胰蛋白酶活性的定量测定方法

生物化学与生物物理进展 Pr0窖．Biochem．Biophys 80 min in dark with sampkS． the sulfanilic acid and N一(1-naphthy[)一ethylenediammonium x&-as added to the reaction system to measure the concentration 。{produced nitrite in system It was found that the optimum pH for the enzyme reaction was 7．4，K ~,va8 0．i mmol／L There was a relationship between the amounts of sam— pie and nitrite concentration in the system ．This 与＼一 弓 method is simple and convenient Intra—assay CV value i8 3．69％ and inter—assay CV value i8 5．16％ ． The specific activity of nitric oxide svntha．~e in ten rats1 brains is (39．61± 7．64)nmol／ (min-g)． Key words rats’brain， nitric oxide synthase， nitric oxide， nitrite 胰蛋白酶活性的定量测定方法 璺 圃 北京大学生命科学学院，北京 100871) ’{哆 摘要 对甲苯磺酰基精氨酸甲酯 (TPdvIE)足胰蛋白酶的专一性底物 TAME经胰蛋白酶水解释放 出 的对 甲苯磺酰基精氨酸 与活性测定混台物 中的 NaOH反应，导致溶液 pH值 的下降．以酚红 为指示 剂，通过测定 555 nm处光吸收值的降低可 监测 pH的变化 在 0．00t～0 3 的范围内，胰蛋白酶 含量与 555 nm处光吸收值的降低呈线性关 系． 关键词 胰蛋白酶，活性测定，对甲苯磺酰精氨酸甲酯 基固表达产生的胰蛋白酶及其突变体 的活性，常用对甲苯磺酰基精氨酸 甲酯 ( P tosyl—L—arginine methyl ester，TAME)活 性 胶方法定性监测l】j．在活性胶方法的基础上， 发展了一个胰蛋白酶活性的定量测定方法．利 用 TAME作 为胰蛋白酶的专一性底物，在一 定条件下被胰蛋白酶水解后释放出的游离羧基 与反应体系中的氢氧化钠发生中和反应，导致 溶液 pH值降低，以苯酚红 (phenol red)为指 示剂，测定溶液在 555 nm处光 吸收值 的变 化，可以快速测得胰蛋白酶活性数据．胰蛋白 酶在一定的浓度范围内与 555 nnl处光吸收值 的降低呈良好的线性关系，因此可以作为定量 测定胰蛋白酶的方法． 1 材料和方法 1．1 材料 TAME、胰 蛋 白酶、嗜热 菌 蛋 白酶 为 s ma公 司 产 品，其 中胰 蛋 白酶 的 活 力 为 酚红方法 ． 10 700 U／mg， 嗜 热 菌 蛋 白 酶 活 力 为 54 U／mg 胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶 由 上海 丽珠 生化 技术 公 司提 供，活 力分 别为 4000 U／mg和2000 U／mg．纯苯酚红 (pH 变色范围：6．8黄～8．4红)为北京化学试剂 公司产品 其他试剂均为国产分析纯． 1．2方法 苯酚红溶液的配制：40 mg苯酚红用蒸馏 水溶解，加入240 l 1．0 mol／L的 NaOH溶 液，用蒸馏水定容至 200 m1． 在 1．5 ml苯 酚 红溶 液 中加 入 0．2 ml 2 mmol／L TAME溶 液 、20／*1 1 mol／L CaCI， 溶液，适量的酶用水溶解至 0．28 ml，反应总 体积为2 ml，此时溶液的 pH值为 6．90．室温 下 10 rain内在紫外可见分光光度计 (uv一120— 02，岛津)上测定 555 nm的光吸收值变化． 以不加酶液的同样反应为对照，以蒸馏水溶液 f 西 f}i联系 I 收穑 日期：1996—01．31，修回日期：1996．03—25 、，／ n 、J ． r、 ． 厂＼＼ 维普资讯 http://www.cqvip.com · 552 一 生物化学与生物物理进展 Prog．Biochem．Biopttys 为空白．一个苯酚红单位定义为室温下每分钟 使得 A一降低 0．001的酶量 ． 2 结果与讨论 在苯酚红一TAME溶液 中加入胰蛋 白酶之 前以及加入胰蛋白酶反应一段时间后，反应溶 液的颜色由红色逐渐变黄，通过光谱扫描发现 原来在 535～580 nlTl之间存在的一个吸收峰 随着反应的进行逐步消失，而该峰峰尖对应于 555 nlTl处 (图 1) 因此选择 555 nlTl处光吸 收值的变化作为测定的指标 图 1 酚红．TAME溶液的光吸收图谱 — — ： 胰蛋白酶／JD)'-之前 ；⋯一：加入 0．2 g胰 ’ 蛋白酶 10 r】1ln后 图 2所示的是 2 ml测活溶液 10 rain内 A 变化的绝对值与酶量之间的关系 该方法 较为灵敏，可以检出 1 ng的胰蛋白酶，随着 反应时间的延长，可检出的胰蛋白酶量还可以 更低 图 3所示的是 0．