荧光量子点双功能纳米粒子双标记对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

574 新医学 2011年 9月第 42卷第 9期 磁性／荧光量子点双功能纳米粒子双标记对大鼠 骨髓间充质干细胞生物学特性的影响 颜荣华 王 劲 单 鸿 聂立波 张黎明 论 著 [摘 要] 目的：利用磁性／荧光量子点双功能纳米粒子双标记大鼠骨髓间充质干细胞 (BM— SCs)，探讨其对BMSCs生物学特性的影响。：分离、纯化及培养大鼠BMSCs。制备二氧化 硅 (SiO )包裹的含四氧化三铁 (Fe O )和碲化镉 (CdTe)荧光量子点的磁性及荧光双功能纳 米粒子 Fe 04@CdTe@SiO2，利用铁浓度为25 mg／L的 Fe3O4@CdTe@SiO2双标记 BMSCs，未标 记的 BMSCs作为对照组。采用细胞计数 (CCK-8)试剂盒检测 BMSCs细胞毒性和增殖能力，台 盼蓝拒染测细胞活力，成骨、成脂诱导检测细胞多向分化能力，评价双标记对 BMSCs生物学特 性的影响。荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察诱导分化后Fe 04@CdTe@SiO：双标记情况。结果： 荧光显微镜下可见双标记组细胞 内 Fe O @CdTe@SiO 纳米粒子显示为红色荧光，荧光和磁性双 标记率均达到90％以上。Fe 0 @CdTe@SiO2双标记后细胞存活率为 (94±5)％。Fe3O4@CdTe @SiO，对 BMSCs无明显细胞毒性，对 BMSCs的成脂、成骨分化潜能无明显影响。结论：磁性／ 荧光量子点双功能纳米粒子 (Fe O @CdTe@Si02纳米粒子)双标记对大鼠 BMSCs安全有效， 对 BMSCs的生物学特性无明显影响，有望为 MRI和光学成像活体示踪 BMSCs提供技术基础。 [关键词] 间充质干细胞；荧光；量子点；超顺磁性氧化铁；标记；多向分化 Biological characteristics of rat bone mesenchymal stem cells after magnetic／luminescent quantum dots bi- functional nanopa~icles labe~ng Ⅳ Rong—hua。 ， WANG Jin ，SHAN Hong ，NIE Li—bo ，ZHANG Li-ming ． 1 Laboratory of Molecular Imaging，Department of Radiology， e Affiliated Hospital，SUN Yat—sen Unive~i— ty，Guangzhou 510630，China；2 Institute ofPolymer Science，School of Chem~tu and Chemical Engineering，SUN Yat．sen University，Guangzhou 5 10275，China； Corresponding author [Abstract] Objective：To evaluate the safety of magnetic and luminescent quantum dots bifunctional nanopa~i— cles dua1．1abeling in rat bone mesenchymal stem cells(BMSCs)．Methods：Rat BMSCs were isolated，purified， and expanded． Magnetic／luminescent bifunctional nanoparticles(Fe3 O4@CdTe@SiO2)，were prepared by simul- taneous encapsulation of Fe3 O4 and CdTe quantum dots with silicon dioxide(SiO2)．Subsequently，BMSCs were incubated with the Fe3 O4@ CdTe@ SiO2 nanopartieles with iron concentration of 25 mg／L．The viability，cytotoxici- ty and proliferation activity of dual—labeled BMSCs were evaluated with CCK一8 and trypan blue stain exclusion，re— spectivelv．Muhilineage differentiation potential of dua1．