神奇的干细胞

干细胞 干细胞（stem cell）具有卓越的潜能，可以发育成为身体不同类型的细胞。作为身体的一种修复系统，理论上只要人和动物依然存活，它们就可以不受限制的分化并补充其他细胞。当干细胞分化时，有的成为另一个与本身完全相同的细胞，有的则发育成为具有特定功能的体细胞，例如肌细胞，红血球细胞或者脑细胞。 Ⅰ 干细胞专题－干细胞简介 干细胞研究是一项前沿研究。它探讨细胞如何发育成为有机体以及健康细胞如何替换体内受损细胞的相关机制。此外，它们属于前景开阔的再生医学领域，有助于科学家评估细胞疗法在治疗疾病方面的可行性。干细胞是当今生物界最有吸引力的研究对象，不过正如学术界其他领域一样，干细胞从被发现起就引发了众多科学问题。为了让读者更好的了解干细胞，美国国立卫生研究院(NIH)对以下问题作出了详细的答复，这些问题包括：什么是干细胞，为何它们如此重要？干细胞有哪些类型及其出自何处？干细胞对新型医学疗法的潜在作用？要想令干细胞具备治疗能力，需要进行哪些相关研究？ 什么是干细胞，为什么它们如此重要？ 与其它细胞相比，干细胞具有两个重要的特性：首先，干细胞是一群尚未分化完全的细胞，能够在长期的细胞分裂中不断自我更新。其次，在一定生理学条件或实验条件下，干细胞能被诱导成具有特定功能的细胞，例如心肌搏动细胞或胰腺中分泌胰岛素的细胞。 目前科学家重点研究来自动物和人类的两种干细胞：胚胎干细胞以及成体干细胞。它们具有不同的功能和特性。其实早在20多年前，科学家就发现可以从老鼠胚胎中获得或诱导干细胞的方法。经过对老鼠干细胞进行多年的生物学研究，科学家在1998年成功掌握如何从人类胚胎中分离干细胞以及如何在实验室中培养干细胞的方法。而实验中所使用的胚胎均通过体外受精过程获得，任务完成并征得捐赠者同意后，这些胚胎就会被捐赠用作其他研究。 干细胞在活体中起着非常重要的作用。一个3至5天大小的胚胎称为胚泡（blastocyst)，该组织中的干细胞可以产生多种特定类型的细胞，从而构成心脏，肺部，皮肤以及其他组织。在很多成体组织中，例如骨髓，肌肉以及脑部，存在成体干细胞，它们能形成新的细胞从而补充由于正常损耗、受伤或疾病所损失细胞。 科学家一直希望干细胞终有一天能成功治疗疾病，例如帕金森症（Parkinson's disease，PD), 糖尿病以及心脏疾病等。 科学家希望通过在实验室中研究干细胞从而了解它们的特性并掌握它们与其他分化完全的细胞之间的区别。随着了解的不断深入，以后干细胞将不仅可应用于细胞疗法，还可应用于新药物筛选，毒素以及出生缺陷等。不过，人类胚胎干细胞的研究还只是处于起始阶段，因此，为了发展相关疗法，科学家正致力探讨干细胞的主要特性，包括： 1. 鉴定干细胞为何能长期保持未分化状态以及自我更新状态； 2. 探索令干细胞成为分化细胞的信号途径。 干细胞治疗帕金森症的前景 帕金森症是一种很常见的神经退化性疾病，65岁以上老人的发病率超过2%。PD通常由进行性退变和产生多巴胺（DA）的神经元的损伤引起，会导致颤抖，僵硬以及运动功能减退。人们认为PD会是第一个可通过干细胞移植而治愈的疾病。而目前，有几个实验室已成功令胚胎干细胞分化成具备DA神经元功能的细胞，可以用来替换由于疾病而失活的相关细胞。 而最近研究中，科学家通过导入Nurr1基因，令老鼠胚胎干细胞分化成DA神经元。当把Nurr1移植入一只患有PD的老鼠模型的脑部时，这些干细胞分化成DA神经元释放多巴胺，促进运动功能，来修复帕金森症病鼠的脑部。至于人类干细胞疗法，科学家也制定了一系列的策略，在实验室中通过对帕金森症病人进行移植手术，从而令人类干细胞产生多巴胺神经元。这种能获得大量多巴胺神经元的方法终有一天能用于治疗帕金森症病患。 Ⅱ干细胞的特性 干细胞与其它机体细胞不同。无论任何来源，它们都具有三种基本特性：处于未分化的状态；可以长期自我分化和自我更新；可以产生特定类型的细胞。科学家一直致力了解与干细胞长期自我更新能力相关的两个特性： 1. 为什么实验中胚胎干细胞能在未经分化的情况下增殖一年甚至更长时间，但大部分成体干细胞却不行呢？ 2. 究竟由什么因素调控活体干细胞的增殖和自我更新呢？ 明确这些问题有助于更好地了解在正常胚胎发育过程中或者癌症细胞的不正常分化过程中干细胞是如何被调控增殖的。更重要的是，在研究中所获得的相关信息有助于科学家在实验中更高效地繁殖胚胎和成体干细胞。 干细胞是未分化的、无特定功能的细胞。其基本性质之一是它没有任何组织特异结构，而特异结构正是产生特殊功能的基础。例如，干细胞无法像心肌细胞那样具有泵血功能；也不能像血红细胞那样能在血液里运输氧气；更不能像神经细胞那样发出电化学信号从而指引身体运动或使人开口说话。不过，干细胞却具有产生专能细胞的潜能，能发育成为包括心肌细胞、血细胞及神经细胞在内的多种细胞。 干细胞可以长期自我分化和自我更新。与肌细胞、血红细胞或神经细胞不同，干细胞能进行多次自我复制。人们把这种多次的自我复制称为增殖。一定量的干细胞在实验室中经过数月增殖可以达到几百万个。如果这些增殖而成的干细胞能继续像亲本干细胞那样保持非专能性，那么它们就能长期进行自我更新。 科学家一直对干细胞保持非专能性的因素和条件产生浓厚的兴趣。多年来，科学家一直致力在实验室中培育干细胞而同时不让它们分化成特异性细胞。例如，成功培育出小鼠干细胞后，科学家们又花了20年的时间来研究如何在实验内培育人体干细胞。因此，如何令干细胞在修复特定组织前按照特定的研究目的不断增殖并一直保持多能性，成为了人们现在研究的关键。若能掌握相关信息将大大有助于科学家们在实验室中成功培育大量的多能性干细胞。 干细胞可以产生专能细胞。人们把有非专能细胞产生专能细胞的过程叫做分化。科学家目前开始着手研究细胞内外诱导干细胞分化的信号。