IL_9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平

第 20卷第 4期 2010年 7月 � 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) Journa l o f Jiangsu Un ive rsity( M ed icine Ed ition) � Vo.l 20 No. 4 July 2010 � � � � � � IL �9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平 吉均祥 1, 钱 � 炜1, 邹 � 晨 1, 马永明1, 林志强 1, 陈建国1, 杨先知 2, 王胜军2 ( 1.江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科, 江苏镇江 212002; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学系, 江苏 镇江 212013 ) [摘 � 要 ] � 目的: 检测变应性鼻炎患者 IL�9的表达水平,探讨 IL�9在变应性鼻炎发生发展中的意义。方法: 收集 49 例变应性鼻炎患者的外周血标本,其中未治疗组 30例, 临床缓解组 19例, 另取 30例健康志愿者的外周血标本作为正 常对照组。采用实时荧光定量 PCR ( QRT�PCR )检测 IL�9基因在外周血中的表达水平, 酶联免疫吸附试验 ( EL ISA )检 测血浆 IL�9含量。结果: 变应性鼻炎未治疗组外周血单个核细胞中 IL�9 mRNA表达水平及血浆 IL�9含量明显高于 变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组 (P < 0. 05), 而变应性鼻炎临床缓解组与正常对照组比较差异无统计学意义。 变应性鼻炎未治疗组 IL�9 mRNA表达水平与临床评分呈正相关。结论: 变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中 IL�9 呈高表达。 IL�9可能参与了变应性鼻炎的病理过程, 具体机制有待进一步探讨。 [关键词 ] � 变应性鼻炎; 白细胞介素�9; 实时荧光定量 PCR [中图分类号 ] � R765. 21� � [文献标志码 ] � A� � [文章编号 ] � 1671- 7783( 2010) 04- 0277- 05 � � [基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( 30871193, 30972748) ;江苏省卫生厅面上项目 ( BS2007041, 200952) ;江苏省教育厅自然科学基 金资助项目 ( 08K JB320002 );镇江市社会发展项目 ( SH 2008042) [作者简介 ] 吉均祥 ( 1973� ) ,男,江苏镇江人,硕士研究生;王胜军 (通讯作者 ) ,教授,博士生导师, E�m a i:l s jw js@j u js. edu. cn Expression of IL�9 in peripheral blood mononuclear cell w ith allergic rhin itis patients JI Jun�x iang1, QI AN W ei1, ZOU Chen1, MA Yong�ming1, LIN Zhi�qiang1, CH EN J ian�guo1, YANG X ian�zhi2, WANG Sheng �jun2 ( 1. Departm en t ofOtolaryngology, th eA ff iliated Peop les'H osp ita lof JiangsuUn ivers ity, Zhen jiang J iangsu 212002; 2. Departm ent of Imm unol� ogy, Schoo l ofM ed ical Science and Laboratory M ed icin e, Jiangsu Un iversity, Zhen jiang J iangsu 212013, Ch ina) [Abstract] � Objective: To establish a m ethod o f real�t ime fluorescence quantitative PCR for detecting IL�9 mRNA in human peripheral b loodmononuc lear cell ( PBMC ), and investigate the re lationsh ip betw een the expression o f IL�9 and allergic rhin it is ( AR) . Methods: ThemRNA levels of IL�9 in PBMC were de� term ined by quant itat ive rea l�tim e PCR ( QRT�PCR) , and detected the concentrations o f IL�9 