结节性硬化症TSC1基因编码外显子全长的突变检测与分析

�论著 � 基金项目:福建省重大科技项目 ( 2002Y001 ) ;福建省卫生厅科 研基金 ( 97019) 作者单位: 350005福州,福建医科大学附属第一医院神经内科 通信作者:王柠, Em ai:l nw ang63@ yahoo. com. cn 结节性硬化症 TSC1基因编码外显子 全长的突变检测与分析 方玲 � 吴志英 � 王柠 � 林珉婷 � 慕容慎行 � � 摘要!� 目的 � 研究结节性硬化症 ( TSC ) TSC1基因所有编码外显子的基因突变特征和多态现 象。 � 采用聚合酶链反应 �单链构象多态 ( PCR�SSCP)技术结合 DNA测序对来源于 21个家系的 23例 TSC患者、22名父母及 60名健康对照进行 TSC1基因编码外显子全长的基因突变和多态的检 测。结果 � 共检测出 10种异常的 SSCP带型, 经 DNA测序后证实为 4种突变和 6种多态, 突变包括 2种移码突变 ( 352insA和 2332 insT )、1种剪接突变 ( 729+ 1G∀ T )、1种无义突变 Ty r761Te r ( 2504C∀ A) ,其中 2332 insT, 729+ 1G∀ T及 Tyr761Ter为新型突变。以上突变均见于散发型患者, 突变频率为 4 /15。6种多态包括 4种单核苷酸多态 ( 347A∀ C, 1186T∀ C, 1556A∀ G, 1947T∀ C), 1种内含子区多 态 ( 2218+ 71de lAG )及 1种 3#UTR区多态 ( 3716+ 36T∀ C), 其中 3种为新多态。结论 � 本组结果对 研究我国 TSC1基因突变特征提供了重要资料, 未发现 TSC1基因突变热区, 且 TSC1基因突变多见于 散发型患者, 提示中西方 TSC1基因突变可能存在差异。 关键词!� 结节性硬化症; � 蛋白质类; � 外显子; � 突变; � 多态现象,单链构象 M utation analysis of TSC1 gene in Ch inese patien ts w ith tuberous sclerosis com p lex� � FANG L ing, WU Zh i�y ing, WANG N ing, LIN M in�ting, MURONG Shen�x ing. D epartmen t of N eurology, The F irst A ff iliated H o sp ital of Fujian M edical Univers ity, Fuzhou 350005, China Corresp onding author: WANG N ing, Email: nw ang63@ yahoo. com. cn Abstract! � Objective � To identify TSC1 gene muta tions by sing le stranded conform ation po lymo rph ism ( SSCP ) ana lysis and direct sequenc ing.M ethods� To la lly 23 patients w ith con firm ed c linical m an ifestations o fTSC and 22 parents o f the patients com ing from 21 TSC fam iliesw ere inc luded in the study. In to ta,l w e stud ied 6 fam ilial cases and 15 sporad ic cases. A tota l o f 10 var iants w ere detected by SSCP. R esu lts� After be ing confirm ed by DNA direct sequenc ing, mu tations w ere iden tified in 4 /15 sporad ic cases, in wh ich therew ere 2 sm a ll insertions ( 352 insA and 2332insT ), 1 nonsensem utation ( Tyr761Ter) and 1 splicem utation ( 729+ 1G∀ T ) . A ll o f them led to a prem ature stop codon and resulted in a truncated prote in. H ow ever, w e d id not find muta tions in cases from 6 sm a ll fam ilies, but found 6 po lym orphism sw hich inc luded 3 nove l po lymo rph ism s. O f the 6 TSC1 