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判定肿瘤抗原特异性T细胞反应的新方法

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判定肿瘤抗原特异性T细胞反应的新方法 文章编号 : 1007 - 8738 (2002) 05 - 518 - 03 判定肿瘤抗原特异性 T细胞反应的新方法 禄韶英1综述  隋延仿2 , 潘承恩1审校 (1 西安交通大学第一医院普外科 , 陕西 西安 710061 ; 2第四军医大学基础部病理学教研室) 收稿日期 : 2001 - 12 - 26 ;  修回日期 : 2002 - 01 - 26 作者简介 :禄韶英 (1971 - ) , 男 , 陕西三原县人 , 主治医师 , 博士. 西安市健康路 1 号 , Tel. (029) 5252981 - 2...
判定肿瘤抗原特异性T细胞反应的新方法
文章编号 : 1007 - 8738 (2002) 05 - 518 - 03 判定肿瘤抗原特异性 T细胞反应的新 禄韶英1综述  隋延仿2 , 潘承恩1审校 (1 西安交通大学第一医院普外科 , 陕西 西安 710061 ; 2第四军医大学基础部病理学教研室) 收稿日期 : 2001 - 12 - 26 ;  修回日期 : 2002 - 01 - 26 作者简介 :禄韶英 (1971 - ) , 男 , 陕西三原县人 , 主治医师 , 博士. 西安市健康路 1 号 , Tel. (029) 5252981 - 2411 Email : lsyyr @chinaren. com 关键词 : 疫苗 ; 肿瘤抗原 ; 抗原表位 ; 免疫反应 中图分类号 : R730. 54     文献标识码 : A   几十年来 , 人们致力于肿瘤疫苗的研究 , 旨在激活患者 自身的免疫系统 , 产生持久有效的抗肿瘤免疫。在肿瘤疫 苗治疗前后 , 如何准确地定量、定性判定肿瘤抗原特异性 T 细胞应答 , 评价疗效 , 是影响抗肿瘤疫苗发展的关键。51 Cr 释放法和有限稀释法 (limiting dilution analyses , LDA) , 一直 被认为是评价特异性 T 细胞反应的金标准 , 但实践证明这 两种方法费时、费力且敏感性低。近 5、6 年来 , 一些评价 T 细胞功能和特异性的新方法逐渐建立起来 [1 ,2 ] , 由于这些方 法更加敏感 , 提供的信息更有意义。尤为重要的是 , 有的方 法能够对淋巴细胞直接进行检测 , 勿需体外扩增 , 因而更能 准确地反映机体的免疫状况。 1  体外特异性 T 细胞的表型分析方法 1. 1  RT2PCR TCR 基因扫描法  成熟 T 细胞的功能性 TCR 大多由α和β两条肽链组成 , 与 Ig 基因重排类似 ,α和 β两条肽链由 V2J2C 及 V2D2J2C 基因片段重排所编码 , 使 TCR产生多样性和特异性。在 TCR 可变区中有一高变区 叫做 互 补 决 定 区 ( complementarity2determining regions , CDR) , V 基因片段编码 CDR1 和 CDR2 , CDR3 则由 V、J 基 因片段编码。另外 , CDR3 除了由 V2D2J (β链) 或 V2J (α链) 基因重组编码外 , 还可有 N 区核苷酸的随机插入 , 因此 , 其 变化程度明显要高于 CDR1 和 CDR2 , 在识别 MHC2肽复合 物时 , 接触抗原肽的中心部位起重要作用。同一 T 细胞克 隆重排后 , 其 CDR3 的长度和序列完全相同 , 而不同 T 细 胞克隆的 CDR3 的长度和序列则有所不同 , 其长度的差别 可为 3~24 个碱基。利用 Vβ、Cβ基因特异性引物进行 RT2 PCR , 可扩增出特异性 CDR3 基因 ; 根据其长度和序列 , 在 混合性 T 细胞群中能检出抗原特异性的 T 细胞[3 ] 。 应用位于 CDR3 两侧的引物 (1 个特异性 Cβ引物和 24 个 Vβ特异性引物)多次扩增 , 扩增产物用荧光标记的探针 检测 , 并以免疫扫描 (immunoscope) 软件 , 自动分析扩增片 段的荧光强度和大小 , 最后用曲线图显示结果。