in plasma by enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) in 49 patients, inc lud ing 30 untreated AR patients and 19 patients in recovering phase, and 30 hea lthy contro l vo lunteers. Results: IL�9mRNA expression and IL�9 concentrations in the g roup of 30AR pa tients w ithou t treatm entw eremarkedly higher than that in the groups of 19AR pat ients in clin ica l rem ission and 30 hea lthy controls (P < 0. 05). but there w ere no significan t differences betw een the groups of AR in c lin ical rem ission and norm al contro l (P > 0. 05) . Furthermore, the result of th is study show s a positive ly correlated betw een IL�9mRNA and c lin ical count in un treated AR patients. Conclusion: These resu lts indicated that IL�9 w as higher in AR patients w ithout treatmen,t and suggesting tha t IL�9m ight be involved in the patho log ica l process o fAR. The ro le of IL�9 in process of AR rema ins further investigation. [Keywords] � a llerg ic rh initis; IL�9; real�tim e quant itat ive PCR � � 变应性鼻炎 ( allerg ic rh initis, AR ) 又称过敏性 鼻炎, 是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一,其发病率 有逐渐增高的趋势 [ 1]。 IL�9可通过抑制嗜酸性粒细 胞的凋亡和促进 IL�5介导的嗜酸性粒细胞前体的 成熟来增加组织中的嗜酸性粒细胞 [ 2- 5] ; 另外, IL�9 能增加肥大细胞表面 IgE高亲和受体 �( Fc�R I�) 的表达和产生炎症介质的量, 使得肥大细胞对变应 原做出反应 [ 5] ;并可刺激上皮细胞而导致嗜酸性粒 细胞和 T淋巴细胞的浸润, 诱导上皮细胞表达产生 粘蛋白 [ 3- 6] ;同时, IL�9还可通过作用于平滑肌细胞 来招募嗜酸性粒细胞,进而促进 IL�8的释放来招募 更多的中性粒细胞, 从而在炎症的发生发展中起到 重要作用 [ 7- 9]。本研究通过检测变应性鼻炎患者外 周血单个核细胞 ( peripheral b lood mononuclear cel,l PBMC)中 IL �9 mRNA的相对表达水平和外周血中 IL�9蛋白的表达水平, 以探讨其在变应性鼻炎中的 表达变化及与变应性鼻炎发生、发展的相关性。 1� 材料与方法 1. 1� 材 � 料 1. 1. 1� 临床资料及标本 � AR患者未治疗组为按 照中华医学会耳鼻喉科学分会 2004年兰州会议变 应性鼻炎诊断 [ 10] , 2008年 12月至 2009年 9月 在江苏大学附属人民医院就诊的 30例患者 (男 14 例,女 16例,年龄 13~ 49岁,平均 29岁 ) , 均有 AR 典型症状,经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等 20种常见阳 性变应原血清特异性 IgE检测, 至少一种为阳性;临 床缓解组为 AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷 剂雷诺考特、辅舒良、内舒拿等药物治疗后 (每日 2 次,每次 1~ 2喷 )临床症状缓解 1个月后复诊,并经 疗效评分标准显示为有效或显效的 19例患者 (男 9 例,女 10例, 年龄 14~ 39岁,平均年龄 24岁 )。另 选 30例健康志愿者作为正常对照组 (男 14例, 女 16例, 年龄 18~ 42岁, 平均年龄 27岁 ), 均无 AR 病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史,吸入 组变应原血清特异性 IgE过筛试验检测阴性。根据 AR症状和体征评分方法筛选 AR临床缓解组患者。 疗效判定标准: (治疗前总分 -治疗后总分 ) / 治疗前总分 100% , ! 66%为显效, 65% ~ 26%为 有效, ∀ 25%为无效。 