po lym orphism s, four w ere sing le nucleotide po lymo rph ism ( SNP ), 347 A∀ C , 1186T∀ C, 1556A∀ G, 1556A∀ G, resulting in silen t changes, in wh ich one w as intron ic ( 2218+ 71de lAG ) , and one w as in the 3#UTR( 3716+ 36T∀ C) . Conc lu sion� Our study show s no muta tiona l hotspot in Ch inese patients, but im proves our know ledge in m utation character istics o f TSC1 gene in the Chinese. Keywords!� Tuberous sc lerosis; � P ro teins; � Exons; � M utation; � Polym orph ism, sing le�stranded conform ation � � 结节性硬化症 ( tuberous sc lerosis complex, TSC)是一种常染色体显性遗传性神经皮肤综合征, 是以多种器官的组织缺陷和错构瘤为特征的系统性 疾病 [ 1] , 主要临床特征为面部皮脂腺瘤、癫 及智 能减退。由于发现与 TSC相关的错构瘤细胞出现 杂合性丢失现象,因而认为 TSC基因是肿瘤抑制基 因, 引起众多学者对该基因研究的兴趣 [ 2, 3]。目前 TSC根据其致病基因定位的不同分为 TSC1型 ( 9q34. 3)与 TSC2型 ( 16p13. 3)。TSC1基因包含 23 个外显子,其中第 1和第 2外显子为非编码区, 第 3 至第 23外显子为编码区,从第 222个核苷酸 ( ATG ) �108� 中华神经科杂志 2005年 2月第 38卷第 2期 � Chin J Neuro,l F ebruary 2005, Vo l 38, No. 2 起开始转录,其基因产物为 hamart in。TSC2基因有 41个外显子,其基因产物为 tuberin。我们前期曾对 TSC1基因外显子 4进行研究并报道了 1个 352 insA 新型插入突变和 347A∀ C罕见的新单核苷酸多 态 [ 4]。现我们应用 PCR�SSCP结合 DNA测序, 对 1997到 2000年就诊的来源于 21个家系的 23例患 者和其父母 22人进行了 TSC1基因 21个编码外显 子 ( 3~ 23)的突变检测,报道如下。 资料和方法 一、研究对象 1. 对照组:无亲缘关系的健康对照 60名,其中 男 40名,女 20名,年龄 40~ 60岁, 来自本院健康体 检人员,经遗传咨询证实家族中无 TSC患者及其他 遗传病史。 2. 病例组: 21个 TSC家系共有 23例确诊患者, 分别来自福建、江西、浙江、江苏、山东等省, 为本院 1997∃ 2000年就诊的患者, 均为汉族,其中男17例, 女 6例,起病年龄 3个月至 20岁。这些患者均符合 1998年结节性硬化症委员会制定的诊断 [ 5 ]。 其中 6例患者有家族史, 患者的一级亲属至少有一 人亦患 TSC, 这种家系约占全部家系的 28. 6% ; 无 明显的家族遗传史为散发型患者, 这种家系占所有 家系的 71. 4%。研究对象还包括来自 21个家系的 22名父母。 二、研究方法 1. 基因组 DNA的提取: 抽取上述研究对象外 周静脉血 2 m ,l枸橼酸 �枸橼酸盐�葡萄糖 ( ACD )抗 凝,分离白细胞后用 DNA抽提试剂盒 ( Amersham公 司 )抽提基因组 DNA。 2. 引物合成与聚合酶链反应 ( PCR)扩增: TSC1 基因第 15和 23号外显子基因片断长 559 bp和 520 bp,分别合成 3对引物,其余外显子片断长 44~ 188 bp,各合成 1对引物, 共 25对引物,引物序列参照文 献 [ 6], 由上海生工公司 ( Sangon)合成。 PCR反应 采用 50 �l体系, 含基因组 DNA 250 ng, dNTP各 200 �mol/L, M gC l2 1. 5 mmo l/L, 上下游引物各 0. 25 �mo l/L, T aq酶 2. 5 U及其 1 %缓冲液。 dNTP及 Taq酶均由生工公司提供。采用美国 App lied B iosystems公司 GeneAmp 9700PCR自动扩增仪扩 增。PCR反应条件为 94& 预变性 2 m in,然后进行 30次循环,包括 93& 变性 45 s,退火 45 s, 退火温度 因外显子不同而异 ( 56~ 60& ) , 72& 延伸 1 m in,最 后于 72& 延伸 5m in。 3.单链构象多态 ( SSCP)银染分析: 将 PCR扩 增产物 5 �l与等体积加样缓冲液 (含 95%甲酰胺, 20mmol /L EDTA, 0. 