通过研究可以看出，模拟移动床分离纯化纳豆 激酶其产品的提取率、纯度及活性均较高，因此， 模拟移动床色谱分离技术应用于纳豆激酶的分离提 纯是一种效率较高的方法，可以进行连续化生产、 缩短时间、节约成本。本方法的实验结果可为纳豆 激酶的大规模生产提供技术支持。 图3 洗脱速度对分离度R的影响 区域代号 区域名称 分配方式 I区 II区 III区 IV区 吸附区 精馏区 解吸区 缓冲区 4根制备柱（串联） 3根制备柱（串联） 3根制备柱（串联） 2根制备柱（串联） 工艺名称 工艺参数 进料速度 洗脱速度 循环速度 切换时间 5.0mL/min 10.0mL/min 21.0mL/min 620s 表4 L9（33） 正交试验结果与分析 表3 正交试验因素与水平设计 水平 A 进料速度 /mL·min-1 B洗脱速度 /mL·min-1 C循环速度 /mL·min-1 1 2 3 1（4.0） 2（5.0） 3（6.0） 1（8.0） 2（10.0） 3（12.0） 1（20.0） 2（21.0） 3（22.0） 试验号 A B C D空列 活性 /IU·mg-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 3 1 5301 7894 6153 8049 7396 5547 6672 5318 7042 K1 K2 K3 6449.33 6997.33 6577.33 6674.00 7102.66 6247.33 5622.00 7661.66 6740.33 6579.66 6704.33 6740.00 R 548.000 855.33 2039.66 160.333 表5 方差分析 变异 来源 平方和 自由 度 均方 F值 Fα值 A B C D 493088.000 1097394.667 6259764.667 42520.667 2 2 2 246544.000 548697.334 3129882.334 21260.334 11.597 25.809* 147.217** F0.05(2，2)= 19.00 F0.01(2，2)= 99.00 (下转第35页) 刘妍妍，等：模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究 31· · 2011年第11期 图5 叶黄素标准曲线 工作液。再用工作液分别配制成0.5，1.0，1.5，2.0， 2.5 mg/L 的标准液。在 445 nm 分别测其A 值，以 A值—质量浓度做图，叶黄素标准曲线见图5。 回归方程： Y=0.806 8X - 0.022，R2=0.999 6。 3 结论 以“肇东”紫花苜蓿为实验材料，采取有机溶剂 蒸馏萃取法从苜蓿草粉中分别提取叶绿素和叶黄素。 通过选择合适的萃取剂，以单因素试验分别考察了萃 取剂及其配比、萃取温度、料液比等因素对叶绿素、 叶黄素提取率的影响。通过正交实验，确定了苜蓿叶 黄素与苜蓿叶绿素提取的最佳工艺条件。结果如下： 选择乙醇与丙酮混合液作为苜蓿叶黄素的萃取剂。通 过正交试验，确定了苜蓿叶黄素提取的最佳工艺参数 为：无水乙醇与丙酮的体积比为 2∶1，料液比为 1.4∶50，温度为60℃。在该条件下苜蓿叶黄素的 A 值为1.687，通过制作叶黄素标准曲线，计算出苜蓿 叶黄素的含量为1.339 mg/L。和同类研究相比，苜蓿 叶黄素的提取率有了很大程度的提高。本文对苜蓿叶 黄素的提取进行了初步研究，相关报道表明苜蓿叶蛋 白中富含叶黄素，将对此进行深入的研究。 参考文献： Toniolo P. 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