3DMAX实例教程：设置香水瓶彩色玻璃材质

第四部分目的基因在原核细胞中达与SDS-PAGE鉴定 实验十外源基因的诱导表达 1.目的 了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。 2.原理 外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长,lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖),解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。 3.器材 旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环。 4.试剂 LB培养基(加抗菌素),100mg/ml IPTG,20%葡萄糖 5.实验准备 无菌dd water,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌);牙签(灭菌),摇菌管(灭菌),100mg/ml IPTG (过滤灭菌)(100μl分装,-20?C 保存),100mg/mL氨苄青霉素(过滤灭菌)(100μl分装,-20?C保存)。配制20%葡萄糖(8磅灭菌20分钟,添加至上述LB中,终浓度为0.2%)。 6.操作步骤 (1)晚上9:00接种。在超净工作台中接种含有pET-his NK重组载体的菌株,培养 于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基(含抗菌素Amp 120μg/ml)的摇菌管中, 慢速70--90转/分钟30?C摇菌过夜。 (2)至第二天上午8:30 OD600约为0.5,加IPTG至100μg/ml,150--170转/分钟 37?C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。 (3)4000rpm离心15min弃掉上清液,收获菌体,走SDS—PAGE电泳。菌体也 可放在-20?C以下保存备用。 (4)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验。 注:有兴趣的同学可以向教师索取一个温度诱导型的高表达科研菌株,进行诱导表达实验,以便于在SDS-PAGE胶上更清晰地观察外源基因的大量表达。操作如下: (1)在超净工作台中接种工程菌株至1.5ml LB培养基(含抗菌素Amp)中,28?C摇 过夜。 (2)取300ul菌液加入3ml LB培养基(含抗菌素Amp)中,28?C摇2-3h。 (3)将温度调至42?C摇4-5h,诱导表达。 (4)10000rpm离心1min弃掉上清液,收获菌体,加水至50μl。 (5)菌体重悬后与等量2×蛋白加样缓冲液混合,混匀,煮沸5min,走SDS—PAGE 电泳分析(表达蛋白分子量为42.5kDa)。 7.思考 (1)IPTG的作用原理是什么? (2)为什么要增加抗菌素的用量? 实验十一SDS-PAGE检测表达蛋白 1.目的 学习SDS-PAGE的基本操作,学会用SDS-PAGE检测蛋白。 2.原理 蛋白质在加热变性以后与SDS结合,带上负电荷,在电场的作用下,向正极移动,结果按分子量大小排列在胶板上,含量多的蛋白带纹粗。 3.器材 旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,超声波破碎仪,电磁炉,电泳仪,垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等,摇菌试管,三角烧瓶,接种环,饭盒。 4.试剂 SDS(十二烷基磺酸钠),Acr(丙烯酰胺),Bis(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺),Tris(三羟甲基氨基甲烷),甘氨酸,盐酸,Aps(过硫酸氨),TEMED(四甲基乙二胺),蛋白分子量(97.4,66.2,43,31,20.1,14.4 kDa),溴酚蓝,甘油,冰醋酸,乙醇,β-2-巯基乙醇,考马斯亮蓝R250,甲醇,乙醇。 5.实验准备 1.0mol/L Tris HCl,pH8.8(4?C保存);0.5mol/L Tris HCl,pH6.8(4?C保存);10%SDS (室温保存);30%Acr/Bis(30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL,4?C保存);10%Aps (-20?C保存);2?上样缓冲液(0.5mol/L Tris HCl,pH6.8 2mL,甘油2mL,20%SDS 2mL, 0.1%溴酚蓝0.5mL,β-2-巯基乙醇1.0mL,dd water 2.5mL,室温存放);5?电泳缓冲液(Tris 7.5g ,甘氨酸36g,SDS 2.5g,加dd water至500mL,使用时稀释五倍);考马斯亮蓝染色液(考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸,用dd water定容至100mL);脱色液(95%乙醇:冰醋酸:水= 4.5:0.5:5,体积比); 6.操作步骤 (1)将表达后的菌体与2?上样缓冲液按1:1混匀于微量离心管中。 (2)用超声波破碎仪脉冲10次,每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定 要将超声波探头插入容液底部,在溶液表面或上部时容易起泡! (3)将上述微量离心管插入水漂中,放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立 即插入冰中。(可在-20?C冰柜中保存)。 (4)按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住 (不能夹玻璃的上端以免以免夹断玻璃的突出段!)。插入梳子后在玻璃上距离 梳子齿底部1cm的地方做一个标记。 (5)配制10%分离胶。按顺序和量(注意体积单位!)取下列溶液混在一个50mL 的小烧杯中(注意Tris为 pH8.8): Acrylamide-bis 3.96 mL 1M Tris PH8.8 4.38 mL d.d Water 3.432 mL 10% SDS 118.8 μL TEMED 9.9 μL 10%APS 118.8 μL (6)加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后,立刻缓缓倒入玻璃夹缝 中,直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中,倾斜放置。然后 在上部用1000μl微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满dd water(尽可能 不破坏下面的胶液)。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏 水,并倒置玻璃尽可能将水倒尽。 (7)配支持胶。按顺序和量(注意体积单位!)取下列溶液混在一个50mL的小烧 杯中(注意Tris为 pH6.8): Acrylamide-bis 0.675 mL 0.5M Tris pH6.8 0.563 mL dd water 3.165 mL 10% SDS 45 μL TEMED 7.5 μL 10% APS 45 μL (8)加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后,立刻倒入玻璃夹缝中, 液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子,静置约20min。烧杯中剩下的 溶液倾斜放置直到溶液凝固。(此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜)。 (9)小心拔出梳子以后,用注射器针头(剪平尖部)吸取梳子齿形成的加样槽中的 水,并修平加样槽底部的胶面。 (10)选取几个形态好的加样槽,在一张纸上做好对应的标记,用微量移液器在侧面 的一个加样槽中加入20μL 蛋白分子量,其它槽中加入10~20μL自己制作的样 品。 (11)加完样品后,再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳 槽上部倒满电泳缓冲液(约250ml,淹没过加样槽的液面!),电泳槽的下部倒入 一半电泳缓冲液(约180ml)。 (12)接好电极,将电流调至10mA,待溴酚蓝移到分离胶后,在将电流调至18mA, 电泳约2~3h,期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏(泄漏导致液面下降,电流中断)!当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。 (13)在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。 (14)倒掉电泳槽中的缓冲液,取下玻璃,小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬 起(切不可损坏胶!)。用铲子切去上部的支持胶,并把分离胶从玻璃上剥离倒 染液搪瓷盘里(切不可损坏胶!)。 (15)染色2h后,将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液,过夜。 (16)观察脱色后胶里的蓝色带纹,与对照比较或寻找异常粗的带纹,并比较其分子 量(NK蛋白约33kDa),判断是否是预期的基因产物。 (17)清理桌面,写实验报告。