细胞内信号由细胞基因所控制，这些基因分布在长片段DNA上，并且携带着整个细胞结构和功能的编码指令。其它细胞分泌的化学物质、周边细胞的相互接触以及在微环境中的某些特定分子都可以作为外部信号促使细胞分化。 然而，很多有关干细胞分化的问题还有待进一步探讨。比如说，促使所有干细胞分化的细胞内外信号都是一样的吗？能否通过实验鉴定从而证明某一系列的信号可以促进干细胞的分化呢？弄清楚这些问题具有非常重要的意义，因为这样将有助科学家们找到新的方法从而控制实验室中干细胞的分化，也因此可以培育出更多具有细胞疗法功能的细胞和组织。 成体干细胞可以分化成它们所在组织的各种类型细胞。例如，骨髓中的造血成体干细胞就可以分化成多种血细胞如红血球、白细胞和血小板。直到现在，人们还认为骨髓中的造血干细胞（hematopoietic stem cell）不能产生不同组织的细胞，例如脑神经细胞。然而，近几年的大量实验明，一种组织中的干细胞能诱导产生出另一种完全不同组织中的细胞，这种现象通常称为可塑性（plasticity）。可塑性的例子很多，包括血细胞可变成神经细胞，肝脏细胞经改造可以产生胰岛素以及造血干细胞可以发育成心肌细胞。因此，进一步了解将成体干细胞应用于细胞疗法的可行性已成为最活跃的研究领域之一。 Ⅲ 胚胎干细胞 A. 早期胚胎发育的哪个时期对胚胎干细胞的产生最重要的呢？ 顾名思义，胚胎干细胞来源于胚胎。具体而言，胚胎干细胞来自体外受精的受精卵发育而成的胚胎，在捐赠者知情同意下，捐献给相关机构以供研究之用。需要特别指出的是，这里所说的胚胎绝不是由女性子宫内所孕育的受精卵发育而来。胚胎干细胞通常来源于4至5天大小的胚胎，这个时期的胚胎是一个中空的细胞团，称作胚泡。胚泡由三层结构组成：滋养层（trophoblast），即包绕胚泡的一层细胞；囊胚腔（blastcocoel），即胚泡内的空腔；以及内层细胞团（inner cell mass），由大约30个细胞组成，位于囊胚腔的一端。 B. 如何在实验室内培养胚胎干细胞？ 在实验室内对胚胎干细胞进行体外培养属于细胞培养技术之一。首先将人胚胎干细胞从活体胚胎上分离出来，也就是将胚泡内层细胞团转移至塑料实验室用培养皿中，培养皿内为营养肉汤成分的培养基。然后把转移至培养皿的细胞在培养皿表面分离涂布开来。培养皿内表面涂有一层小鼠胚胎皮肤细胞（小鼠成纤维细胞），该细胞已经经过处理，因而不会进行分裂増殖。该细胞层称作饲养细胞层，其作用是为转移至培养皿的内层细胞团提供一个可以贴附的表面；同时，饲养细胞层还会向培养基中释放营养物质，促进培养细胞的生长。最近，科学家们开始致力于开发一种新的不依赖小鼠成纤维细胞的胚胎干细胞培养方法，如果能够成功，将是科学研究领域一项重大进步，因为新的方法将避免小鼠细胞内的病毒或其它大分子进入人类细胞中的危险。 将内细胞团转移至培养皿培养数天后，细胞由于不断分裂増殖而逐渐布满整个培养皿。这时，需要实验人员将这些细胞培养物小心轻缓地从培养皿中移出，重新接种于若干个新的培养皿中，使其保持适当的细胞接种密度（一般105个/ml左右）这一过程叫做传代培养，在细胞培养的几个月内会重复多次。每经过一次传代培养的细胞都叫作一代，值得注意的是，体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念，事实上，培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞 。经过六个月或以上的培养，最初的30个内层细胞团増殖产生了数百万计的胚胎干细胞，这些细胞在培养过程中没有发生分化，是多功能细胞并且具有正常的遗传学特征(保持二倍体核型)，被叫做胚胎干细胞系（embryonic stem cell line）。一旦细胞系建立起来，就可以冻存运输到任何需要它们的实验室，以供进一步的培养和研究之用。 C.实验室中采用哪些实验方法对胚胎干细胞进行鉴定？ 在胚胎干细胞培养过程中，研究人员会在特定的时间点对这些细胞进行相应检测，以确定它们是否具有胚胎干细胞的基本特征，这个过程称作细胞鉴定（cell characterization）。 不过，在对胚胎干细胞进行鉴定这一点上，科学家尚未形成一套鉴定的方法。同时，科学家也表示，用于鉴定的多种方法也许并不能最确切的反映细胞的生物学特征和功能。然而，培养人类胚胎干细胞系的研究人员还是需要采取各种各样的实验，这些实验包括： 1）对干细胞进行原代培养及数月的传代培养，以保证细胞能长期保持自我更新的能力。细胞培养过程中，研究人员在显微镜下对细胞进行观察，确保细胞功能正常并保持未分化状态。 2）采用特异性技术检测细胞表面标志，这些标志只会存在于未分化细胞上。另外一项十分重要的检测，是针对名为Oct-4的蛋白质所进行的，这种蛋白专门由未分化细胞所分泌产生。Oct-4是一种转录因子，负责在适当的时间启动或关闭基因，在细胞分化和胚胎发育过程中具有非常重要的作用。 3）显微镜下观察细胞染色体。该检测可用于检测细胞染色体是否被损害或染色体数目是否发生改变。但该检测手段无法检测到细胞内是否发生遗传突变。 4）确定细胞在冻溶和重新接种后是否可以传代培养。 5）通过以下实验检测人类胚胎干细胞是否具有多潜能性：a. 让细胞在培养过程自主分化；b. 对细胞生长进行控制以使其向特定细胞类型分化；c. 将细胞注射到免疫抑制小鼠体内，检测是否有良性畸胎瘤的形成。畸胎瘤是一种典型的含有多种细胞类型的肿瘤，包括处于各种分化阶段的细胞或部分分化的细胞类型；畸胎瘤的形成说明了胚胎干细胞可以向多种细胞类型分化。 C. 如何刺激胚胎干细胞进行分化？ 只要为处于培养过程中的胚胎干细胞提供相应的环境条件，即可使其维持不分化状态（无特定功能的）。