AR未治疗组的 30例患者经治疗后,其中 20例为 显效, 5例为有效, 5例为无效, 25例有效或显效患者停 药 1个月后有 3例重新出现部分症状且评分低于显效 标准。我们去除无效及症状复发的,取 19例显效和有 效且停药 1个月症状未复发的为临床缓解组。 1. 1. 2� 主要试剂 � 人淋巴细胞分离液 (天津灏洋 生物制剂公司 ) , T rizol ( Inv itrogen公司 ), 逆转录试 剂盒 ( TOYOBO 公司 ) , SYBR Prem ix Ex Taq、 PMD18T�A克隆试剂盒 ( TaKaR a公司 ), 人 IL�9 ELISA试剂盒 ( eB iosience公司 )。 1. 2� 方 � 法 1. 2. 1� 引物设计及合成 � 根据基因库中目的基因 序列,用 Prem ier 5. 0软件设计目的基因检测引物, 由上海生物工程技术公司合成,序列见表 1。 表 1� QRT�PCR检测引物序列及扩增范围 Tab 1� Dection prem ier sequence and am plif ied range 引物名称 引物序列 扩增范围 IL�9 5#�CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC�3∃ 5#�TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG�3# 125 bp �肌动 蛋白 5#�GGGACTATCCACCTGCAAGA�3# 5#�CCTCCTTGGCGTAGTAGTCG�3# 265 bp 1. 2. 2� PBMC的分离 � 用肝素抗凝管收集健康志 愿者、AR患者外周血 2 m ,l PBS以 1 %1稀释,混匀, 沿管壁轻缓移入放有等体积 F ico ll�泛影葡胺 (人淋 巴细胞分离液 )离心管, 1 500 r/m in, 15m in, 离心半 径 10 cm, 吸取分层液的云雾层, PBS洗涤, RPM I� 1640完全培养基 ( 10%小牛血清、100U /m l青霉素、 100 U /m l链霉素 )重悬, 计数, 以 1 106个细胞 /m l 加 1m lTrizo,l置 - 70 & 冰箱冻存。 1. 2. 3� 构建目的基因质粒标准品 � 以上述制备的 cDNA为模板, 选取下列最佳的特异性扩增条件: ∋ 反应体系: 10 PCR缓冲液 2 ! ,l dNTP 1. 6 ! ,l上下 游引物各 0. 3 ! l( 10 pmo l/L ) , cDNA模板 1. 0 ! ,l Taq DNA聚合酶 ( 5 U /!l) 0. 2 ! ,l M gC l2 ( 25 mmo l/ L ) 0. 8 ! ,l ddH2O 13. 3 !l。 ( 反应条件: 变性, 94 & 30 s; 退火, IL�9 58 & ( �肌动蛋白 56 & ) 30 s;延伸, 72 & 30 s, 35个循环。将目的基因 PCR 扩增产物 T�A克隆,转化 DH5�感受态,挑取阳性克 隆质粒,并送上海生物工程公司测序鉴定。所选阳 性质粒倍比稀释至 108 ~ 104拷贝数 /! ,l备用。 1. 2. 4� Ro tor�G ene 6000荧光定量 PCR仪检测目的 基因表达 � 采用绝对定量法检测目的基因 mRNA 的表达水平, SYBR Green )法检测荧光。所有样本 的检测值都用 �肌动蛋白进行校准。 1. 2. 5� 统计学处理 � 所有数据应用 SPSS17. 0统计 软件中 K ruska l�Wallis H检验, 3组数据进行两两比 278 � � � � � � � � � � � � 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) � � � � � � � � � � � � � � � � � 第 20卷 较利用 N emeny i法检验, 采用 Spearman秩相关分 析,以 P< 0. 05为差异有统计学意义。 2� 结 � 果 2. 1� IL �9和 �肌动蛋白基因 PCR扩增产物 以 AR患者外周血 cDNA为模板, PCR扩增 IL� 9和 �肌动蛋白基因, 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结 果见图 1。 1: DL2000标准参照物; 2: IL�9; 3: �肌动蛋白 图 1� AR患者外周血 IL�9和 �肌动蛋白 PCR扩增产物鉴定 F ig 1� Iden tif ication of amp lif ication of IL�9 and �actin by PCR in patients w ith AR 2. 2� 实时荧光定量 �PCR法建立 �肌动蛋白和 IL�9 标准曲线 以 �肌动蛋白各梯度浓度标准质粒为模板, 定量 PCR扩增 �肌动蛋白,重复 3次。图 2a为熔 解曲线, 未见杂峰, 表明扩增特异性较好; 图 2b为 QRT�PCR扩增动力学曲线, 呈典型的 S形, 平台期 汇于一条直线上, 指数区明显, 斜率大且固定 (平 行线 ) ;图 2c为定量结果, 显示标准品浓度梯度对 应的扩增后的拷贝数; 图 2d中标准曲线的斜率为 3. 371; 截距为 40. 703; 相关系数为为 0. 