1abeled BMSCs was assessed by induced osteoblast and adi— pocyte differentiation．Intracellular fluorescence and iron were also examined with microscopy and prussian blue staining after induced differentiation．Results：Intracellular red fluorescence dots，representing Fe3 O4@ CdTe@ SiO，were observed via fluorescent microscopy．Rat BMSCs were effectively dual—labeled with approximately 90％ efficiency．Viability and proliferation activity of the F。3 O4@ CdTe@ SiO2-labeled BMSCs was unaltered，compared with th0se 0f the unlabeled cells． Meanwhile．multilineage differentiation capacity was conserved in labeled BM— SCs．Conclusion：Fe3 04@ CdTe@ SiO2 magnetic／luminescent bifunctional nanoparticles are effective and safe for dua1．1abeling of rat BMSCs，without causing significant effects on the biophysical properties of BMSCs． DOI：10．3969／g．issn．0253-9802．2011．09．006 基金项目：国家自然科学基金委员会一广东省人民政府 自然科学联合基金 (U1032002)；广东省自然科学基金项目 (10151008901000188) 作者单位：1中山大学附属第三医院放射科分子影像学实验室 (510630)；2中山大学化学与化学工程学院高分子研究所 (510275) 通讯作者 新医学 2011年 9月第42卷第 9期 575 [Key words] Mesenchymal stem cells；Quantum dots；Superparamagnetic iron oxide；Labeling；Muhilineage differentiation 1 引 言 近年来，MRI和活体动物体内光学成像等分子 影像学技术越来越多地应用于细胞标记后的活体示 踪。MRI空间分辨率高，以超顺磁性氧化铁纳米粒 子 (Superparamagnetie iron oxide，SPIO)标记干细 胞，是干细胞移植后 MRI活体示踪的常用手段。 而活体动物体内光学成像则具有敏感度高的优点， 以碲化镉 (CdTe)为代的荧光量子点是一类发 展迅速的新型荧光纳米材料，具有荧光强度高，稳 定性强 的优 点，可用 于活 体动物 体 内光学 成 像 。J。但是，到 目前为止，对于采用 SPIO和荧 光量子点对干细胞同时进行磁性和荧光双标记的研 究较少 j。双标记对干细胞的有效性和安全性是 进行活体示踪的前提和基础，为了探讨 SPIO和荧 光量子点同时进入干细胞内会否对干细胞的生物学 特征产生负面影响，我们制备了二氧化硅 (SiO ) 包裹的、同时包含 SPIO [以四氧化三铁 (Fe，0 ) 为核心]和荧光量子点 (CdTe)的 Fe 0 @CdTe @SiO：双功能纳米粒子，对大鼠骨髓间充质干细 胞 (Bone marrow mesenchym~stem cells，BMSCs) 一 步完成磁性和荧光双标记，于体外初步观察其对 BMSCs的细胞毒性、增殖能力、活力以及多向分 化潜能等生物学特性的影响。 2 材料与方法 2．1 大鼠BMSCs的提取、分离、培养 由中山大学中山医学院实验动物中心提供的无 特定病原体 (Specefic pathogen Free，SPF)4周龄 雄性 sD大鼠为研究材料 ，体质量约 70 g。大鼠断 颈处死后，于无菌条件下取胫骨和股骨，用生理盐 水冲洗骨髓腔，并吹散细胞，冲洗液离心后弃上清 及脂肪层。采用梯度离心法分离收集 BMSCsH]。 2．2 制备磁 荧光量子点双功能纳米粒子对 BMSCs行双标记 通过 Fe，O 核心结合 CdTe，最后用薄层 SiO 进行包裹和修饰，得到 Fe O @CdTe@SiO 的磁性 与荧光量子点双功能纳米粒子，具体操作详见本课 组已发表的文献 [4]。 