而一旦细胞粘附在一起形成类胚体（embryoid bodies），便立即开始自主分化生长。这些细胞可以形成肌肉细胞，神经细胞以及许多其它类型的细胞。尽管细胞的自主分化说明了所培养的胚胎干细胞功能正常，但自主分化并不是获得特定类型细胞的有效方法。 因此，为了得到特定分化类型的细胞，如心肌细胞，血细胞，神经细胞等，科学家试图找到可以控制胚胎干细胞分化方向的手段，比如改变培养基的化学成分组成，改变培养皿表面状态，或向细胞内插入特异性基因进行细胞修饰。经过数年的试验研究，科学家已建立起若干使胚胎干细胞定向分化的基本操作方法――或者可以叫做“秘方”（如图1.所示）（想要获得更多更详细的有关胚胎干细胞定向分化的示例，请参阅《美国国立卫生研究院 （NIH）干细胞：科学进步与未来研究之方向》第5章－第9章及附录B和附录C.）。 如果科学家能够准确诱导胚胎干细胞向特定细胞类型分化，那么就有希望将这些定向分化的细胞用于某些疾病的治疗：将由人胚胎干细胞发育而来的定向分化细胞移植入相应患者体内，即可治疗诸如帕金森症、糖尿病、外伤性脊髓损伤（traumatic spinal cord injury）、浦肯野氏细胞变性（Purkinje cell degeneration）、杜兴氏肌营养不良（Duchenne's muscular dystrophy）、心脏病、失明或失聪等疾病。 图1.小鼠胚胎干细胞的定向分化（directed differentiation） Ⅳ 成体干细胞 成体干细胞是存在于发育成熟机体器官组织中的具有高度自我更新和增殖潜能的未分化细胞，可以分化成为组成该组织或器官的特定细胞类型。活体内成体干细胞的主要功能是维持其所在组织的完整性及修复受损组织。成体干细胞可用“somatic stem cell”或“adult stem cell”表示，科学家们更趋向于使用“adult stem cell”这个名称。与胚胎干细胞的名称来自于细胞的起源（由胚泡内的内层细胞团发育而来）不同的是，位于成熟组织的成体干细胞的起源尚不明了。 新近的成体干细胞研究引起科研人员广泛的兴趣与热情。科学家已经发现，成体干细胞在许多组织中都存在，分布比他们原先料想的要广泛的多。这一发现促使科学家开始探索将成体干细胞应用于移植领域的可能性。事实上，来源于骨髓组织的成体造血干细胞用于白血病等疾病的移植治疗已经有30多年的历史了。只要条件合适，有些成体干细胞似乎拥有向不同类型细胞分化的能力。如果在实验室内可以对成体干细胞的多向分化进行有效而准确的控制，那么成体干细胞便有望成为许多常见的严重疾病的治疗基础。 事实上，成体干细胞的研究始于约40年前。早在20世纪60年代，研究人员便发现骨髓组织内含有至少两种类型的干细胞，一类叫做造血干细胞，可以分化发育成体内各种类型的血细胞；数年后发现的另一类干细胞叫做骨髓间充质细胞。间质细胞是一个混和细胞群，可发育成骨骼、软骨、韧带、脂肪和纤维结缔组织。 同样是在20世纪60年代，科学家发现大鼠脑部的两个区域有分裂细胞的存在，这些分裂细胞可发育形成神经细胞。尽管如此，大部分科学家还是始终坚信，成年动物大脑是不能产生新的神经细胞的。直到20世纪90年代，科学家们才相信，成年动物脑部确实含有可以发育成大脑3类主要细胞的干细胞，这三种细胞类型是：星形细胞（astrocytes）、少突胶质细胞（oligodendrocytes）以及神经元或称做神经细胞，前两种细胞为非神经元细胞。 A.成体干细胞主要存在于哪些组织器官，其功能是什么？ 研究人员已经在多种组织和器官内发现有成体干细胞的存在。关于成体干细胞，有一点是非常重要的：在组织内只含有极少量的干细胞。研究人员认为，干细胞存在于组织的特定区域内，从而在数年内都维持静止休眠状态――也就是保持不分裂的状态，直到组织受到损伤或发生疾病时被激活，才开始分裂。已经报道的含有干细胞的成体组织包括：脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏。 许多科学家现在都致力于在实验室内对成体干细胞进行培养并操控其向特定细胞类型分化，由此为组织损伤修复及疾病治疗提供有效途径。 下面举几个例子来说明应用成体干细胞进行治疗的疾病及治疗方法：1)帕金森症的发生，是由于中脑部位"黑质"中的细胞发生病理性改变后，多巴胺的合成减少，而出现相应症状。如果应用干细胞技术使患者重新获得合成多巴胺的细胞，就可以治愈这种疾病；2) I 型糖尿病的发病机制是由于患者胰腺胰岛B细胞被损坏，从而引起胰岛素的绝对缺乏。干细胞技术可以使患者重新拥有健康的胰岛B细胞；3)干细胞技术还可用于心脏病发作后修复受损伤的心肌组织。 B.可用于成体干细胞鉴定的检测方法有哪些？ 科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一致，然而，经常被采用的鉴定方法包括： 1)利用分子标记在活体组织中对细胞进行标记，然后确定它们所产生的特定细胞类型。 2)将细胞从活体动物上分离出来，在对其进行细胞培养的过程中进行标记，之后将细胞移植入另一个动物体内，观察该细胞是否可以再生其来源组织。 3)分离细胞，进行细胞培养，并对其分化进行控制，通常采用加入生长因子或向细胞内引入新基因的方法，进而观察细胞的分化方向。 事实上，单个成体干细胞可以诱导产生一系列遗传特征相同的细胞――细胞生物学上称之为细胞克隆――之后这些细胞可以定向分化成为组成来源组织的各种类型的细胞。科学家希望能够证明，在细胞培养中，单个干细胞可以产生细胞克隆，或者单一类型的干细胞群可以在被移植入动物体内后再生相应组织。最近，通过病毒转染成体干细胞的方法，该病毒可以作为单个细胞的特异性标志，科学家证明了单个成体干细胞克隆具有在活体动物内使受损组织再生的能力。 