正常人外 周血 T 细胞的 TCRβ重排是随机的 , 即呈多家族和多克隆 , 免疫扫描分析结果为一钟型曲线 , 有 8 个峰。当 T 细胞群 受到免疫刺激后 , 少数几个 T 细胞克隆扩增 , 可引起显著 的检测信号的变化 , 表现为 1 个明显的突出峰。该方法的 优点在于所需样本量少、重复性好 , 可直接分析 PBMC , 不 需体外扩增。不过 , 近来有人在黑色素瘤的研究中 , 却发现 存在非限定性的 TCR 基因 [4 ] 。由于无法预测给定抗原的 TCR 谱 (repertoire)是多种还是有限的 , 因此 , 这种方法目前 多用来监测经过治疗后患者体内 TCR 谱的变化 [5 ] 。 1. 2  荧光标记抗体法 应用识别 TCRα、β链 V 区或J 区亚克 隆的荧光标记抗体和流式细胞术 , 也可检测到特异性 T 细胞 克隆的扩增。表达特定 Jα, Jβ, Vα, 或 Vβ链的细胞数量的增 加 , 提示有寡克隆扩增 , 是特异性免疫应答的迹象[6 ] 。 2  MHC2肽复合物多聚体染色法 T 细胞通过特异性 TCR 识别由 MHC分子呈递的短肽 , 因此可用荧光标记的 MHC2肽复合物检测抗原特异性 T 细 胞。然而 , TCR 和 MHC2肽复合物之间的亲和力很低 , 极不 稳定 , 解离时间小于 1 min。利用 MHC2肽复合物多聚体可 增加与 T 细胞的亲和力 , 解决这一问题。MHC2I2肽复合物 二聚体、四聚体染色法 , 已被用于抗原肽特异性 CD8 + T 细 胞的定量、定性和分离纯化 [7 ] 。其步骤为 : 用大肠杆菌生产 MHC 的轻、重链 , 在体外按摩尔比与抗原肽重组 , 纯化重组 体 , 在重组体重链的 C2端连接 1 个生物素分子 , 与荧光标 记的亲和素共同孵育 , 产生荧光标记的四聚体 [7 ] 。二聚体 是通过构建 MHC分子和 IgG1 的融合蛋白而产生的 , IgG1 为连接体 [8 ] 。将 MHC2肽复合物多聚体与 PBMC 作用后 , 再用流式细胞仪检测。MHC四聚体标记的 T 细胞 , 可进一 步利用表面标记进行定性分析、纯化或功能评价 [9 ] 。 该方法能够发现所有特异性的 T 细胞 , 无论是前体细 胞还是效应细胞 , 也不管其有无功能。当 T 细胞有功能时 , 用 MHC四聚体染色法、51 Cr 释放法和 EL ISPO T (详见后) , 检测到的抗原表位特异性 T 细胞的数量具有高度的一致 性 [10 ] 。MHC2II 类分子四聚体染色法 , 也可用于分析 CD4 + T 细胞反应[11 ] , 但该方法存在以下问题 : ①MHC 四聚体结 合只需要表达 TCR ,检测到的 T 数量是其他方法的数倍以 上 , 其中包括无功能性的 T 细胞 [12 ] ; ②制备四聚体必须采 用已知的肿瘤抗原肽和其限制性的 MHC分子 , 但目前确认 的肿瘤抗原肽数量太少限制了其应用 ; ③四聚体结合是温 度依赖性的 , 温度低于 4 ℃时 , 非特异性背景增加 ; 温度高 于 37 ℃时 , 特异性的结合会减少 [6 ] , 肿瘤患者 T 细胞 TCR 的下调也降低了这一方法的敏感性。 3  淋巴细胞增殖的测定法 检测 T 细胞扩增通常采用放射性示踪法 ( [ 3 H ]胸腺嘧 啶) 。在体外短期培养外周血混合 T 细胞 , 用自体肿瘤细胞 815 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2002 , 18 (5) 或抗原肽负载的自体 APC和 IL22 进行刺激 , 扩增抗原特异 性 T 细胞 , 再进行功能分析 [1 ] 。显然 , 少量细胞的大量增 殖和大量细胞的少量增殖 , 都会产生同样的增殖指数。近 来有人用细胞膜染色法流式细胞仪 , 检测增殖过程中子代 细胞所占比例 , 已使抗原反应性细胞的定量成为可能 [13 ] 。 含有特异性前体细胞的样品 , 首先用羟基荧光素二醋 酸盐琥珀酰亚胺酯 (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester , CFSE)或 PKH26 (一种长链脂肪酸染料) 进行荧光染 色 , CFSE可与胞内的氨基结合 , PKH26 则结合到质膜中。 