05%二甲苯蓝及 0. 05% 溴酚 蓝 )混合, 98& 变性 5 m in, 冰浴骤冷。上样于 8. 0% 非变性胶 (含 5%或 10%甘油的 49∋1聚丙烯酰胺凝 胶 )电泳,采用 4 & 或 20 & 温度, 200 V或 500V电 压电泳 4~ 20 h。电泳结束后, 用常规方法固定、银 染、显色,拍照分析结果,并将凝胶真空抽干保存 [ 7]。 4. DNA序列分析: 对 SSCP条带迁移异常者进 行 DNA测序以证实其变异的性质、位置和形式。将 PCR产物以 Q iaqu ick柱 ( Q iagen公司 )过柱纯化后, 作为测 序模板, 浓度为 50 ng /�l。采 用 AB I PRISM TM 377自动测序仪进行 DNA序列分析。 结 果 1. TSC1基因突变检测结果: TSC1基因全长编 码外显子的突变筛查结果共检出 4种基因突变形式 ( 1), 其中 3种为国际上未报道过的新突变,分别 为插入突变 2332 insT,无义突变 Tyr761Ter( 2504C∀ A )和剪接突变 729+ 1G∀ T (国际 G enbank注册号 为: AF251792, AF311941, AF323439)。上述突变的 测序图见图 1。还有一种突变我们前期已报道 [ 4]。 上述突变在 60名健康对照中均未检测到。 表 1� TSC1基因突变 位置 核苷酸改变 � 氨基酸改变 突变类型 exon4* 352 insA 44Asn�FS�Ter early at 69 移码突变 exon6�in tron6 729+ 1G∀ T 非编码区 剪接突变 exon17 2332 insT 704Leu�Ter early at 705 移码突变 exon18 2504C∀ A Tyr761Ter 无义突变 � � 注: * 前期报道 [ 4] 2. TSC1基因多态位点检测: 在 TSC1基因全长 编码外显子区的检测中, 我们发现了 6种多态现象 (表 2)。其中 3种多态现象为首次报道, 分别为 1947T∀ C, 2218+ 71de lAG和 3716+ 36T∀ C。我们 还检测到 2种多态形式与国际上的报道相同, 分别 为 Met322Thr ( 1186T ∀ C ) [ 6, 8�10] 和 G lu445G lu ( 1556A∀ G ) [ 6, 8�10]。另外, 1个罕见的单核苷酸多 态 347A∀ C我们前期已报道 [ 4 ]。 讨 论 在本研究中 , 我们对来自 21个家系的 23例 �109�中华神经科杂志 2005年 2月第 38卷第 2期 � Chin J Neuro,l F ebruary 2005, Vo l 38, No. 2 每格图上幅为正常序列,下幅为基因突变或多态序列, 箭头所示为基因突变或多态位点,其中图 1947T∀ C提供的测序图为反义链,其正义链的序列在该位点为 T∀ C 图 1� TSC1基因编码外显子区基因突变与多态测序图 表 2� TSC1基因的多态现象 位置 核苷酸改变 氨基酸改变 等位基因频率 健康人群 ( n= 120) 患者 ( n= 42) 患者父母 ( n= 44 ) exon4* 347A∀ C V al42Val 0�0 0�0 2. 3 exon10# 1186T∀ C M et322Thr 5. 8 7. 1 6. 8 exon14# 1556A∀ G Glu445Glu 6. 7 7. 1 9. 1 exon15 1947T∀ C Leu576Leu 4. 2 4. 8 4. 5 int ron15 2218+ 71delAG 非编码区 1. 7 2. 4 0�0 3#UTR 3716+ 36T∀ C 非编码区 0�0 0�0 2. 3 � � 注: * 前期报道 [ 4] , # 国外已报道 [ 6, 8�10] TSC患者进行了 TSC1基因全长编码区的突变检测, 共检测到 4种突变和 6种多态。这 4种突变仅见于 患者, 并导致终止密码子提前出现, 而使 TSC1基因 编码的蛋白 hamartin截短, 故考虑这 4种突变均为 致病性突变。 3种新突变中, 2332 insT突变是由于 2332位置插入一个 T碱基, 导致在转录和翻译时阅 读框发生移位,产生移码突变,使原 704位氨基酸由 酪氨酸变为亮氨酸, 而邻近的 705位氨基酸由谷氨 酸变为终止密码子; 729 + 1G ∀ T 是剪接突变; Tyr761Ter ( 2504C∀ A )为编码 761位氨基酸的第 3 个碱基 C变为 A,使原编码酪氨酸变为终止密码,以 上突 变 均 导 致 TSC1 蛋 白 hamartin截短, 从而翻译被提前 终止。由于 TSC基因为肿瘤抑 制基因,上述突变可改变其基因 产物 hamart in正常结构,使其抑 制肿瘤功能丧失,从而导致错构 瘤产生。Young等 [ 9] 和 D abora 等 [ 11]均报道有遗传家族史患者 可出 现 Tyr761Ter 突 变, 是 2504C∀G所致。