人原发性肺癌癌基因表达研究(1)

人原发性肺癌癌基因达研究 � 赵 建 升 孙 芝 琳 周 青华 伍伫 �华西医科大学生物化学教研室 , 成都 � ��。牡 � �华西医科大学附院胸外科教研室 , 成都� 关触询 人原发性肺疮 , 瘤基因 , 斑点杂交 , 基 因表达 分子生物学的新近发展揭示某些癌基因与人类肿 摘的发生 、发展 、分化密切相关� 目前认为 , 至少有两 大类癌基因 , 即 � �� 家族基因与 �二 家族基因在肺癌 钓病理发生中包重要作用 “ , , ’。 但是有关肺癌基因表 达的研究 , 国内迄今尚未见报道 � 本研究以 � �� 家族基因 �卜 � �� 、� 一� �� 及 � � ‘� ‘� 、 与肺癌关系密切的 � 卜 � � ‘基因及蛋白产物定 位于核内的 。一 �。 。 基因为探针 , 对 �呼例人原发性肺癌 及 � 例正常人肺组织的总 � � � 进行斑点杂交 分 析 , 观察癌基因在转录表达水平的特点 , 为进一步研究肺 癌的发病机理提供依据 , 同时探讨其在临床诊断上的 应用前景 � 扫描结果计算出肺痛总 � � 人相对于正常人肺总 � � 人 表达增强的倍数� 用于提取 � � � 的试剂与器皿均经 。� � � � � � 及高压消毒处理 � 结 果 � � 总 � � � 的纯化与鉴定 用酸性盐酸肌一酚一氯仿 法 ‘� � � 法� 所 提 总 � � � 见表 �及图 � 。 结果表明所提总 � �人 纯度高 , � � � 无降解 , 将 总 � � � 分别溶于 。 � �� �� � 溶液及 � � �肠 � � � 处 理的水中 , 一 �� ℃贮存半年 , 总 � � � 是稳定的 � 农 � � � � � 法制备总 � � � 材 料 与 方 法 � � 正常肺组织及肺病组织标本 正常肺组织及肺癌组织标本由华西医科大学附一 「院胸外科提供 , 均为病理确诊 � 手术标本经液氮冷冻 后 , 置 一 �� ℃ 贮存 � � � 撼基因探针及标记 � �一 � “, 及 “ 一�� �� 基因的重组质粒菌株由中日友 好医院范慕贞教授赠 , � 一 � �� 及 卜�“� 基因的 重 组 质粒菌株由美国� 。 , � 。爪大学 邱政夫教授赠 , � 一� �� 基因的重组质粒菌株由华西医科大学方谦逊教授赠 � 质粒 � � � 按清亮裂解法川制备 , 用 〔。一 , ’� � � � � � �北 京福瑞公司 , 一 � � � � � �� � � � �� , 按缺 口法 , � ’标记 探针 � � � 总 � � � 制备及斑点杂交分析 用酸性盐酸肌 一酚一氯仿法 「” ‘’制备总 � � � 将肺 组织在 �� “ �� � 盐酸呱溶液中制成匀浆 , 用 � � “�� � 醋 酸钠 ��� 的 将匀浆液调至酸性 , 再经酚 一氯仿抽提 , 异丙醇沉淀 , 真空抽干后 , 溶于适量体积的 � � �� �� � 溶液或 � � � � � � � 处理的水中 , 采用紫外吸收法测定 � � 含量 � � � 人 样品经 � � 甲醛变性后 , 按梯度顺 序点于硝酶纤维素膜上 , �� ℃烘烤 �� , 预杂交及杂交 条件按 � �� �。 方法‘, ’� 将斑点杂交结果得到的放射 自显影胶片于日本 �卜� �� 薄层扫描仪上扫描 , 根据 吸吸光比值 ‘�� 通 � ,� � � � 二夕夕 均 提取 �� 例样品的统计结果 � 图 � 总 � � � 的玻脂摘凝胶电泳 �� � 人肺窟总 � � � � � 酵 刁 �� � � , �一 � � 人肺癌总 � �人 �� � 人肺癌总 � � � 在 一 �� ℃ 贮存半年 � � 酵 母 � � � � , � � 总 � � � 溶于 � � �� � � � 中 , , � 总 � � � 溶于。 � �� � � � 处理的水中 � 国家“七五”攻关资助课题 , 一 � , � · 裹 � 人肺右盛基因的农达 基因表达�增强倍数� � 一� � � � � � � 一 � � � � �� � � � � 一� � � 诊断理病号编品样 � � � � � � � � � � � ��� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � �� � � � � � � � � 今 � � � � � � � �� � � � � � � � � �� � � � �, � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 腺癌 鳞癌 腺鳞癌 鳞癌 腺鳞癌 转移癌 鳞痛 鳞癌 腺癌 腺鳞癌 腺癌 鳞癌 鳞癌 腺癌 鳞癌 鳞癌 鳞癌 腺鳞癌 腺癌 肺癌 肺癌 鳞癌 腺癌 鳞庙 鳞癌 不万�二�一丁� 厂万一�万, � � — � � � 一 � � � � �》 � �一� � 咒 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � �一 � � �� 无表达增强 � � � 未检测 � �� � � � 斑点杂交结果 斑点杂交结果见表 � , 部分杂交图谱见图 �一� � ‘一也�� 基因的斑点杂交结果表明 � 在 �� 例原 发 性肺癌组织中� 例转移癌除外� , 有 �� 例�”肠 �表达 增强 ,其中有 � 例 �� � � � , 。一 � �� 基因有过强表达 �图 � �。 � 一 � �� 基因的表达增强占检测病例 的 �� � ‘图 � �� � 一� �� 基因表达增强的例数较少 , �� 例中 仅有 � 例 �� � � � 表达增强�图 � � � � �一 � � � 基因在 � � 困 � 人肺疙总 � � � 斑点杂交结果 探针为 � 一�� � , 0 为正常人肺 N H L , 弓, 8 , l 斗~ 17 2 0 ~ 2 1 , 2 3 ~ 2 5 为人肺癌 H L C 例中有 巧 例 (”肠)(图 5). 卜f。‘ 基因在检测的 l, 例中有 11 例(65% )表达增强 , 其中有 l例 〔H L cl 6) 有过强表达(图 6). 圈 2 人肺痛总 R N A 的斑点杂交结果 探针为 c一 m y c , o 为正常人肺 N H L , l一 7, 2 0 一25 为人肺痛 H L C 讨 论 实验结果发现 , 在 m yc 家族基因中 , 。一In yc 基因 表达增强较多 , 而 L 一 m yc 与 N 一二yc 基因表达增强较 少. 这一结果与 N au L.1等研究小细胞肺癌 m yc 基因 表达的结果相似. 最近的研究表明川 , 正常细胞发生癌变并非一种 . 473 ‘搞基因起作用 , 可能涉及两种或多种癌基因的共同操 纵.与协同作用. 本实验仅观察 到有 咯例对一种癌基因 表达增强 , 有 斗例 卜tn yc 与 K i一 r 。 基因表达同时增 强 , 有 6例对三种届基表达同时增强 , 有 3 例 (H L C牛 , H L c 1 5 , H L c Z I ) 其 c一 m y e 、 L 一 tn 了c 、 区i一 r a s 及 c一f o s 基因表达同时增强. 这一结果提示 , Ki 一r a s 与 。一 m yc 基因的协同作用 ,在肺庙的病理发生中有重要作用 .在 肺癌癌变中 , 不止一种庙基因发挥作用 , 可能是两种或 多种癌基因共同作用. 本实验还观察到有两例(H L C4 及H L cl 6 , 均为鳞癌)分别对 。 一 m yc 和 c一 f 。 ‘ 基因有 过强表达. 癌基因过强表达是否与其病理学特征有关 尚待进一步研究.另外 ,本实验还对 l例肺甲状腺转移 ·疡(H LC 6)迸行了研究 , 结果发现癌基因有较高水平的 表达 , 这一现象提示癌基因与甲状腺癌有密切关系. 已经有许多事实表明L’“一 ” ‘ ,癌基因发挥作用最终 是通过其蛋白表达产物实现的. 目前的 研 究 认 为 , m yc 相关蛋白 p62 在 细胞分裂过程中起重要作 用.r““ 基因表达产物 p21 在传递细胞生长刺激的信号中 起中枢作用. 因此本实验的研究结果提示 , 应 用 抗 p62m那 及抗 PZ lr。‘ 单克隆抗体进一步研究肺癌 免 疫 组化特性 , 并用这些抗体检查庙组织及患者体液 (血 被 、胸水等)中 p62m”及 PZ lr“ 蛋白的存在 , 具有重要 的临床意义和广阔的应用前景。 