随着每次细胞分裂 , 都有 1Π2 的荧光分配到子代细胞中 , 根 据荧光强度的衰减程度便可推断细胞分裂的周期数 ; 根据 试验结束时的荧光分布 (通常为 4~15 d) , 可计算出试验开 始时前体 T 细胞的数量 [13 ] 。这种方法的优势在于 , 可联用 其他方法 (如四聚体染色法) , 同时检测特异性 T 细胞。缺 点在于 : ①不是直接检测与肿瘤杀伤活性相关的指标 , 检测 结果并非与临床结果直接相关 ; ②受患者非特异性免疫功 能的影响 , 增殖指数并非一定与机体抗原特异性 T 细胞数 有关 ; ③需要进行体外扩增 ,不适于无增殖能力的 T 细胞。 此外 , 有人报道 CFSE还可能干扰细胞的增殖。 4  细胞因子的检测 T 细胞受特异性抗原刺激后 , 某些细胞因子的表达和 分泌可上调 , 检测细胞因子的 mRNA 水平或分泌量 , 可评 价抗原特异性细胞的功能状态和数量。常用的 EL ISA 法 , 可检测培养上清中细胞因子的含量 , 但无法得到分泌细胞 因子的 T 细胞数。下列方法克服了这一缺点 : 4. 1  EL ISPOT 法  酶联免疫斑点法 [1 ] ( enzyme2linked immunospot , EL ISPO T)的基本步骤为 : ①以抗细胞因子的 特异性单抗包被 96 孔板 , 用牛血清蛋白封闭 , 阻止非特异 性蛋白的吸附 ; ②短暂 (24~48 h) 共同培养不同浓度的 T 细胞和刺激细胞 (包括自体肿瘤细胞或负载抗原肽的 APC) ; ③弃细胞 , 用 PBS(含 0. 05 % Tween220) 洗板 ; ④加入酶标 记的可识别细胞因子另一表位的单抗 , 充分洗板 , 通过显色 反应检测抗体细胞因子复合物。在培养过程中 , T 细胞分 泌的 IFN2γ可被包被抗体捕获 , 再用与显色底物相连的第 二种单抗显示 , 即在孔底产生斑点。当细胞的浓度恰当时 , 每个斑点可代表 1 个 IFN2γ分泌细胞。应用图像分析软件 或用肉眼计数斑点 , 可确定样品中分泌 IFN2γ的抗原特异 性细胞的数量。该方法用少量 T 细胞直接进行体外检测 , 可准确地反映 T 细胞在体的情况。由于细胞附近的细胞因 子浓度高 , 即使分泌 100 个细胞因子的细胞也能被发现 , 因 而敏感性高 , 足以检测到 1Π105 个 IFN2γ分泌细胞[14 ] 。另 外 , 由于这种方法可用识别细胞因子不同表位的两种单克 隆抗体 , 因而具有高度的特异性。该检测法可用冻存的 PB2 MC反复检测多种细胞因子 , 如 TNFα、IL24、IL25、IL26、IL2 10、IL212 和 GM2CSF 等 , 有高度的可重复性。当使用肿瘤 裂解产物负载的自体 DC 刺激 PBMC 时 , 能同时检测到 CD8 + 和 CD4 + 的 T 细胞反应 [15 ] 。 EL ISPO T已被广泛用于监测肿瘤疫苗治疗前后抗原特 异性 T 细胞的数量 , 例如 MHC2I 类抗原、CEA、N Y2ESO21 和 Melan2AΠMART21 等[14 ,16218 ] 。此外 , 非常有意义的是 , 应 用这种方法可成功地鉴定 1 个新的 HLA2DR4 限制性、Me2 lan2AΠMART21 起源的抗原表位 ( Melan2AΠMART2151273) 。 该抗原表位可被来自于 HLA2DR4 阳性患者或健康志愿者 的 CD4 + T 细胞识别[19 ] 。最近 , Lisa 等 [20 ] 又用这种方法 , 鉴定了 3 个 MHC2I 类限制性、由 HLA2A 3 0201 呈递的肝癌 AFP 抗原肽。 不过 , EL ISPO T 法只能检测到效应 T 细胞 , 若 T 细胞 无功能或分泌其他的细胞因子 , 就有可能低估抗原特异性 细胞的数量。再者 , EL ISPO T 无法确认细胞因子的分泌 量 , 只能利用计算机图像分析斑点的密度和数量粗略估 计 [26 ] 。 4. 