第十章 食品检验与免疫技术

null第十章 食品检验与免疫技术第十章 食品检验与免疫技术陆剑锋 食品科学与工程系null免疫检验检测技术是食品检验检测分析技术体系的一个重要分支，由于其专一性、高灵敏、快速简易的应用特点，已称为食品营养成分、功能成分、有害成分、污染残留成分检测的重点发展技术之一。 免疫检验检测技术是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础，可以与酶标记、放射性和发光性物质标记、生物传感器等各种相结合，形成检验结果准确而又精确的专用检测技术。 一个国家的食品检验检测水平关系到广大人民群众的生命安全及社会稳定。第一节 现代食品检验的理论基础第一节 现代食品检验的理论基础食品检验主要是运用物理、化学、生物化学、微生物学等学科的基本理论及各种科学技术，按照制定的技术，对食品加工、农、牧业生产中的物料，包括原料、辅助、半成品、成品、副产品等的主要成分、含量及其卫生指标进行检测以及对可能含有的有害物质进行痕量分析。 食品检验是研究和评定食品质量及其变化的一门学科。 它的特点是紧密衔接相关基础学科的发展，根据影响食品质量与安全的因素而不断地革新和创新自己的技术体系。一、食品检验与食品质量和食品质量安全一、食品检验与食品质量和食品质量安全食品检验是食品质量和食品卫生的评价手段，是实现食品质量安全的重要基础工作之一。 食品检验内容十分丰富，主要包括：食品卫生与营养成分、保健食品中的功能成分、食品添加剂、食品中污染及违禁成分、食品辅助材料等有关的食品分析。1. 食品质量要素1. 食品质量要素国家标准《食品工业基本术语》（GB15091-1995），食品质量（food quality）是指食品满足规定或者潜在要求的特征和特性总和，反映食品品质的优劣。 食品质量，是一个“度”的概念，不是“质”的概念，是指食品的优劣程度，既包括优等食品，也包括劣等食品。 食品质量要素分为：外观要素、质构要素、风味要素、营养质量、卫生质量和耐藏性能等。2. 食品质量安全2. 食品质量安全食品安全包含食品质量安全（food safety）和食品供给安全（food security）。 根据WHO的定义，食品安全（food safety）是“食物中有毒、有害物质对人体健康影响的公共卫生问题”。其中包括两点：第一“有毒有害物质”。第二“对人体健康影响”。 食品质量安全是指食品及食品相关产品不存在对人体健康造成现实的或潜在的侵害的一种状态，也指为确保此种状态所采取的各种管理方法和。 null食品质量安全包括食品卫生、食品质量、食品营养等相关方面的内容。 常见的食品质量安全的危害有如下分类： （1）生物因素：细菌性食品中毒的病原菌；人类肠道传染病的病原菌；人畜共患的病原菌和病毒；引起婴儿腹泻和甲肝流行病毒；其他，包括鱼贝类、动植物毒素等 （2）化学因素：环境污染；农药、兽药残留；添加剂滥用；营养强化剂滥用；贮藏加工成分转化物；食物中抗营养因子。 （3）生产与技术因素：生物技术因素；生产技术因素；经济与生活因素；人体生理因素二、食品检验检测的技术体系二、食品检验检测的技术体系目前，根据采用的技术和方法，大致可以分为食品感官检验技术、食品微生物检验技术、食品理化检验技术和生物检测技术等若干种类。 但是，针对当前食品质量与安全存在的问题，进一步建设和完善食品检验检测技术体系显得极其重要和紧迫。1. 食品感官检验1. 食品感官检验食品感官检验（food sensory analysis or sensory evaluation）就是凭借人体自身的感觉器官，具体地讲就是凭借眼、耳、鼻、口（包括唇和舌头）和手，对食品的质量状况作出客观的评价。 食品质量的优劣最直接地表现在它的感官性状上，通过感官指标来鉴别食品的优劣和真伪，不仅简便易行，而且灵敏度高，直观而实用，与使用各种理化、微生物的仪器进行分析相比，有很多优点，因而它也是食品的生产、销售、管理人员所必须掌握的一门技能。 null食品感官检验能否真实、准确地反映客观事物的本质，除了与人体感觉器官的健全程度和灵敏程度有关外，还与人们对客观事物的认识能力有直接的关系。 只有当人体的感觉器官正常，又熟悉有关食品质量的基本常识时，才能比较准确地鉴别出食品质量的优劣。 因此，通晓各类食品感官检验方法，为人们在日常生活中选购食品或食品原料、依法保护自己的正常权益不受侵犯提供了必要的客观依据。 感官鉴别有三个主要的应用特点：（1）随时检验及时处理；（2）无需场地和条件要求；（3）感官鉴别的灵敏性。2. 食品微生物检验2. 食品微生物检验食品微生物检验（food microbiological analysis）是应用微生物学实验技术，检查食品中微生物的生长、繁殖情况。 检测污染食品的生物主要包括细菌、霉菌、生物毒素、寄生虫等，通常采用显微技术，通过接种、分离纯化、配制培养基进行培养的技术来对部分可疑食品中的病原体进行检测。 食品微生物检验技术的主要特点：（1）微生物菌类（种属繁多）；（2）微生物检验的数量观念（污染程度）；（3）微生物检验技术（检验技术广泛）；（4）微生物检验要求（快速性、准确性）3. 