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分子杂交技术

2011-11-30 37页 pdf 1MB 61阅读

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分子杂交技术 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * * 分子杂交 * * * * 分子生物学中用于检测生物样 本中是否含有特定的生物分子(探 针)的一门技术。 生物秀实验频道——生命科学实验中心 ...
分子杂交技术
生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * * 分子杂交 * * * * 分子生物学中用于检测生物样 本中是否含有特定的生物分子(探 针)的一门技术。 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 分子杂交原理及流程图 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结 果 显 示 探针制备 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * 分子杂交分类 * * * • Southern Blot ----DNA杂交 • Northern Blot ----RNA杂交 • Western Blot ----蛋白质杂交 • 原位杂交 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * * 样品制备 * * * * • DNA 纯化 • RNA 纯化 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * * 探针制备 * * * * 制备 探针类型 标记类型 原 理 特 点 随机引物法 双链 DNA 放 射 性 及 非 放 射 性 探针 以变性的靶 DNA为,利 用随机的八碱基引物体外合 成 DNA探针 快速简便 灵敏度较低 PCR掺入法 双链 DNA 放 射 性 及 非 放 射 性 探针 通过 PCR 反应合成 DNA 探 针 模板不受限制 灵敏度高 需合成引物 末端转移法 双链或单链 DNA 放 射 性 及 非 放 射 性 探针 通过 DNA末端转移酶将标记 的核苷酸连到双链或单链 DNA探针的 3’-OH上 快速简便 需 TDT酶 切口平移法 双链 DNA 放 射 性 及 非 放 射 性 探针 利用 Klenow 酶的 DNA 聚合 酶和 5’-3’外切酶活性从双 链切口开始合成 DNA探针 快速简便 灵敏度较低 末端标记法 DNA和 RNA 探针 放 射 性 探 针 利用 T4 核苷酸激酶将[γ - 32P]ATP标记到探针的 5’端 比内标探针稳 定,灵敏度高 体外转录法 单链 DNA 或 RNA探针 放 射 性 及 非 放 射 性 探针 以单链或变性靶核酸为模 板,用 RNA 聚合酶或逆转录 酶体外合成双链探针,再通 过酶解等处理得到单链探针 灵敏度高 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 随机引物法合成高特异活性的DNA探针 ——NEBLot®Kit 特 点: * 活性高:≥109 dpm / ug * 标记效率高:可用于5 ng-2 ug的模板DNA量 模板量 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 用途 基因文库筛选 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术 DECAprimeTMII Random Priming DNA Labeling Kit 优化技术: * 高纯度无外切酶活性的 Klenow酶提高了标记效率 10分钟完成反应 * 改进的标记动力学增加了探针产量 对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的 * 独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性 减少引物双体形成,提高了灵敏度 * 标记灵活:提供 dATP和 dCTP 两种标记缓冲液 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 特异性单链DNA探针合成标记优化技术 Prime-A-ProbeTM Strand Specific DNA Probe Synthesis Kit 活 性 大 于 4× cpm / ug 109 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 合成高特异性全长RNA探针的最佳选择 ——MAXIscriptTM体外转录试剂盒 特点: * 可合成长达2kb的RNA * 产量可达2-4ug/ ul 同位素标记可达109 cpm/ug * 对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择 * 同位素或非放标记均可 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 多次洗脱反复杂交探针制备技术 ——Strip-EZTM System 专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号 的用户设计,提供非常温和的杂交信号洗脱条件,提 高膜的使用寿命达通常的三倍左右。 工作原理 合成探针的同时掺入经过修饰的dNTP (修饰不影响杂交特性) 杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解 68℃温和洗脱 适用于:Northern\Southern\dot/slot及相关杂交 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs Strip-EZTMRNA探针合成 Strip-EZTMRNA Probe Synthesis & Removal Kit 特点: * 灵敏度高 比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上 * 温和洗脱,提高膜寿命 * 不同启动子有不同试剂盒 * 同位素和非放标记均可 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 效果比较 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs PCR 法Strip-EZTMDNA探针的合成 Strip-EZTM PCR Stripable DNA Probe Synthesis & Removal Kit 特点: * 模板多样:克隆序列、cDNA、PCR产物 *不对称PCR技术,产物大多为单链DNA探针 *灵敏度高,比随机引物法高3-5倍 *提供除模板、标记物、Taq 酶外所有合成探针 及洗膜试剂,包括M13正反向及T7引物 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs cDNA dsDNA ssDNA ssRNA Oligo nucleotide ssRNA ssDNA dsDNA Oligo nucleotide Probe Type 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs * * * * 标记类型 * * * * • 放射性同位素标记: 灵敏度高,成本低 但操作不便,标记效率不太稳定,寿命受半衰 期限制 • 非放射性标记(地高辛、生物素、荧光素等): 安全,标记稳定,探针寿命较长 但灵敏度较低,背景较高,成本高 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 非 放 射 性 杂 交 系 统 BrightStarTMPsoralen-Biotin Nonisotopic labeling Kit & BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 灵敏度最高的非放检测系统之一 ——BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit 采用的化学发光剂CDP-Star为发光最强、发 光时间最长的化学发光底物之一,灵敏度与同位素 相当。 * 曝光10-30分钟相当于32P压片1-2天 * 发光时间稳定持续2天,发光峰值无明显下降 允许反复多次压片 * 背景很低 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs Phototope ®化学发光系统 NEBlot ® Phototope ® Kit & Phototope ® -Star Chemiluminescent Detection Kit Northern 杂交 Southern 杂交 Phage文库筛选 菌落及 质粒文库筛选 用 途 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 原位杂交及检测试剂盒 mRNAlocator-HybTM In Situ Hybridization Kit mRNAlocator-BiotinTM mRNA In Situ Detection Kit 6小时完成杂交 RNasecure 保证 无RNase污染 高效灵敏的 NBT/BCIP-生 物素探针显色 检测 提供对照 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 改良的Northern杂交技术 ——Ambion 公司的Northern杂交系列 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 完整的Northern杂交试剂盒 包括从琼脂糖、上样、配胶、电泳、转移缓冲液到杂交、洗 膜液,除RNase、膜、Marker的全套试剂。 简便、无污染、背景低、分辨率高;同位素、非放标记均可 杂交时间 变性剂 背景 RNA或 DNA探针 NorthernMAXTM 过夜 甲醛 低 均可 NorthernMax-PlusTM 2小时 甲醛 低 均可 NorthernMax-GlyTM 过夜 DMSO 低 均可 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 杂交用琼脂糖及聚丙烯酰氨凝胶 ——电泳胶专业厂家:BMA公司 强度 分离范围 RNase或 DNase活性 分辨率 适用杂交 类型 Nusieve3:1 agarose 一般 10bp-1500bp 高 Northern Southern SeaKem LE agarose 一般 ≥1kb 确保已无活 高 Northern Southern Western SeaKem Gold agarose 高 1-50kb (常规电泳); 50kb-10Mb (PFGE)电泳 确保已无活 高 Northern Southern Agarose & PAGE 预制胶 Reliant gel system Reliant RNA gel system PAGEr Precast gels 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs NEB公司各种规格的优质 DNA / RNA / Protein MW Markers Protein Marker, Broad Range(2-212kDa) Prestained Protein Marker, Broad Range(6-175kDa) HRP Protein Marker Detection Pack 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 世界杂交膜 ——Schleicher & Schuell 公司产品 *Protran®硝酸纤维素膜 *Optitran®BA-S加强型硝酸纤维素膜 *Nytran®尼龙膜 *Nytran®SuPerCharge 高负荷正电荷尼龙膜 单位面积所带正电荷是普通膜的3倍 大大降低了背景及非特异性结合 膜孔径、面均一性、对称毒度、洁净度好 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 基因差异表达的预制杂交膜 热点领域中 基因的cDNA点阵 各种来源的mRNA 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs CLONTECH公司的高效杂交液 ——ExpressHyb Hybridization Solution 特 点: 通过升高杂交温度并使用修饰的杂交液不 仅将杂交时间由传统的12-24小时减为1-2小 时,还大大降低了非放标记检测的背景。 特别适用于Northern杂交检测低拷贝RNA 和 Southern杂交检测单拷贝基因 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 新型方便的除 RNase 试剂 RNaseZAP RNase Decontamination Solution 一种能完全去除玻璃、塑料表面RNase污染的喷雾剂 ElectroZap还可除电极及pH计等表面的RNase RNAsecure比传统的DEPC使用安全、简便 无须灭菌等后续处理,不影响RT-PCR、体外转录等后续实验 RNAlater 最方便的样品贮藏液 5倍体积即可抑制组织中的RNase 稳定的样品可:室温保存一周,4℃保存一月, -20 ℃长期保存不冻结 样品类型:组织(骨除外)、植物、大肠杆菌、果蝇、鱼等 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 分子杂交实验所用部分仪器 杂交箱 紫外交联仪 同位素检测仪 水浴及摇床 电泳及转膜装置 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 快速毛细管转移装置 ——S & S公司的TurboBlotterTM 特点 快速: 碱性转移 液:1小时 中性转移 液:4小时 经济: 节省转移液 及相关用品 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 基因公司技术讲座 生物秀生物秀生物秀———专心做生物!专心做生物!专心做生物! www.bbioo.comwww.bbioo.comwww.bbioo.com 易易易生物生物生物---领先的生物医药商务平台领先的生物医药商务平台领先的生物医药商务平台 www.ebioe.comwww.ebioe.comwww.ebioe.com 生物秀论坛生物秀论坛生物秀论坛---学术交流学术交流学术交流,,,资源共享资源共享资源共享,,,互助社区互助社区互助社区 www.bbioo.comwww.bbioo.comwww.bbioo.com///bbsbbsbbs/// 生物秀实验频道——生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs
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