与国外报道不 同的是我们在外显子 18发现 2504C∀ A改变, 该突变也导致 Tyr761Ter, 该患者为一散发型 患者, 由于外显子 18所编码的 氨基酸片段是 TSC1基因产物 hamartin 与 TSC2 基 因 产 物 tuberin相结合而起作用的关键 部位, 因而外显子 18的基因突 变可能严重影响 hamart in发挥 正常功能而致病。 目前 TSC患者基因突变检出率为 60% ~ 80%, 从 H um an GeneM utation Database提供的数据,已报 道的 TSC1基因突变有 133种, TSC2基因突变有 357 种。TSC1基因突变形式多为小片段插入、缺失或无 义突变。并发现有家族遗传史的 TSC患者中 TSC1 突变与 TSC2突变各占 50%,而在占 TSC患者 70%的 散发型患者中, TSC1突变约 10%, TSC2突变约 60% ~ 70% [ 6, 9�11]。我们仅在散发型患者中检出 4种 TSC1突变,占 26. 7%, 高于国外的统计数据,但在 6 个有家族史 TSC家系中并未检出 TSC1突变患者, 这与国外的报道不同。由于 SSCP筛查突变的阳性 率为 63% [ 12] , 影响突变的检出率; 其次, 某些突变 可能存在于非编码区,如内含子区域、启动子区域或 其他调控区域, 而且 TSC存在体细胞嵌合现象, 约 10% ~ 25% ,这在一定程度上会影响基因突变的检 测 [ 13]。 当碱基变异仅产生同义突变、氨基酸性质没有 改变、碱基变异存在于正常染色体上或与肯定的致 病性突变并存于同一条染色体上时, 这种碱基变异 应考虑为多态现象。我们检测到 TSC1基因的 6种 多态,其中 3种为此次新发现的多态, 2种与国际报 道相符, 1种前期已报道。其中, 2218 + 71de lAG位 于 15号内含子区,其 SSCP构象异常在 TSC患者和 �110� 中华神经科杂志 2005年 2月第 38卷第 2期 � Chin J Neuro,l F ebruary 2005, Vo l 38, No. 2 健康人群均检出,考虑为多态现象; 1947T ∀ C位于 15号外显子区, 该核苷酸改变未引起氨基酸变化 ( Leu576Leu), 且 SSCP构象异常见于 TSC患者和健 康人群,故为 1种单核苷酸多态现象 ( SNPs); 3716 + 36T∀ C仅见于 1例患者 (该患者携带 2504C∀ A )之父,由于其位于 3#UTR区,且父亲无 TSC临床 表现, 故考虑为罕见多态。Met322Thr与 1556A∀ G 在健康对照中出现的频率分别为 10. 6%与 12. 6% , 国外报道, M et322Thr的频率 0. 9% ~ 15�0%, 1556A ∀ G的频率 5. 8% ~ 16�0% [ 6, 8�10] ,两者结果相似。 我们对 TSC1基因所有编码外显子进行基因突 变筛查后发现, TSC1突变在患者中所占的比率较 少,基因突变的位点和形式各异, 无明显热区分布。 我们将进一步对更多患者进行 TSC1和 TSC2基因 进行突变的筛查, 总结我国 TSC基因突变特征, 以 便将来能进行该病的基因诊断并探索治疗方法。 参 考 文 献 1 Torres VE, B jorn sson J, K ing BF, et a.l Ext rapu lmonary lym ph� angiole iom yom atos is and lym phangiom atou s cysts in tuberou s sclerosis com p lex. M ayo C l in Proc, 1995, 70: 641�648. 2 The E urop ean Chromosom e 16 Tuberous Scleros is C onsort ium. Id ent if icat ion and ch aracterizat ion of the tuberou s scleros is gene on ch rom osom e 16. Cel,l 1993, 75: 1305�1315. 3 van S legtenhorstM, deH oogtR , H ermansC, et a.l Id ent ificat ion of the tuberous sclerosis gen e TSC1 on chromosom e 9q34. Science, 1997, 227: 805�808. 4 方玲,吴志英,王柠,等.结节性硬化症基因 ( TSC1)外显子 4基因 突变与多态的研究. 中华医学遗传学杂志, 2001, 18: 448�451. 5 Roach ES, Gom ez MR, N orth rup H. Tuberous scleros is com p lex consen sus con ference: revised clin ical diagnost ic criteria. J Ch ild N euro,l 1998, 13: 624�628. 