食品理化检验3. 食品理化检验食品理化检验（food physical and chemical analysis）是应用物理学和化学分析原理，利用光谱、色谱及质谱等分析仪器，结合有机化学、分析化学、食品化学等知识对食品的质量要素进行测定、试验、计量，从而判断食品的质量。 食品理化检验的主要特点：（1）技术性强；（2）应用面广；（3）精确度高。4. 食品生物技术检验4. 食品生物技术检验食品生物技术检验（biological assay or analysis）是将生物酶、生物分子、离体组织或细胞乃至生物个体的生物学特征和原理应用于食品检验的方法。 生物检验技术，包括终点测定法、动力学测定法、多酶偶联测定法等生物酶技术，核酸探针技术和多聚酶链式反应技术等分子生物学技术以及微生物、生物酶、免疫等技术复合应用的生物传感器、生物芯片技术等。其中最为普及和成熟的生物技术是免疫检验检测技术。 生物技术检验的主要特点：（1）生物识别功能；（2）灵敏度高；（3） 特异性强和针对性强。第二节 免疫检验检测第二节 免疫检验检测免疫学检测技术起源于检测病原微生物抗原及抗体的血清学诊断。 1896年，G. Widal和A. Sicad利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效准确地诊断伤害。 此后，应用免疫反应原理的免疫检验技术逐步在医学、生物等各个领域普及，成为一种微量化学分析方法。 免疫检验包括标记免疫测定法和非标记免疫检测法。标记免疫检测法又包括荧光免疫、化学发光免疫、放射免疫、酶联免疫等检测方法。一、免疫检验检测的应用原理一、免疫检验检测的应用原理食品免疫检验检测技术主要利用体外抗原和抗体的特异性反应。借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。 抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。 检测原理：根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本的抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 对抗原或抗体进行定量检测时，反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。1. 抗原或抗体检测的实际意义 1. 抗原或抗体检测的实际意义 抗体检测的意义 检测抗体多用于医学和生物学，可用于评价人和动物免疫功能的指标。 在食品检验检测中常用于受病毒、微生物感染的瘟疫产品。有利于鉴别评价畜禽产品的质量安全。 抗原检测的意义： 作为抗原进行检测的物质分为四类：（1）各种微生物及其大分子（2）生物体内各种大分子物质。（3）人和动物细胞的表面分子（4）各种半抗原物质。 2. 抗体的分类2. 抗体的分类抗体有多种类型，根据制备原理和方法，可分为：多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。（1） 多克隆抗体一种抗原性物质由于具有多种抗原决定簇，既可以刺激多种淋巴细胞克隆，也可以产生抗多种抗原决定簇的抗体，所以体液或血清是含有多种抗体的混合物。这样的免疫血清称为多克隆抗体（polyclonal antibody），即第一代抗体。（2）单克隆抗体（2）单克隆抗体一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（monoclonal antibody）。 单克隆抗体具有如下优点： 单一特异性，与一个抗原决定簇反应；可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；一经制出，可无限量地供应；生产单克隆抗体不一定需要纯的抗原；能查出混合物中存在的用常规方法查不出的微量成分。（3）基因工程抗体（3）基因工程抗体基因工程抗体（genetic engineering antibodies）是以基因工程技术等高新生物技术为平台制备的生物药物总称。 通常制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，在 80 年代早期，开始利用基因工程制备抗体，降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。 目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。 基因工程抗体主要包括：嵌合抗体、改行抗体（人源化抗体）、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。 二、免疫检验检测的主要方法二、免疫检验检测的主要方法常规免疫检验检测方法是直接利用抗原与抗体反应产生的关系进行检测，这一类方法简便、直观，通常无需特殊的处理和试剂。 