BMSCs双标记方法：BMSCs传代后 24 h，将 Fe3O4@CdTe@SiO2和多聚赖氨酸 (Poly．L—Lysine， PLL)加入无血清 DMEM培养基中，室温下震荡 1 h，然后加入等体积的完全培养基，铁离子终浓度 为 25 mg／L，上述混合液同 BMSCs在 37~C共同孵 育 24 h。将不加 Fe304@CdTe@SiO2一PLL复合物、 完全培养基正常培养的 BMSCs，即未标记细胞设 为对照组。以下实验步骤均采用上述方法对 BM— SCs进行双标记及设立对照组。 2．3 显微镜下观察与普鲁士蓝染色检测双标记效 盔 显微镜下观察 ：双功能纳米粒子与 BMSCs共 同孵育 24 h后，除去培养基，用 PBS缓冲液洗 3 遍，于倒置显微镜可见光下观察并拍照；再置于荧 光倒置显微镜下，以绿光 (波长510—560 nm)激 发，观察细胞内纳米粒子的荧光情况。普鲁士蓝染 色：将接种于24孔培养板的 BMSCs用 4％多聚甲 醛于4~C固定 1 h，酸性亚铁氰化钾孵育染色 1 h， 核固红复染，倒置显微镜下观察并拍照。 2．4 观察 Fe3o4@CdTe@SiO2双标记下 BMSCs 的生物学特性 2．4．1 细胞毒性实验 BMSCs经0．25％胰蛋白酶 消化后制备成单细胞悬液，按 1×10 个细胞／孔等 量接种于 96孔培养板，24 h后使用 Fe 0 @CdTe @SiO：一PLL复合物通过2．2的方法进行双标记，再 更换成 DMEM培养基继续培养 24 h，小心洗去未 结合的粒子。以未标记的 BMSCs作为对照组，不 含细胞的 DMEM培养基作为空白对照，将每一孔 双标记的细胞或未标记细胞分别加入含有 10 L细 胞计数 (CCK一8)液的 DMEM培养基共 110 txL， 于 37℃孵育 2 h，采用酶标仪检测各孔孵育后的吸 光度，检测波长 450 nm。双标记组和未标记组孵 育后吸光度 (反映存活细胞数量)的比值。每组 5 个复孔，重复 3次 。 2．4．2 台盼蓝拒染法检测细胞活力 BMSCs经 0．25％胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液 1× 10。eells／mL ， 取 9滴细胞悬液和 1滴 0．4％台盼蓝 混匀，在 3 min内用细胞计数板分别计数活细胞和 死细胞。死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染。活细 胞率 (％)=活细胞总数／(活细胞总数 +死细胞 总数) 。 2．4．3 CCK．8试剂盒测定细胞增殖能力 BMSCs． 经 0．25％胰蛋白酶消化后，制备成单细胞悬液， 按 1 x 10 个细胞／孔等量接种于96孔培养板，24 h后使用 Fe3 04@CdTe@SiO2．PLL复合物通过 2．2 576 新医学 2011年9月第 42卷第 9期 的方法行双标记，以未标记的 BMSCs作为对照组， 不含细胞的DMEM培养基作为空白对照，1 d后换 成普通低糖 DMEM培养基，以后每3 d换液。分别 于标记后第 1、3、5及7 d加入含有 10 L CCK．8 液的DMEM培养基 110 IxL，37oC孵育2 h，用酶标 仪检测各孔吸光度，检测波长450 nm，记录不同 时间点的吸光度，计算双标记组与对照组的相对吸 光度，以反映细胞增殖能力l 。 2．4．4 BMSCs多向分化能力鉴定 BMSCs以 5× 10 ／cm 密度接种至 0．01％ I型胶原包被的24孔 板；培养24 h后，使用Fe3O4@CdTe@SiO2一PLL复 合物通过 2．2的方法进行双标记；细胞生长至 100％满时，换为成脂或成骨诱导液 (美国Invitro— gen公司)持续培养，每3 d换液；诱导结束后， 吸去诱导液，PBS缓冲液洗两次，荧光显微镜下观 察 Fe3O @CdTe@SiO 粒子荧光情况，行普鲁士蓝 染色，并分别进行油红 O染色观察成脂诱导，茜 素红染色观察成骨诱导情况。 2．5 统计学处理 使用 SPSS 13．0统计分析软件，计量资料用 ±s表示。两组间的均数 比较采用两独立样本的 t 检验；双功能纳米粒子对细胞增殖能力影响的组间 比较采用多变量方差分析。P<0．05为差异有统计 学意义。 3 结 果 3．1 Fe3O4@CdTe@SiO2双标记 BMSCs 可见光下，双标记 BMSCs细胞胞浆内可见大 小不等颗粒状棕黄色含铁颗粒。荧光显微镜下 Fe O @CdTe@SiO：纳米粒子呈红色荧光，与可见 光下观察结果重叠，发现红色荧光与细胞内棕黄色 颗粒位置吻合，细胞标记率 90％以上。