C.成体干细胞的相关知识 如上文所述，科学家发现成体干细胞广泛存在于许多组织中，它们可以进入正常分化路径，生长发育形成相应类型的组织细胞。成体干细胞也有可能具有转分化（即具有可塑性）的能力，也就是形成构成其它组织的细胞。 成体干细胞的正常分化路径――在活体动物体内，成体干细胞可以长期分裂，形成具有特定形状、结构及功能的成熟细胞，构成相应的组织器官。下面列出了一些成体干细胞的分化方向（如图2所示）： 图2.造血干细胞及骨髓间充质干细胞(stromal stem cell)的分化 1）造血干细胞发育生成各种类型的血细胞：红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板。 2）骨髓间质细胞可形成下列类型的细胞：骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及其它结缔组织细胞（比如组成肌腱的细胞）。 3）位于脑部的神经干细胞可以形成三类重要细胞：神经元细胞及两类非神经元细胞――星形胶质细胞和少突胶质细胞。 4）位于肠隐窝深处的消化道内层的上皮干细胞可以形成下列细胞类型：吸收细胞，杯状细胞，潘氏细胞，肠内分泌细胞。 5）皮肤干细胞存在于表皮基底层及毛囊底部。表皮干细胞可以发育成为角质化细胞，之后角质化细胞移行至皮肤表面形成保护层。毛囊干细胞（则可形成毛囊及表皮。 成体干细胞的可塑性及转分化能力：一系列实验已经证实某些成体干细胞具有多向分化潜能。跨越传统的胚层概念的界限，分化为其他胚层来源的细胞的能力即所谓的细胞可塑性或称转分化能力。下文列出了近年来所报道的具有转分化能力的成体干细胞。 造血干细胞可以分化形成：三种主要脑组织细胞（神经元，少突胶质细胞，星形胶质细胞）；骨骼肌细胞；心肌细胞；肝细胞。 骨髓间充质细胞可分化形成：心肌细胞和骨骼肌细胞。 脑组织干细胞可分化形成：血细胞和骨骼肌细胞。 目前的研究热点集中在对成体干细胞可塑性的形成机制上。如果可以揭示相关机制并加以控制，就可以利用存在于健康组织的干细胞修复或再生受损组织（如图3所示）。 图3.成体干细胞的可塑性 D. 有关成体干细胞研究涉及哪些关键问题？ 尚有许多关于成体干细胞的关键问题亟待回答，如下文所述： 1成体干细胞共有多少种？它们各分布于哪些组织？ 2成体干细胞来源于机体中的什么组织？它们是否是残余的胚胎干细胞？还是起源于其它组织？处于已分化细胞包绕之中的成体干细胞如何维持未分化状态？ 3成体干细胞的可塑性是与生俱来，还是只有在研究人员对其进行人为操控时才会发生的现象？都有哪些信号传导通路参与调控成体干细胞的増殖与分化（这种増殖分化体现了细胞的可塑性）？ 4能否对成体干细胞进行操控以促进其増殖，从而为移植治疗提供足够的组织器官？ 5是否只需单一类型的干细胞的存在―也许就存在于骨髓组织或外周血内―就可以分化形成组成任何器官与组织的细胞？ 6有哪些因素促使干细胞向受损组织及位点迁移定位？ Ⅴ 胚胎干细胞与成体干细胞之间的异同点 人类胚胎干细胞和成体干细胞在未来基于细胞的再生性治疗领域各具优势与缺点。 1) 成体干细胞和胚胎干细胞在细胞分化类型和数量上有明显的区别。胚胎干细胞可以分化成为人体内各种类型的细胞，因为它具有分化全能性。而成体干细胞通常只能向某几种细胞类型分化，分化方向由其来源组织决定。然而，也有一些实验表明，成体干细胞也可能存在可塑性，可向更多类型的细胞分化。 2) 胚胎干细胞易于大量培养。胚胎干细胞能永生，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。而成体干细胞在成熟组织内的数量极为有限，在细胞培养过程中增加其数目的方法还在探索之中。这是胚胎干细胞与成体干细胞之间极为显著的不同点，而替代性治疗往往需要大量的干细胞。 3) 可以避免免疫排斥反应。使用成体干细胞的一个有利之处在于可以采用患者自己的干细胞进行培养，再重新输送回患者体内，从而避免了免疫排斥反应的发生。从这个角度看，成体干细胞在临床治疗的应用中具有巨大的优势。由于每个个体的主要组织相容性复合体（MHC）不同，同种异体胚胎干细胞及其分化组织细胞用于临床可能会引起免疫排斥，因此基于胚胎干细胞的治疗就要求对患者进行长期免疫抑制剂的治疗。成体干细胞由于是从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。然而，受者是否会对供者的胚胎干细胞产生排斥反应尚未在人体实验中得到证实。 4) 胚胎干细胞导致畸胎瘤。虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的。目前尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，当前的做法容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞不存在上述问题，例如骨髓移植实验并不引发畸胎瘤。 Ⅵ 前景和问题 人体干细胞在可以以多种方式应用于基础和临床研究。然而，干细胞预期的作用与真正实现之间仍存在许多技术上的障碍，而这些障碍只能在更深入的后续研究中才得以克服。对人类胚胎干细胞进行研究可能帮助我们了解更多人类发育过程中产生的复杂事件的信息。此项工作的首要目标是鉴定未分化的干细胞是如何分化的。 科学家们了解到基因的启动和关闭对该过程来说是最关键的。许多非常严重的医学难题，如肿瘤和先天缺陷就是归咎于异常的细胞分裂和分化。如果可以更好的理解对该过程的遗传和分子调控，则可以帮助我们了解疾病是如何发生并为治疗提供新的治疗对策。干细胞的此种用途和其他大多数的用途都存在一个显著的障碍，那就是科学家们尚未完全了解启动或关闭特殊基因来影响干细胞分化的信号。 