常规免疫检验检测方法主要有以下几种： 凝集反应法（直接和间接）、沉淀反应法、免疫扩散法（实质上是免疫沉淀）、免疫电泳法等1. 常规免疫检验检测方法（1）凝集反应（1）凝集反应凝集反应（agglutination）是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可以通过肉眼或显微镜观察到的现象。 凝集反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin） 生理盐水pH 6-8 -37℃ 二价相应抗体凝集null（2）沉淀反应（2）沉淀反应当抗原为可溶性分子时，在与抗体结合后就形成沉淀（precipitation）。 絮状沉淀反应（flocculation）：在一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下，37℃保温1-2h，便可以出现蛋白质沉淀。通过对沉淀量的检测，可以测出抗原抗体分子比，粗略地计算出抗原决定簇的数目。 环状沉淀反应（ring precipitation）：取直径5mm左右的小试管，加入抗体后，小心加入相应的抗原，使抗原抗体不相混，37℃保温10-20min，在抗原抗体界面上出现沉淀，这就是环状沉淀实验。（3）免疫扩散法（3）免疫扩散法免疫扩散（immuno diffusion）利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原和抗体在浓度比例合适的部位产生沉淀带或沉淀环。免疫扩散反应实质上也是免疫沉淀反应。 单向免疫扩散（simple immunodiffusion）：是在琼脂中加入一定量的抗体，在孔中加入未知量的抗原。在37℃保温过程中，孔内的抗原不断向四周扩散，在遇到抗体后形成抗原抗体复合物沉淀。如果抗原量大，后继的抗原遇到复合物后使之溶解，继续向四周扩散。复合物沉淀圈也不断扩大，直至孔内的抗原全部形成沉淀。（4）免疫电泳法（4）免疫电泳法火箭电泳（rocket immunoelectrophoresis ）是单向的定量免疫电泳技术。在电场作用下，定量的抗原在泳动过程中不断地出现抗原-抗体复合物沉淀的形成-溶解-再形成过程，类似单向琼脂扩散。当全部抗原与抗体结合成抗原抗体复合物沉淀时，在琼脂内形成可见的锥形弧峰，形如火箭故称为火箭电泳。2. 标记抗原抗体免疫检验检测法 2. 标记抗原抗体免疫检验检测法 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究。 因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 （1）免疫荧光检测（1）免疫荧光检测免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。免疫荧光技术（immunofluorescence technique) ）是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。 常用的荧光素主要有：异硫氰酸荧光素（FITC），呈黄绿色荧光；四乙基罗丹明（RB200）呈明亮橙色荧光；四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），呈橙红色荧光。 null直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在。缺点是检查多种抗原需分别制备多种标记抗体。 间接荧光法：将抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体。（2）酶联免疫吸附试验（2）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA）是免疫酶技术中的一种。 原理：抗原或抗体结合到固相载体表面仍保持免疫活性；抗原或抗体与酶形成的结合物仍保持其免疫活性和酶活性；结合物与相应抗体或抗原反应后，免疫复合物上标记的酶在遇到相应底物时，可以催化底物水解、氧化还原，从而产生有色物质，其颜色深浅与相应的抗体或抗原有关。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。 （a）直接ELISA检测方法（a）直接ELISA检测方法首先将抗原吸附于载体表面，然后将酶标记抗体与抗原反应形成酶标记的免疫复合物，最后加入底物产生有色物质，进行光密度测定，计算出抗原存在量。（b）间接ELISA检测方法（b）间接ELISA检测方法首先将已知定量的抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加入待测抗体，温浴过夜，或37℃保温2h后，洗涤去未结合的杂蛋白，加酶标抗抗体，保温后洗涤去未结合的酶标抗抗体，加底物保温30min后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。 （c）竞争法（竞争抑制法）（c）竞争法（竞争抑制法）竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。 设立对照（d）双抗夹心法（d）双抗夹心法首先将特异抗体的免疫球蛋白吸附在载体的表面，洗涤除去未吸附的抗体，加入含有抗原（多价）的待测溶液，保温形成抗原―抗体复合物，洗涤除去杂蛋白，再加经抗原免疫的第二种动物获得的特异抗体（酶标抗抗体），经再次保温则可以形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤后加底物呈色，终止酶反应，比色测定抗原量。 该法不能用来测定半抗原或低于二价的小分子抗原。（3）化学发光免疫检测（3）化学发光免疫检测化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是利用化学发光物标记的免疫检测技术。 分为二种类型：以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。 它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫分析重要的发展方向。null化学发光的发光类型通常分为闪光型（flash type）和辉光型（glow type）两种。 闪光型发光时间很短，只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型，发光时间从几分钟到几十分钟，或几小时至更久。三、现代免疫技术三、现代免疫技术现代免疫技术的特征是免疫技术与生物化学、 材料学、酶学等相关技术交叉应用，新兴边缘学科技术不断涌现。1. PCR-ELISA 原理：是在做PCR扩增时应用生物素（biotin）标记的引物，这样PCR的产物就可结合到亲和素（avidin）包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交，然后就可以用抗地高辛的酶联反应检测。 特点：PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物，这比常规用电泳方法及Southern blot要简便、省时，可同时处理大量标本，便于自动化。2. 免疫胶体金技术2. 免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定胶体状态，称为胶体金。 1971年，Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。 null原理：主要利用金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 特点：胶体金标记技术由于标记物制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广。3. 免疫生物传感器3. 免疫生物传感器免疫生物传感器（immune-biosensor detecting）是生物技术与微电子技术相结合，利用生物体内抗原、抗体专一性结合而导致电化学变化的设备装置。4. 微阵列技术4. 微阵列技术微阵列技术（microarray technology） 主要是指由成千上万个DNA样品或寡核苷酸，密集排列于硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上，再与模板在严格条件下进行杂交，最后由激光共聚焦显微镜等设备获取图象信息，通过计算机分析处理获得信息的技术集合。（即生物芯片） 根据其在固相载体上排列的探针不同，可大致分为两类： 一类是cDNA芯片，是将cDNA固定于玻片等固相载体表面，并将其暴露于一种或一组标记的探针之下，也可用基因组DNA或经基因组错配扫描纯化的DNA来制造微阵列； 另一类是寡核苷酸芯片，其可在原位合成，亦可合成后再固定于芯片上，然后与标记的探针进行杂交。null5. 免疫层析试纸条5. 免疫层析试纸条免疫层析试纸条多使用胶体金标记技术，是一种利用胶体金颗粒作为标记物的一项新技术。 原理：是以条状纤维层析材料为固相，借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体（如抗体或抗原）发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶促显色反应或直接使用可目测的着色标记物（如胶体金）在短时间（5-10min）便可得到直观的实验结果。null特点：它不需进行结合标记物与游离标记物的分离，省去了繁琐的加样、洗涤步骤。因而这种分析技术操作简单快速，分析结果清楚，易于判断，且无须仪器(或只需简单仪器) ，非常适用于食品的现场快速检测。Any Questions？Any Questions？