血红蛋白的提取

实验四 血红蛋白的提取 1、 血红蛋白的制备： 取新鲜抗凝全血5ml（可先将柠檬酸三钠用水溶解后再取鸭血），于2000r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液，重复1～2次，至上清液清完为止。于血球中加入10倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，以棉花过滤，即得血红蛋白溶液。 仪器及试剂：离心管（4.2×10 ，10支） 试剂瓶（500ml 2支；250ml 2支） Nacl（1瓶） 柠檬酸钠（1瓶） 2、 溴酚蓝溶液的制备（1mg/ml）: 称25mg溴酚蓝溶于25ml蒸馏水中即可。 仪器及试剂：溴酚蓝（1瓶） 滴瓶（5个 50ml） 3、 洗脱瓶： 用锥形瓶（下有开口）作洗脱瓶。 仪器及试剂：锥形瓶 量筒（10ml 50ml） 4、 洗脱液： 称46.4g，溶于4000ml，即得0.2mol/L Nacl溶液。 仪器及试剂：烧杯 电子天平 容量瓶 玻璃棒 操作步骤： 1、 凝胶溶胀 置蒸馏水中于室温下溶胀3h，沸水浴1h再用蒸馏水洗涤几次，再次将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。【G-75以下称硬胶；G-75以上的称软胶（吸水量大，膨胀形态柔软易变）；G25:吸水量为2.5ml/g； G10-50:分离肽及脱盐；G75-200：各类蛋白质，全渗透。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG示，G值越小，交联度越大，吸水性越小】 2、 装柱 采用脱盐柱，即将无机盐或其他物质（溴酚蓝）与大分子物质（血红蛋白）分离。 A, 将层析柱垂直固定在铁架台上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等； B,用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱； C,当到达所需凝胶高度时（约17ml），立即关闭下口，使凝胶完全沉降； D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝好后用洗脱液流过。 3、上样 先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶液（或吸取，但千万溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制流速，使样品渗入凝胶内。 本实验样品为：血红蛋白和溴酚蓝各5滴混匀，用滴管滴加在表面（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流下），加至凝胶面时，关闭下口，完成上样，再加一层洗脱液（3～5cm）。 4、洗脱 5、凝胶回收