人体干细胞同样可以用于新药实验。例如，新的药物可以在从人多潜能细胞系中分离的已分化的细胞上测试其安全性。其他种类的细胞系已经以该方式得到了应用。例如，肿瘤细胞系被用于筛选具有抗肿瘤活性的药物。但是，多潜能细胞系的有效性使得药物测试可以在更大范围的细胞类型中进行。然而，为了有效地筛选药物，当比较不同的药物时条件必须相应一致。因此，科学家们必须准确地控制干细胞分化成被测试药物所需的细胞类型。目前由于对控制细胞分化信号认识不足，所以不能够精确地模拟这些条件，并为每一个待测药物提供相应的分化细胞。 也许人体干细胞最重要的潜在用途是生产细胞和组织，并应用于细胞疗法。今天，捐赠的器官和组织常被用于取代患病的或者损伤的组织，但是组织器官移植的需求远远超过了可获得的供给。干细胞可直接分化为特定的细胞类型，这为替代细胞和组织来源的更新提供了可能，从而用于更多疾病的治疗，包括帕金森症、阿尔茨海默症、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎。 例如，健康的心肌细胞已经可以在实验室生成，然后再把这些细胞移植进入患有慢性心脏病的病人体内。在小鼠和其他动物上的初步研究证明，骨髓干细胞移植进入一个破坏的心脏组织可以发育成心肌细胞并且成功地再生心脏组织。最近其他在细胞培养体系中的研究提示，诱导胚胎细胞的分化或者将成体骨髓细胞分化成心肌细胞已成为可能（图4）。 图4用成体干细胞修复心肌 在Ⅰ型糖尿病患者中，通常分泌胰岛素的胰腺细胞的功能被患者的自身免疫系统所破坏。新的研究提示通过细胞培养诱导人胚胎干细胞分化形成产胰岛素细胞并且最终可以用于移植来治疗糖尿病。 干细胞的处理必须简单而易重复，以便科学家可以成功地将它们分化，移植进入所需的生物体内，这样才能真正实现对那些衰退性疾病的更新细胞治疗。接下来，为了成功地实现细胞治疗，科学家们必须试着严格控制一系列的步骤，才能把此疗法真正带入到临床应用中。想要更好的移植，干细胞必须可重复性制成具有以下特征： 1) 广泛地增殖并且生成足够数量的组织； 2) 分化成期望的细胞类型； 3) 移植后令接受者得以存活； 4) 移植后能够与周围组织形成融合; 5) 具有适当地延长接受者的生命的功能; 6)避免以任何方式损伤接受者； 同样，为了避免排异反应的问题，科学家们尝试各种不同的研究方案去产生那些不会被排斥的组织。 总的来说，干细胞治疗的前景是令人欣喜的，但是仍然需要多年集中的实验来攻克那些重大的技术难题。 国立卫生研究院已经展开大范围内系列的科研项目来支持胚胎干细胞系的应用研究。 VII 干细胞重编程的iPS技术 1996年，“多莉”羊克隆事件震惊全世界[1]；1998年11月，威斯康辛大学的James Thomson和约翰.霍普金斯大学的John Gearheart分别报道，用不同的方法获得了具有无限增殖和全能分化潜力的人胚胎干细胞（ES细胞）[2] 。这些消息的连续发布立刻引起了世界的关注，并引发近十年干细胞研究的热潮。2007年，继“多莉”出现后，科学家们在干细胞研究中再度取得了突破性的成就－将人类的体细胞通过重编程技术成功获得干细胞。这一成就无疑将会给移植治疗、 药物发现及筛选、 细胞及基因治疗和生物发育的基础研究等带来深远的影响，打开在体外生产所有类型的可供移植治疗的人体细胞、 组织乃至器官的大门。 1.干细胞的重编程 多年来，干细胞的研究一直是一个美丽的梦想，是一个关于“不死”和“永生”的梦想。近十年，这个梦想似乎逐步成真。早在1970年，Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞，并可以成功地在体外进行培养［3］。小鼠胚胎干细胞似乎具有发育成为某一种器官的能力。人们把“干细胞”这种超凡的分化能力称为“干性”。这些年来，许多科学家热衷于研究干细胞的“干性”。一开始，他们只是因为对“干细胞”充满好奇，期望从分子水平上解释“干性”。后来，他们开始幻想，是否可以通过分子生物学技术，给体细胞赋予“干性”。这就有了重编程技术。干细胞重编程技术是不经过胚胎而获得多能干细胞的方法，通过基因重组或者细胞融合等方法，影响染色质的表观遗传修饰，调控基因的沉默与表达，使得成体细胞逆分化获得多能胚胎干细胞，从而赋予该细胞多能性，实现细胞返老还童。目前，干细胞相关研究热点众多，基因重组的重编程技术成为当中热点中的热点。体细胞重编程为多能干细胞的方法主要有三种：多能干细胞与体细胞融合；通过特定基因的表达将体细胞重编程逆转为干细胞；多能细胞的提取物与体细胞共孵育[4]。 2.重编程技术与iPS 2006年，日本京都大学科学家Takahashi1和Yamanaka选择了已经证实与“干性”相关的24种基因作为候选因素，寻找能够诱导体细胞转化为其它类型细胞的关键因子[5]。研究结果发现其中的四种基因：Oct-3/4、Sox2、c-Myc和Klf4通过一种逆转录病毒载体，导入小鼠皮肤成纤维细胞中，可以使来自胚胎小鼠或者成年小鼠的不同的纤维原细胞拥有胚胎干细胞的多能性。他们将经由这种方法获得的胚胎干细胞命名为“诱导性多潜能干细胞（iPS）”。这些iPS细胞能表达ESC的各种表面标记，可以分化为各种组织细胞。可是，iPS首次在公众面前亮相并没有引起太多的重视，因为，他们获得的胚胎干细胞无论是在基因表达模式还是在“表观基因组学”（epigenomics）上和自然的胚胎干细胞都有一定的距离。 2007年，Yamanaka研究组再度出击，与美国威斯康辛大学麦迪逊分校的俞君英和Thomson等分别发布了利用人体皮肤细胞成功诱导生成类似胚胎干细胞性质的全能干细胞的研究成果[6，7]。