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* * * * 分子杂交 * * * *
分子生物学中用于检测生物样
本中是否含有特定的生物分子(探
针)的一门技术。
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分子杂交原理及流程图
样
品
制
备
电
泳
杂
交
转
膜
结
果
显
示
探针制备
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* * * 分子杂交分类 * * *
• Southern Blot
----DNA杂交
• Northern Blot
----RNA杂交
• Western Blot
----蛋白质杂交
• 原位杂交
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* * * * 样品制备 * * * *
• DNA 纯化
• RNA 纯化
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* * * * 探针制备 * * * *
制备
探针类型 标记类型 原 理 特 点
随机引物法 双链 DNA 放 射 性 及
非 放 射 性
探针
以变性的靶 DNA为
,利
用随机的八碱基引物体外合
成 DNA探针
快速简便
灵敏度较低
PCR掺入法 双链 DNA 放 射 性 及
非 放 射 性
探针
通过 PCR 反应合成 DNA 探
针
模板不受限制
灵敏度高
需合成引物
末端转移法 双链或单链
DNA
放 射 性 及
非 放 射 性
探针
通过 DNA末端转移酶将标记
的核苷酸连到双链或单链
DNA探针的 3’-OH上
快速简便
需 TDT酶
切口平移法 双链 DNA 放 射 性 及
非 放 射 性
探针
利用 Klenow 酶的 DNA 聚合
酶和 5’-3’外切酶活性从双
链切口开始合成 DNA探针
快速简便
灵敏度较低
末端标记法 DNA和 RNA
探针
放 射 性 探
针
利用 T4 核苷酸激酶将[γ -
32P]ATP标记到探针的 5’端
比内标探针稳
定,灵敏度高
体外转录法 单链 DNA 或
RNA探针
放 射 性 及
非 放 射 性
探针
以单链或变性靶核酸为模
板,用 RNA 聚合酶或逆转录
酶体外合成双链探针,再通
过酶解等处理得到单链探针
灵敏度高
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随机引物法合成高特异活性的DNA探针
——NEBLot®Kit
特 点:
* 活性高:≥109 dpm / ug
* 标记效率高:可用于5 ng-2 ug的模板DNA量
模板量
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用途
基因文库筛选
Southern 杂交
Northern 杂交
原位杂交
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随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术
DECAprimeTMII Random Priming DNA Labeling Kit
优化技术:
* 高纯度无外切酶活性的 Klenow酶提高了标记效率
10分钟完成反应
* 改进的标记动力学增加了探针产量
对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的
* 独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性
减少引物双体形成,提高了灵敏度
* 标记灵活:提供 dATP和 dCTP 两种标记缓冲液
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特异性单链DNA探针合成标记优化技术
Prime-A-ProbeTM Strand Specific DNA Probe Synthesis Kit
活
性
大
于
4×
cpm
/ ug
109
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合成高特异性全长RNA探针的最佳选择
——MAXIscriptTM体外转录试剂盒
特点:
* 可合成长达2kb的RNA
* 产量可达2-4ug/ ul
同位素标记可达109 cpm/ug
* 对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择
* 同位素或非放标记均可
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多次洗脱反复杂交探针制备技术
——Strip-EZTM System
专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号
的用户设计,提供非常温和的杂交信号洗脱条件,提
高膜的使用寿命达通常的三倍左右。
工作原理
合成探针的同时掺入经过修饰的dNTP
(修饰不影响杂交特性)
杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解
68℃温和洗脱
适用于:Northern\Southern\dot/slot及相关杂交
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Strip-EZTMRNA探针合成
Strip-EZTMRNA Probe Synthesis & Removal Kit
特点:
* 灵敏度高
比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上
* 温和洗脱,提高膜寿命
* 不同启动子有不同试剂盒
* 同位素和非放标记均可
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效果比较
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PCR 法Strip-EZTMDNA探针的合成
Strip-EZTM PCR Stripable DNA Probe Synthesis & Removal Kit
特点:
* 模板多样:克隆序列、cDNA、PCR产物
*不对称PCR技术,产物大多为单链DNA探针
*灵敏度高,比随机引物法高3-5倍
*提供除模板、标记物、Taq 酶外所有合成探针
及洗膜试剂,包括M13正反向及T7引物
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cDNA
dsDNA
ssDNA
ssRNA
Oligo
nucleotide
ssRNA
ssDNA
dsDNA
Oligo
nucleotide
Probe
Type
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* * * * 标记类型 * * * *