99; 扩增 效率 0. 98。以不同浓度梯度 IL�9标准质粒为模 板, QRT�PCR扩增 IL�9, 重复 3次。图 3a为熔解 曲线, 峰尖在同一中轴上, 表明扩增特异性较好; 图 3b为 QRT�PCR扩增动力学曲线, 平台期集中同 一直线上,指数区明显, 斜率固定; 图 3c为定量结 果,显示与标准品浓度梯度相对应的扩增后的拷 贝数; 图 3d中标准曲线的斜率为 3. 513; 截距为 34. 214;相关系数为 0. 999; 扩增效率为 0. 93。 图 2� �肌动蛋白标准品实时荧光定量 PCR扩增效果 F ig 2� Expre ssion of �actin standard sam ple by rea l tim e quan titative�PCR 279第 4期 吉均祥, 等. IL�9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平 图 3� IL�9标准品实时荧光定量 PCR扩增效果 F ig 3� Expre ssion of IL�9 standard sam ple by real tim e quan titative�PCR 2. 3� AR患者未治疗组、AR临床缓解组与健康对 照组 IL �9 mRNA表达比较 实时荧光定量 PCR方法检测 3组 IL �9 mRNA 相对表达。结果显示, AR未治疗组、AR临床缓解 组和正常对照组之间 IL �9 mRNA相对表达水平比 较差异有统计学意义 (P < 0. 05)。其中, AR未治疗 组 IL�9 mRNA的相对表达水平明显高于临床缓解 组和正常对照组 ( P < 0. 01) ; 而临床缓解组 IL �9 mRNA的相对表达水平与正常对照组比较差异无统 计学意义 (P > 0. 05)。见图 4。 图 4� IL�9mRNA在 AR未治疗组,缓解组和 健康对照组的表达水平 F ig 4� Expression of IL�9mRNA in AR untreated, clin ica l rem ission and healthy control 2. 4� AR患者 IL �9mRNA相对表达水平与症状、体 征记分相关性 结果表明, AR患者未治疗组 IL �9 mRNA相对 表达水平与症状、体征记分呈正相关 ( n = 30, r = 0. 602, P < 0. 001)。见图 5。 图 5� AR患者 IL�9mRNA相对表达水平与症状、 体征记分相关性 Fig 5� Correlation betw een IL�9mRNA and c lin ical count 2. 5� AR患者血浆 IL�9表达水平 30例 AR未治疗患者、19例 AR临床缓解者和 30例健康志愿者的血浆严格按 IL�9 ELISA试剂盒 操作说明检测,采用非参数秩和检验统计分析,结果 以箱图表示 (图 6) , AR未治疗患者血浆 IL�9的含 量高于 AR临床缓解者和健康志愿者 (P < 0. 05 ), AR临床缓解者和健康志愿者之间比较差异无统计 学意义 (P > 0. 05)。 3� 讨 � 论 在哮喘病患者体内, IL�9作用于炎症细胞和组 织细胞,使淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞的量 增多,提高了 IgE的分泌量,增强了肥大细胞对变应 原的反应,诱导黏蛋白的表达,并促进炎症细胞分泌 280 � � � � � � � � � � � � 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) � � � � � � � � � � � � � � � � � 第 20卷 图 6� IL�9在 AR未治疗组, 缓解组和健康 对照组的表达水平 F ig 6� Expression of IL�9 in AR untrea ted, c lin ical rem ission and healthy con trol 一些细胞因子参与炎症反应。随着研究的进一步发 展,还认为 IL�9在气道高反应性和哮喘表型中起了 重要的作用 [ 11, 12 ]。 本研究检测了 AR患者外周血单个核细胞中 IL�9的 mRNA和蛋白表达水平, 结果发现 AR患者 未治疗组 IL�9的表达水平高于 AR患者临床缓解组 和健康对照组,而 AR患者缓解组与健康对照组 IL� 9的表达水平无显著性差异, 提示 AR患者体内存 在着 IL�9的高表达, 进一步研究表明 IL�9的表达水 平与疾病的临床评分呈正相关。提示了 IL�9在 AR 的发生发展中可能起着重要的作用。 N ico laides等 [ 12]的体外试验已经证实 IL�9的产 生与 Th9的数量密切相关, 而 IL�9又可促进 Th9细 胞分泌 IL�9,并具有维持 Th9表型的功能,因而,有 可能在变应性疾病免疫内环境 IL�9促进了 Th9细 胞的分化,而 Th9的增多使得 IL�9的分泌又增多, 从而形成一条正反馈的效应。这一机制的存在还有 待于进一步探讨。 [参考文献 ] [ 1 ] � Skoner DP. 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