参 考 文 献 1 Taka.hi T , Y u i e h i o , Y o s h i t a k a S 口 al· C a ”c e r 灵亡‘ 1 9名9 ; 4 9 : 2 68 3 2 B os J L . C a” c e r 左‘ , , 1 9 8 9 : 4 9 : 4 6 8 2 3 侯云德 等. 病毒基因工程原理与方法 . 北京 : 人民卫生 出版社 , 1 9 5 5 : 8 9 咚 R ig b y p W J , D i e e k m a n n M , R h o d e s C e ; a l . J M e l B i o l , 1 9 7 7 ; 1 1 3 : 2 3 7 5 C h o m c z v n s k i p , S a c e h i N . 才 作 a l夕lica l B ioc h e份15多r夕 19 8 7 , 1 6 2 : 1 5 8 6 孙宁 , 孙芝琳 . 生物化学杂志 , 1 9 90 ; 6( 3 ) : 2 38 7 W h i t e B A , B a n c r o f t F C . J B i o l C h ‘m . 1 9 8 2 ; 2 5 7 : 8 5 6 夕 8 N a u M M , L i t t l e C D , C a r n e y D N 亡t a l . N a 才u r e l 9 8 3 ; 3 0 6 : 1 9 4 9 W e in b e r g R A . c a 刀 c e r R 己‘, 1 9 8 9 ; 4 9 : 3 7 1 7 1 0 D o o l i t t l e R F , H u n k a P i l l e r M W D e v a e r S G 巴了 a 了· S c i e 刀c e , 1 9 8 3 ; 2 2 1 : 2 7 5 1 1 D o w n w a r d J , Y a r d e n Y , M a y e s E e 君 a l. N a t 之‘r‘ , 1 9 8 4 ; 3 0 7 : 5 2 1 1 2 S h e r r C J , R e t r e n m i e r C W , S a e e a R o t a l . C e l l , 1 9 8 犷; 4 1 : 66 , [本文于1990年9月2 5日收到, 1 9 9 1年3月2 5日修回1............L..国 .. ”. . ”口一‘ . . 亡一一 , ~ ~ 吧翻 - ‘ 刁一‘. 刀.. . . . .~ ~ .‘暇曰‘. 口. . .. ‘旧. . . . . . r . . .. . . . . . . . . ‘. .. 圈, ‘二. . . . . . . . . . .~ . .. . 曰. 串. . . . . . . ( 上接第 478 页) 裘 , 29 6 健康体检人 的血消 H D L 一 C / T e h 比值勺一叮一相当于 3om g/dL) ; 8川 (相当于 ;om g/dL ), 并使其 与标准管同体积 , 再加入胆固醉试剂 , 。。冈 , 37 ℃ 水.裕 巧 m in 后 , 比色 、计算 ,其结果见表 2.H D L 一 c 的平均回收率为 101.3% , 说明本法的准 ·确度很高. (4) 实际应用价值 为了确定本法的实际应用价 仇 , 我们用本法对 296 名 25 岁至 60 岁的健康人作了 调查 ,测定对象是机关干部 、研究所工程技术人员及工 厂工人 ,其中男性 153 人 , 女性 143 人 , 空腹抽血 , 当日 ;检查 , 其结果见表 3. 在我们侧定的结果中 , 男子组的 H D L 一 C 值略低 于女子组 , 经过统计学处理后均无显著性差 异 (p > 。· 0 , ) , 男女各年龄组之间均无显著性差异 , 与国内有 关文献的报道基本一致. 2 .讨论 用中生生化试剂技术开发公司研制的胆 固醇酶试剂及沉淀剂和测定血清 H D L 一 C 方法 , 并对 方法学进行了验证 , 其精密度和准确度均较满意 , 本法 快速简便 ,特异性强 , 适合常规检验. 参 考 文 献 李健斋 . 中华内科杂志 , 1 9 5 8 ; 1 ( l ) : 1 3 杨昌国. 中华医学检验杂志 , 1 9 7 9 ; 2 ( 2 ) : 8 5 尸. 子 . 略7 4