1 g胰蛋 白酶在室温 下水解 TAME的时间过程，从图 3可以看 出， A 的减少与时间呈 良好的线性关系 在对照 反应 中加入 0．毗 mmol／L HC1发现，每加入 lO nmo|的氢离子使得溶液在 555 nm 处的光 吸收值降低 0．1个单位，由此引起的溶液 pH 值的改变是使用普通 pH计所无法检测的 图 2 单位时间内 A娜 的变化与胰蛋白酶用量之 间的关系 反应时间：10 mtn；反应温度 ：室温 l 3 = 1 2 1 1 1 0 0 2 4 6 8 10 t／mln 图 3 0．1 p,g胰蛋 白酶对 TAME的时程水解图谱 反应温度 ：室温 由于 TAME 为胰 蛋白酶的专一性 底物， 因此该方法具有高度的专一性 使用各 5 g 的胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及嗜热菌 蛋白酶进行对照实验，在 1 h内A 555基本没有 变化． 与 TAME活性胶方法相 比较，本方法操 作简单、迅速，并且可以对酶的活性进行定量 测定．与经典的 BAEE测定方 法 J比较，苯 酚红方法的灵敏度明显提高，1个 BAEE单位 相当于 150个 苯酚 红 单位 ；与考 马 氏亮 蓝 G250．酪蛋白测定方法 相 比，本方法的灵敏 度也有所提高，而且不受其他蛋白酶类的干扰 维普资讯 http://www.cqvip.com 7z ) 生物化学与生物物理进展 Prog．Bio~hem．Biophys． ·553 由于该方法实际上是通过将蛋白酶水解底 物反应与酸碱中和反应相偶联，并以指示剂在 特定波 长下的光吸收值的变化作为测定的指 标，因此通过选择不同的指示剂以及使用其他 合适的底物，可以测定其他种类的蛋白酶类的 活性，从而建立一系列 指示剂为基础的酶活 性测定方法 参 考 文 献 1 Evnin L，Craik C S E~yme Engineefing．1988，542 61 2 Rick W In：Bergmeyer H U ed Methods of Enzymatic ,ama]vsis, New York and Londoa Acadetrdc p⋯ 1963 807 3 周慧， 鲁治斌．齐 杰等 生物化学杂志 1994 lo (5)：630 巨五互 !Departltlen￡of Bi。ch⋯ l一匕 一 istry and J${o／ecular Biology， College of Life Sciences， Peking University， Bei3ing 100871， China)． Abstract TAME (N 一P—tosy[一L—arginine methy[ester)is a specific substrate of trypsin N。一P—tosy[一L—arginine is released fmm TAM E after tryptic hydrolysis， which reacts with NaOH in the assay mixture and causes the decrease of pH Using phenol red as the indicator，the pH change of the solution can he monitored by the decrease of the ahsorbance at 555 nm ． The decrease of A555 is directly proportiona[to the amount of trypsin with a linear range of 0．001～ 0．3 mg The method is very convenient to use， highly sensitive and specific Key words trypsin，assay，TAM E，pheno[red 邻二氮菲．Fe2 氧化法检测 H2O2／Fe2 产生的羟自由基 金 粤 蔡亚欣1 金荧 越 辉 ^ 、石暖再 i 究中心，北京1[H]029) L、 ／l 摘要 检测H2 ／Fe2所产生羟自由基的新方法 羟自由基氧4．g反应后，邻二氯菲 Fe2的A t I 明显下降，且 △A 53 与邻二氯菲，FeSO4及 H2 呈量效关 系，随反应时间延长，△J4 536依幂函数规律 上升 此洼试验结果表明．甘露醇，抗坏血酸及硫脲清除羟自由基作用呈明显的量效关系 煳词 ，型 振 ． 馥 ． ——————一 ——————一 11、． Fn【l’．’t J ＼ ’ 羟自由基是体内最活泼的活性氧，可介导 理，我们建立了以 4536变化反映羟 自由基氧 许多病理变化 目前，离体检测羟自由基有电 子 自旋共振法 ，化学发光法 ，细胞色素 c 氧化法l3 等 这些方法或仪器 特殊，或试剂 昂贵，使其应用受到限制 H2O ／F 体系可 通过 Fenton反应产生羟 自由基_4 J．邻二氮菲一 Fe2 水溶液被羟 自由基氧化为邻二氮菲．Fe3 后，其 536 nnl最大吸收峰消失 根据上述原 化作用的比色测定法，该法设备简单，试剂便 宜，操作简便，适于广泛使用． 1 材料与方法 设备：7230型分光光度计 试剂 ：全部为国产分析纯 收 稿 日期 ：1996．04．30．修 回 日期 ：1996．06—2 维普资讯 http://www.cqvip.com