鲁士蓝染 色则可见细胞内铁表现为淡红色胞浆内大小不等的 类圆形蓝染颗粒，细胞标记率同样在 90％以上。 双标记组细胞形态和分布与对照组无明显差别。 3．2 双功能纳米粒子对 BMSCs生物学特性的影 响 3．2．1 细胞毒性实验 双标记组相对吸光度为 (97±10)％，未标记组为 (100±7)％，两组间比 较差异无统计学意义 (P>0．05)，提示 Fe，O @ CdTe@SiO，对 BMSCs无明显细胞毒性作用。 3．2．2 细胞活力检测 台盼蓝拒染法发现双标记 组和未标记组细胞的活细胞率分别为 (94±5)％ 和 (97±3)％，两组间比较差异无统计学意义 (P >0．05)，提示双标记对细胞的活力无负面影响。 表 1 各时间点双标记 BMSCs与未标记 BMSCs的相对吸光度 ( ±S) ％ 3．2．3 细胞增殖能力 如表1所示，双标记后第 1—7日，标记与未标记组的各时间点细胞的相对 吸光度比较差异无统计学意义 (P>0．05)，提示 细胞增殖并未受到双功能纳米粒子的影响。 3．2．4 多向分化能力 双标记后 BMSCs诱导 l4 d，细胞内可见大量透明脂滴形成，油红 O染色呈 大小不等红色小滴，与未标记的BMSCs无明显差 别。荧光显微镜下Fe3 O @CdTe@SiO：纳米粒子仍 可见红色荧光。同时进行普鲁士蓝染色，大量细胞 内仍可见蓝染的含铁颗粒 ，颗粒与脂滴共存 ，证实 双标记不影响 BMSCs的向脂肪细胞分化潜能。双 标记后 BMSCs诱导 21 d，茜素红染色可见两组细 胞大量橘红色钙盐沉积，部分呈 “结节状”，荧光 显微镜下Fe3 O @CdTe@SiO2仍可见红色荧光。普 鲁士蓝染色显示双标记的细胞成骨诱导分化后，细 胞内仍可见大量蓝染的含铁颗粒存在。 4 讨 论 MRI和活体动物体内光学成像在时间与空间分 辨率、解剖定位、检测敏感度等方面各具优势与不 足，多模态成像策略，即多种成像模式的结合与优 势互补，可解决单一技术和显像模式的缺陷，是分 子影像学未来的发展方向和研究热点 J。而制备 多功能纳米材料，使其同时用于 MRI和活体动物 体内光学成像 ，则是实现多模式成像的有效途径之 一 _8 J 。 近年来，有研究将磁性纳米材料与荧光染 料共同标记干细胞，但是传统的荧光染料存在稳定 性较差、荧光强度较弱等缺点，仅能用于离体的标 记，活体成像困难。而荧光量子点作为新型的纳米 荧光材料，较传统荧光染料荧光强度高20倍，稳 定性强 100倍以上，可长期多次激发观察 ，已用于 小动物活体内肿瘤或干细胞的荧光成像，追踪标记 的靶细胞 引。也有研究制备了钆、锰螯合物等磁 性材料联合荧光量子点制备磁性一荧光双功能纳米 粒子，用于靶向标记和检测细胞死亡和肿瘤发生。 但是 ，钆和锰螯合物作为 MRI对比剂，不能进入 人体正常代谢过程，存在长期毒性、肾脏副作用及 检测灵敏度较低等缺点 。而本文采用的 Fe，O 有 弛豫率高、细胞毒性小、分解后可被机体重新利用 新医学2011年9月第42卷第9期 577 参与正常铁代谢等优点，所以使用Fe，0 为核心的 SPIO和荧光量子点共同标记干细胞无疑是最佳组 合之一。 本研究中，我们利用超顺磁性 Fe，O 和荧光量 子点 CdTe，成功制备了双功能纳米粒子一Fe，O @ CdTe@SiO，，其具有超顺磁性、磁响应性良好的特 点-，而且荧光性能稳定而持久 。Fe。O @CdTe@ SiO，为壳核结构，其 SiO 外壳是一种无毒且生物 相容性好 的纳米材料，薄层 SiO。的包裹和修饰， 增强了荧光量子点的光稳定性和耐光性，并且使 Fe，O @CdTe@SiO 具有亲水性 ，提高了粒子的生 物相容性，同时进一步阻止了 CdTe中的镉离子 (cd )溢出带来的细胞毒性 “ 。 荧光量子点和 SPIO对干细胞的毒性与粒子浓 度、化学组成、大小、表面修饰和进入细胞方式等 有关。正电荷丰富的 PLL与纳米粒子结合后，帮 助其通过静电吸附作用与带负电荷的细胞膜非特异 结合，促进胞吞作用进入细胞。本研究示，通过 PLL介导，Fe 0 @CdTe@SiO 可顺利进入 BM— SCs，荧光和磁性标记率均超过 90％，与既往报道 中使用单一荧光量子点或 SPIO标记 BMSCs的结果 相近 ， j。一般情况下，经修饰的荧光量子点和 SPIO对 BMSCs的生物学特性均无明显的影响，在 本研究中，笔者发现以Fe O @CdTe@SiO 在铁浓 度 25 mg／L时即可以对 BMSCs高效双标记，这一 数据也是目前 SPIO标记干细胞的常用浓度，在这 一 浓度下细胞内的双功能粒子未对 BMSCs产生明 显毒性作用，而且对 BMSCs的活力、增殖和成骨、 成脂分化潜能等一系列生物学特性无明显的负面影 响，对干细胞的双标记是安全而有效的。