以上研究成果论文经权威的《科学》和《细胞》杂志刊登后，全球学术界和舆论即为之轰动，毫无疑问，这项惊人突破将是干细胞技术在医学上广泛应用的基础。 在人类的iPS中，他们采用了NANOG作为分子标记，获得的细胞全能性更接近胚胎干细胞。经表观遗传学证明，在DNA甲基化、H3K4、H3K27甲基化，X染色体失活等方面，都接近正常的胚胎干细胞。而且这些iPS植入生殖系统后可以正常发育。这些都比2006年采用Fbx15作为筛选标记得到的鼠类iPS更为进步。 3. iPS分子机理 在这些因子当中，Oct-3/4在干细胞研究中最早受到关注，它们毫不例外地都是转录因子，通过调控基因的转录与表达，决定干细胞的“干性”。 2003年，同时发表在《Cell》 第113卷的两篇文章，让科学家们距离最终揭示决定干细胞自我更新和保持多能性的分子因子的目标，又迈进了一步[8]。Yamanaka研究组发现一个在小鼠胚胎干细胞和移植前胚胎中专一表达的基因。该基因编码的Nanog蛋白是一种具有阻碍分化作用的同源异型框转录因子（homeobox transcription factor），对于维持小鼠胚胎干细胞多能性起到很重要的作用。同样，英国科学家在人和小鼠胚胎干细胞中也分离到这一类类似基因产物，但在分化过的细胞中却不见其踪影。他们根据苏格兰凯尔特人传说中长生不老的乐土（Tir nan Og），将之命名为Nanog基因。据证明，Nanog对于维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力很重要，并且它在早期将要分化成胚胎干细胞的胚胎中也有表达。他们还揭示了，与早期确认的保持干细胞多能性的STAT3途径不同，Nanog作用于另一条独立的保持干细胞多能性的信号传导通路。于是，随着对Nanog功能研究的深入，逐渐拉开了重编程技术中iPS研究的序幕。 Oct-3/4为POU家族的转录因子，具有一个保守的DNA结合结构域－POU结合域[9]。Oct-3/4含有家族的保守区－N端和C端各有一个脯氨酸富集区，它们是Oct-3/4因子的转录活性区。Oct-3/4因子能特异地识别八聚体序列，通过结合到八聚体上调节基因的转录。作为哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。实验表明，无论在体内或在体外，Oct-3/4 都在未分化的胚胎干细胞、胚胎癌细胞（EC 细胞）和胚胎生殖细胞（EG细胞）中表达，当这些细胞被诱导分化为体细胞时，Oct-3/4 表达下降，由此可见，Oct-3/4 在哺乳动物胚胎发生中是一个关键的调控因子，而且可能在维持细胞的全能性及未分化状态中起着关键的作用。而且Oct-3/4 是细胞全能性的标志,它能够促使ICM 形成、维持胚胎干细胞未分化状态并促进其增殖，此外Oct-3/4的精确表达对于维持ES 细胞的正常自我更新是至关重要的，因此，Oct-3/4 的活化被认为是重编程为多能干细胞的标志。然而Oct-3/4却在间充质干细胞中低水平表达，说明Oct-3/4 不是维持多能性的唯一基因。 SOX2最早是在EC 细胞中被鉴定出来的，可以说一开始它就与干细胞结缘。研究结果显示，SOX2在早期胚胎发生、神经分化和晶状体发育等多种重要的发育事件中都起着关键的作用，从而引起了广泛的关注。在干细胞中，它与Oct-3/4形成蛋白复合体，一同调控FGF3、UTF1等生长因子的表达，被认为是保持Oct-3/4表达的关键因素。美国威斯康辛大学麦迪逊分校的俞君英和Thomson研究组，采用的四因子组合“Oct-3/4、SOX2、Nanog和LIN28”，能将胎儿或者新生儿的皮肤细胞重编程为干细胞，其详细的作用机理还有待进一步探索。其中LIN28的许多功能还不被完全揭示，只是在干细胞中，它能提高间叶细胞恢复过程中的重编程频率。而在已获得的iPS中，有一 个细胞不表达LIN28，则证明LIN28不是必不可少的[6]。 而Yamanaka研究组筛选得到的四因子是“Oct-3/4、SOX2、c-Myc和KLF4”。他们对这些决定因子在干细胞中的作用机制，研究得更为透彻[10] 。 c-Myc是继p53之后最受人瞩目的原癌基因，其蛋白N端可以与TRRAP、TIP48相作用，影响组蛋白乙酰化酶、ATP酶的作用，而C端含有螺旋－环－螺旋(HLH)及亮氨酸拉链结构域，在与Max蛋白形成稳定的复合物后与DNA序列（CACA/GTG）相结合，调节基因的表达。1993年，c-Myc缺失的小鼠胚胎不能在妊娠中存活引起了关注，c-Myc第一次与干细胞相联系。进一步结果显示，它与血管生成及原始红细胞生成相关。 锌指蛋白KLF4是Krüppel 样转录因子家族的一员，在干细胞和分化细胞中高表达。它是一个原癌基因，通过与p53、p21等原癌基因作用而在多种癌症中起抑制作用。在干细胞中，它与STAT3途径相关，并与Oct-3/4和SOX2相作用，活化ES细胞中的主要启动子Lefty1。这四个蛋白互相协同，对保持细胞的“干性”起着决定的作用。在很多方面，ES细胞与癌细胞类似，这就不奇怪为什么c-Myc和KLF4成为其中重要的一员，这两个因子互相作用，抑制细胞的凋亡。c-Myc的特异之处在于它可以使体细胞的染色体结构由紧密重新变得松散，并重组组蛋白乙酰化酶复合物。这对体细胞的转型非常重要。如果仅有c-Myc和KLF4的表达，正常体细胞会转化成癌细胞，Oct-3/4的加入把它们推入干细胞途径，结合了KLF4的Oct-3/4与SOX2共表达，最终将体细胞转化为ES细胞(图1)。 图1. 