• 放射性同位素标记:
灵敏度高,成本低
但操作不便,标记效率不太稳定,寿命受半衰
期限制
• 非放射性标记(地高辛、生物素、荧光素等):
安全,标记稳定,探针寿命较长
但灵敏度较低,背景较高,成本高
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非 放 射 性 杂 交 系 统
BrightStarTMPsoralen-Biotin Nonisotopic labeling Kit
& BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit
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灵敏度最高的非放检测系统之一
——BioDetectTM Nonisotopic Detection Kit
采用的化学发光剂CDP-Star为发光最强、发
光时间最长的化学发光底物之一,灵敏度与同位素
相当。
* 曝光10-30分钟相当于32P压片1-2天
* 发光时间稳定持续2天,发光峰值无明显下降
允许反复多次压片
* 背景很低
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Phototope ®化学发光系统
NEBlot ® Phototope ® Kit & Phototope ®
-Star Chemiluminescent Detection Kit
Northern 杂交
Southern 杂交
Phage文库筛选
菌落及
质粒文库筛选
用 途
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原位杂交及检测试剂盒
mRNAlocator-HybTM In Situ
Hybridization Kit
mRNAlocator-BiotinTM mRNA
In Situ Detection Kit
6小时完成杂交
RNasecure 保证
无RNase污染
高效灵敏的
NBT/BCIP-生
物素探针显色
检测
提供对照
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改良的Northern杂交技术
——Ambion 公司的Northern杂交系列
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完整的Northern杂交试剂盒
包括从琼脂糖、上样、配胶、电泳、转移缓冲液到杂交、洗
膜液,除RNase、膜、Marker的全套试剂。
简便、无污染、背景低、分辨率高;同位素、非放标记均可
杂交时间 变性剂 背景 RNA或
DNA探针
NorthernMAXTM 过夜 甲醛 低 均可
NorthernMax-PlusTM 2小时 甲醛 低 均可
NorthernMax-GlyTM 过夜 DMSO 低 均可
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杂交用琼脂糖及聚丙烯酰氨凝胶
——电泳胶专业厂家:BMA公司
强度 分离范围 RNase或
DNase活性
分辨率 适用杂交
类型
Nusieve3:1
agarose
一般 10bp-1500bp 高 Northern
Southern
SeaKem LE
agarose
一般 ≥1kb 确保已无活 高 Northern
Southern
Western
SeaKem
Gold
agarose
高 1-50kb
(常规电泳);
50kb-10Mb
(PFGE)电泳
确保已无活 高 Northern
Southern
Agarose & PAGE 预制胶
Reliant gel system
Reliant RNA gel system
PAGEr Precast gels
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NEB公司各种规格的优质
DNA / RNA / Protein MW Markers
Protein Marker, Broad Range(2-212kDa)
Prestained Protein Marker, Broad Range(6-175kDa)
HRP Protein Marker Detection Pack
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世界
杂交膜
——Schleicher & Schuell 公司产品
*Protran®硝酸纤维素膜
*Optitran®BA-S加强型硝酸纤维素膜
*Nytran®尼龙膜
*Nytran®SuPerCharge 高负荷正电荷尼龙膜
单位面积所带正电荷是普通膜的3倍
大大降低了背景及非特异性结合
膜孔径、
面均一性、对称毒度、洁净度好
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基因差异表达的预制杂交膜
热点领域中
基因的cDNA点阵
各种来源的mRNA
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CLONTECH公司的高效杂交液
——ExpressHyb Hybridization Solution
特 点:
通过升高杂交温度并使用修饰的杂交液不
仅将杂交时间由传统的12-24小时减为1-2小
时,还大大降低了非放标记检测的背景。
特别适用于Northern杂交检测低拷贝RNA
和 Southern杂交检测单拷贝基因
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新型方便的除 RNase 试剂
RNaseZAP RNase Decontamination Solution
一种能完全去除玻璃、塑料表面RNase污染的喷雾剂
ElectroZap还可除电极及pH计等表面的RNase
RNAsecure比传统的DEPC使用安全、简便
无须灭菌等后续处理,不影响RT-PCR、体外转录等后续实验
RNAlater 最方便的样品贮藏液
5倍体积即可抑制组织中的RNase
稳定的样品可:室温保存一周,4℃保存一月,
-20 ℃长期保存不冻结
样品类型:组织(骨除外)、植物、大肠杆菌、果蝇、鱼等
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分子杂交实验所用部分仪器
杂交箱
紫外交联仪
同位素检测仪
水浴及摇床
电泳及转膜装置
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快速毛细管转移装置
——S & S公司的TurboBlotterTM
特点
快速:
碱性转移
液:1小时
中性转移
液:4小时
经济:
节省转移液
及相关用品
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基因公司技术讲座
生物秀生物秀生物秀———专心做生物!专心做生物!专心做生物!
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