在对 BM- SCs体外诱导分化后，虽经多次更换诱导液，成脂 和成骨后的 BMSCs细胞内仍可见双功能纳米粒子， 铁染色和荧光显微镜下观察显示其磁性和荧光特性 在细胞内至少可持续 2～3周以上。 综上所述，同时具有超顺磁性和荧光的 Fe O @CdTe@SiO：双功能纳米粒子对 BMSCs标记效率 高，标记时间长，细胞毒性低，对其生物学特性无 明显影响，有望为 MRI和光学多模态成像示踪移 植后 BMSCs提供技术基础，其活体应用将是我们 进一步研究的方向。 [参考文献] [1] LIN S，XIE X，PATEL M R，et a1．Quantum dot ima— ging for embryonic stem ceils[J]．BMC Biotechnol， 2007，9 (7)：67． [2] CAI W，SHIN D W，CHEN K，et a1．Peptide—labeled near-infrared quantum dots for imaging tumor vasculature in living subjects[J]．Nano Lett，2006，6(4)：669— 676． [3] LEI Y，TANG H，YAO L，et a1．Applications of mes— enchymal stem cells labeled with Tat peptide conjugated quantum dots to cell tracking in mouse body[J]．Bio— conjug Chem，2008，19(2)：421-427． [4] 颜荣华 ，单鸿，聂立波，等 ．磁性／荧光量子点双功 能纳米粒子标记大鼠骨髓间充质干细胞[J]．中华医 学杂志，2010，90(1)：56-60． [5] YUKAWA H，MIZUFUNE S，MAMORI C，et a1． Quantum dots for labeling adipose tissue—derived stem cells[J]．Cell Transplant，2009，18 (5)：591— 599． [6] RAD A M，ARBAB A S，ISKANDER A S，et a1． Quantification of superparamagnetic iron oxide (SPIO)一labeled cells using MRI[J]．J Magn Reson Imaging，2007，26(2)：366-374． [7] LU C W，HUNG Y，HSIAO J K，et a1．Bifunctional magnetic silica nanoparticles for highly efficient human stem cell labeling[J]．Nano Lett，2007，7 (1)：149— 154． [8] WEISSLEDER R，PITTET M J．Imaging in the era of molecular oncology[J]．Nature，2008，452(7187)： 580—589． [9] PENFIELD J G，REILLY RF J R．What nephrologists need to know about gadolinium [J]．Nat Clin Pract Nephrol，2007，3(12)：654-668． [10] TALLURY P，PAYTON K，SANTRA S．Silica．based multimodal／muhifunctional nanoparticles for bioimaging and biosensing applications [J]． Nanomedicine (Lond)，2008，3(4)：579-592． [11] WOLCOTF A，GERION D，VISCONTE M，et a1．Sili— ca—coated CdTe quantum dots functionalized with thiols for bioconjugation to IgG proteins[J]．J Phys Chem B， 2006，110 (11)：5779-5789． [12] SHAH B S，CLARK P A，MOIOLI E K，et a1．Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots[J]．Nano Lett，2007，7(10)：3071-3079． (收稿 日期：2011-07一l1；编辑：洪悦民)