干细胞四因子作用机理 4. iPS一般实验流程[7]（以Yamanaka的iPS实验为基础） （1） 体细胞的培养； （2） 提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒，构建携带目的基因的慢病毒穿梭质粒表达载体； （3） 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293FT细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；其中采用PCR 方法对重组载体进行鉴定，利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测； （4） 浓缩、纯化病毒液； （5） 用高质量的病毒液感染体细胞，获得iPS细胞； （6） iPS细胞培养和组织学分析； （7） 通过定量PCR精确测定病毒滴度和Western 分析实验结果； （8） 应用碱性磷酸酶染色法进行免疫细胞化学分析，quinacrine-Hoechst染色法确定染色体组型； （9） Chip-chip全基因组分析，显示DNA甲基化与组蛋白甲基化情况，阐明细胞核中染色质的状态； （10）畸胎瘤形成实验； （11）针对全细胞的RNA进行DNA芯片分析，显示基因表达情况； 5.意义与展望 诱导性多潜能干细胞（iPS）不仅被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举，而且多数人认为这一发现极有可能在若干年后问鼎诺贝尔奖，甚至有人预言，这一重大突破将在干细胞研究的科学和政策领域引发一场大地震。 干细胞与克隆技术的研究及应用几乎涉及了所有的生命科学和生物医药学领域，在此之前，胚胎干细胞的获取主要还是来自早期发育的囊胚，而胚胎的这一阶段涉及许多对生命或“人”的界定问题，不同国家、不同信仰、不同民俗、不同文化背景导致了世界各国对“人”或生命的界定并不完全一致。如何看待胚胎干细胞研究成为最为激烈而敏感的伦理之争。 美国等多个国家出台了胚胎保护的法律，近十年来，其干细胞研究一直深受这些律法的束缚，而iPS可以绕过自然胚胎等伦理和法律问题，极大地解放了干细胞研究。 在很多疾病治疗中，器官移植可以起到彻底根治的效果，但人体器官移植经常面临组织移植后产生的排异反应而导致死亡。如果能利用患者本身的体细胞逆转为iPS再发育成为所需要的组织，那器官移植到排斥问题就会迎刃而解了。这正是为何众多生物医学研究者获知iPS成功后感到振奋的最主要的原因。 但是有人欢喜有人优，iPS成功后，通过核移植或者提取物来实现重编程的研究者都感到惶恐，他们都在担心是否以后其余的重编程方法都会被淘汰？ 其实，iPS的成功离全面主导干细胞重编程技术还有一段距离。因为iPS还存在不少问题。 在实验成果发布之后，Yamanaka研究组随即发表声明c-MYC对iPS有致癌的作用，iPS细胞植入的小鼠近1年时间，20％出现肿瘤，而它们的c-MYC基因都高表达[11]。在没有用到c-MYC的细胞中，他们也能成功获得iPS细胞，只是效率降低，另外，美国威斯康辛大学麦迪逊分校的研究人员植入皮肤细胞的基因中没有c-MYC，但是他们使用的皮肤细胞必须是胎儿或者新生儿的细胞，可见，c-MYC对iPS并不是必须的。 还值得注意到是，病毒载体的使用带来一些安全性问题。4种转录因子是通过慢病毒载体持续表达来转导的，而研究表明在皮肤成纤维细胞转变成iPS细胞过程中，伴随载体编码转录因子的逐渐沉默，iPS细胞多能性的维持是否需要载体的持续表达有待研究。 另一方面，在iPS实验过程中，对反应体系中质粒的纯度、慢病毒载体的效率、病毒的滴度和感染效率等要求都很高，但是得到效率却很低，重组率只有0.1%。实验的条件需要进一步优化。 总之，看起来很美的干细胞重编程技术终于开花，其中iPS方法拆除了干细胞研究与伦理、法律之间最后一道樊篱。但是，毕竟，iPS才刚刚获得初步的成功，还需要进一步的发展和优化，离临床应用都还有很长的路要走。 VIII.干细胞与疾病 更多阅读 想了解更多干细胞相关信息，请查看以下的干细胞问答环节（Frequently Asked Questions ，FAQs）。 以下网页同样也含有干细胞相关知识。 • http://www.news.wisc.edu/packages/stemcells/ 来自威斯康辛大学（The University of Wisconsin）的网站，主要提供关于干细胞普遍知识。 • http://www.eurekalert.org 美国科学促进联会建立的公共科学新闻网站，搜索“stem cells”可以获得干细胞相关的科技信息。 • http://scitechdaily.com/ 一个提供新科技新闻、特写和评论的网站，搜索“stem cells”可以获得干细胞相关的内容。 • http://www.sciam.com/ • 科学美国人网站。搜索“stem cells”可以获得干细胞相关信息。 • http://today.reuters.com/news/newssearchresults.aspx?srch=stem%20cell&searchtype=a 通过搜索提供干细胞相关要闻。 • http://www.stemcellresearchnews.com/ • 一个商业的实时更新网站，提供关于各种类型干细胞的特写通讯。 干细胞和疾病 干细胞的应用前景 研究干细胞将有助于我们理解干细胞如何转化成组成人体的各种纷繁复杂的特异性的细胞。某些人类最严重的疾病，如癌症和先天缺陷，归咎于该过程中产生的一系列问题。如果可以更好的理解正常细胞的分化发育过程，那么将有助于我们理解并纠正那些导致疾病的错误。 干细胞的另一个潜在用途是为医疗生产细胞和组织。今天，捐赠的器官和组织常被用于取代患病的或者损伤的组织。但不幸地是，可获得的用于移植的器官和组织的数量远远不能满足病人的需求。