6 Jones AC, Dan iells CE, Sn ell RG, et a.l M olecu lar genetic and phenotyp ic an alysis reveals differences betw een TSC 1 and TSC2 associated fam ilial and sporad ic tuberous sclerosis. H um M olGen et, 1997, 6: 2155�2161. 7 王柠,吴志英,慕容慎行,等. 经 DNA测序证实的肝豆状核变性 基因突变热区的研究. 中华神经科杂志, 1998, 31: 20�23. 8 N i ida Y, Law rence�Sm ith N, B anw ell A, et a.l Analysis of both TSC1 and TSC2 for germ l inem u tat ions in 126 un related patientsw ith tub erou s scleros is. H um Mu tat, 1999, 14: 412�422. 9 Y oung JM, BurleyMW, Jerem iah SJ, et a.l A m utation screen of the TSC1 gene reveals 26 p rotein trun cating mu tat ion s and 1 sp lice site m utation in a p anel of 79 tuberous scleros is pat ien ts. Ann Hum G enet, 1998, 62: 203�213. 10 van S legtenh orst M, V erhoef S, Tem pelaars A, et a.l Mu tat ion al spectrum of the TSC1 gen e in a cohort of 225 tuberous scleros is com plex pat ien ts: no eviden ce for genotype�phenotype correlation. J M ed Genet, 1999, 36: 285�289. 11 D abora SL, Jozw iak S, F ranz DN, et a.l M utat ional analysis in a cohort of 224 tuberou s sclerosis p at ien ts ind icates in creased severity of TSC2, compared w ith TSC 1, d isease in m u ltip le organs. 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(收稿日期: 2004�03�05 ) (本文编辑 :郑晴 � 包雅琳 ) (上接第 94页 ) 性意识障碍, 伴随癫 发作频率增加, 脑电图出现弥漫性慢 波和癫 样波发放增加, 临床症状在停用丙戊酸后短期内恢 复。所以, 我们考虑该患者病程中新发的脑功能障碍与肿瘤 的关系更为密切。 颅内肿瘤以癫 发作为首发症状并不少见,此类患者肿 瘤多发生于额颞叶皮质下, 而松果体区肿瘤以癫 发作首发 临床少见。 Fbr ice等 [1]曾报道 8例在发生颅内肿瘤之前具 有长期癫 发作病史的患者, 4例肿瘤位于皮层, 最初征象 是癫 的发作形式改变,或出现新的临床症状和体征。另外 4例肿瘤位于脑膜或皮质下, 肿瘤的发生对癫 的病程基本 无影响。本例患者在癫 病程第 22个月时出现了新的症状 和体征, 复查头颅核磁,证实发生颅内松果体区肿瘤,发现肿 瘤之前, 癫 病程共 23个月, 其间没有进行定期的影像学检 查, 故不知肿瘤最初的发生时间, 发现肿瘤时, 病情已经较 重。此病例提示我们在临床工作中, 癫 患者的癫 发作形 式改变或出现新的临床症状时应该注意其出现颅内器质性 病变的可能,及时行头颅影像学检查明确诊断, 特别是松果 体区等一些部位深在的肿瘤, 不易早期发现, 所以对癫 患 者定期行头颅影像学检查,明确是否同时伴发颅内器质性病 变是很必要的。 参 考 文 献 1 Fbrice B, Joseph R, P ierre G, et a.l Developm en t of in tracran ial tum ors in pat ien tsw ith long�stand ing preexist ing ep ilepsy. E pilepsy, 1995, 8: 286�294. (收稿日期: 2004�10�27 ) (本文编辑:包雅琳 ) �111�中华神经科杂志 2005年 2月第 38卷第 2期 � Chin J Neuro,l F ebruary 2005, Vo l 38, No. 2