多功能干细胞为取代细胞和组织提供了可更新的来源，可以用于无数的疾病、紊乱和残疾，包括帕金森症、老年性痴呆、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎。 是否已有人类胚胎干细胞成功治疗人类疾病的案例呢？ 科学家们从1998年已经开始从事人胚胎干细胞的实验研究了，威斯康辛大学（The University of Wisconsin）的詹姆士汤姆逊研究组发展了人胚胎干细胞的分离培养技术。此外，美国联邦基金对人胚胎干细胞的研究的资助在2001年8月9日开始，当时布什总统宣布了关于联邦基金对人胚胎干细胞研究的资助决定。由于大多数的学术研究机构都依靠联邦基金来支持实验工作，他们从那时候开始学习如何培养和使用细胞。因此，尽管人类胚胎干细胞被认为是具有治疗或者治愈许多破坏性疾病的潜能，但是将干细胞应用于治疗的研究还处在初期阶段。 骨髓中形成血液的干细胞称为造血干细胞（HSCs），是目前常用于人类疾病治疗的仅有的干细胞类型。将造血干细胞应用于骨髓移植的技术已有超过40年的历史了。现在，更先进的获得造血干细胞的技术被用于治疗白血病，淋巴瘤和一些遗传性血液病。 成体干细胞也已经被证明在临床上具有治疗其它人类疾病的潜能，包括糖尿病和晚期肾癌。 然而，目前研究人员还仅是对非常有限数量的病人中进行相关临床治疗。 参与到研究工作中 科学家们测试了成体干细胞治疗某些疾病的能力，你可以以干细胞为关键词（或其他词组）在临床实验官方网站（ClinicalTrials.gov）搜索用干细胞治疗特殊疾病的临床实验。 干细胞研究的道德标准 干细胞在医药健康领域具有很多潜在功能，研究干细胞将有助于我们理解干细胞如何转化成组成人体的各种纷繁复杂的特异性的细胞。某些人类最严重的疾病，如癌症和先天缺陷，归咎于该过程中产生的一系列问题。进一步了解正常细胞的分化发育过程，必将有助于我们理解并纠正那些导致疾病的错误。 然而，对人类胚胎干细胞的研究引发了很多社会舆论。多功能干细胞由仅几天大的人类胚胎中分离出来。此外，多功能干细胞株系也可从发育超过8周的胎儿组织中获得。 随着科学技术不断发展，围绕相关生物问题而出现的道德伦理观点也越来越多。很有必要从科学角度以及道德角度共同探讨这些问题。为此，NIH保留了临床生物伦理学部门，并且，NIH生物伦理学特别兴趣小组还提供一系列有关干细胞研究的道德伦理的资料。 更多资讯 想了解更多干细胞相关信息，请查看以下的干细胞问答环节（Frequently Asked Questions ，FAQs）。 以下网页同样也含有干细胞相关知识。 • http://www.news.wisc.edu/packages/stemcells/ 来自威斯康辛大学（The University of Wisconsin）的网站，主要提供关于干细胞普遍知识。 • http://www.eurekalert.org 美国科学促进联会建立的公共科学新闻网站，搜索“stem cells”可以获得干细胞相关的科技信息。 • http://scitechdaily.com/ 一个提供新科技新闻、特写和评论的网站，搜索“stem cells”可以获得干细胞相关的内容。 • http://www.sciam.com/ • 科学美国人网站。搜索“stem cells”可以获得干细胞相关信息。 • http://today.reuters.com/news/newssearchresults.aspx?srch=stem%20cell&searchtype=a 通过搜索提供干细胞相关要闻。 • http://www.stemcellresearchnews.com/ • 一个商业的实时更新网站，提供关于各种类型干细胞的特写通讯。 干细胞和疾病 干细胞的应用前景 研究干细胞将有助于我们理解干细胞如何转化成组成人体的各种纷繁复杂的特异性的细胞。某些人类最严重的疾病，如癌症和先天缺陷，归咎于该过程中产生的一系列问题。如果可以更好的理解正常细胞的分化发育过程，那么将有助于我们理解并纠正那些导致疾病的错误。 干细胞的另一个潜在用途是为医疗生产细胞和组织。今天，捐赠的器官和组织常被用于取代患病的或者损伤的组织。但不幸地是，可获得的用于移植的器官和组织的数量远远不能满足病人的需求。多功能干细胞为取代细胞和组织提供了可更新的来源，可以用于无数的疾病、紊乱和残疾，包括帕金森症、老年性痴呆、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎。 是否已有人类胚胎干细胞成功治疗人类疾病的案例呢？ 科学家们从1998年已经开始从事人胚胎干细胞的实验研究了，威斯康辛大学（The University of Wisconsin）的詹姆士汤姆逊研究组发展了人胚胎干细胞的分离培养技术。此外，美国联邦基金对人胚胎干细胞的研究的资助在2001年8月9日开始，当时布什总统宣布了关于联邦基金对人胚胎干细胞研究的资助决定。由于大多数的学术研究机构都依靠联邦基金来支持实验工作，他们从那时候开始学习如何培养和使用细胞。因此，尽管人类胚胎干细胞被认为是具有治疗或者治愈许多破坏性疾病的潜能，但是将干细胞应用于治疗的研究还处在初期阶段。 骨髓中形成血液的干细胞称为造血干细胞（HSCs），是目前常用于人类疾病治疗的仅有的干细胞类型。将造血干细胞应用于骨髓移植的技术已有超过40年的历史了。现在，更先进的获得造血干细胞的技术被用于治疗白血病，淋巴瘤和一些遗传性血液病。 成体干细胞也已经被证明在临床上具有治疗其它人类疾病的潜能，包括糖尿病和晚期肾癌。 然而，目前研究人员还仅是对非常有限数量的病人中进行相关临床治疗。 参与到研究工作中 科学