2  多参数流式细胞术  应用多参数流式细胞术 (multipa2 rameter flow cytometry)检测细胞内细胞因子的步骤是 : 将共 同培养的 T 细胞和 APC , 经过 4~6 h 的刺激 (肿瘤抗原) , 用细胞分泌抑制剂 , 如莫能星 (monensin)或布雷菲德菌素 A (brefeldin A)处理培养中的 T 细胞 (3~4 h) , 在肿瘤抗原的 刺激下 , 细胞因子在培养细胞的胞浆中蓄积。用荧光标记 的抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8 和抗 CD69 抗体染色后 , 多聚甲 醛固定 , 用去污剂进行可渗透化处理 (permeabilize) 。再以 荧光标记的抗细胞因子抗体对细胞内的细胞因子染色 , 最 后用多色流式细胞仪定量检测着色的细胞 [1 ] 。这种方法可 检出 T 细胞产生的细胞因子、产生这种细胞因子的 T 细胞 类型 , 以及每个 T 细胞产生的细胞因子量。该法已被广泛 用于抗原特异性 T 细胞的定量分析 , 特别是用于区分 Th1、 Th2 两种不同的免疫反应。已有研究证实 , 细胞内细胞因 子 ( IFN2γ或 IL22)的检出率与患者的预后相关[21 ] 。由于表 达特定的细胞因子并不能等同于分泌这种细胞因子 , 因此 这种方法并不能检测细胞的功能。另一最大的缺点是 , 被 检测的细胞若已经死亡 , 不能进一步筛选和克隆化培养。 4. 3  MACS IFN2γ分泌测定法  磁性活性细胞分类 IFN2γ 分泌测定法 ( MACS IFN2γ secretion assay) [22 ] , 是近年建立 的一种以流式细胞术为基础 , 可检测单个抗原特异性 T 细 胞分泌的细胞因子的方法。其步骤是 : 将 T 细胞和 APC 被 培养于对 IFN2γ低通透性的介质中 , 分泌的 IFN2γ便被阻 留在 T 细胞表面 , 利用对 IFN2γ有亲和力的底物 (捕获剂 , 由 IFN2γ抗体和细胞表面特异性抗体共同构成) 捕获 IFN2γ。 被捕获的 IFN2γ用藻红蛋白 (phycoerythrin) 标记的另一种抗 IFN2γ抗体显色后 , 用流式细胞仪对分泌 IFN2γ的 T 细胞计 数。 此外 , 采用连接磁微粒的鼠抗藻红蛋白抗体 , 用磁性活 性细胞分类 (MACS)技术 , 可富集分泌 IFN2γ的抗原特异性 T 细胞 , 有利于进一步分析和体外扩增。 4. 4  实时、定量 RT2PCR  实时、定量 ( real2time quantita2 tive) RT2PCR , 是一种高精确性的检测基因转录水平或样品 中 RNA 水平的手段。Kruse 等 [23 ]把这种方法用于分析冻存 的正常志愿者血样中的细胞因子 mRNA。近来 Kammula 等 [24 ]用这种方法监测黑色素瘤抗原肽疫苗治疗前后 , 患者 915ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2002 , 18 (5) 体内抗原特异性 T 细胞的应答。具体步骤是 : 用细针穿刺 获得外周血或瘤组织标本冻存。将 PBMC 样本溶解后 , 在 新鲜培养基中恢复 10 h , 然后用抗原肽或不相关肽孵育刺 激2 h , 提取总 RNA , 以 RT2PCR 定量分析样品中细胞因子 mRNA的表达水平 , 再根据对照基因 (如 CD8 基因) 的水平 标准化数据 , 肿瘤标本中的 T 细胞则直接进行检测。结果 显示 , 定量 RT2PCR 可检测外周血样本中抗原特异性 T 细 胞反应 , 其可靠性研究和与其他方法的对照研究尚有待进 行。 5  方法的选择 检测 T 细胞反应的理想方法 , 应具备以下几个条件 [1 ] : ①足够的敏感性、特异性、可靠性和可重复性 ; ②能检测 T 细胞在机体内活化状态下的真实情况 , 不致产生明显偏差 ; ③操作简单迅速 ,需要的标本量少。如上述四聚体染色法的 敏感性最高 , 其次是 EL ISPO T。EL ISPO T 平板可提前大量 准备 , 移液、洗板和读板都可自动化 , 因而大批量检查时也 可做到快速高效。以 PCR 为基础 , 检测 TCR 基因或细胞因 子 mRNA 转录水平的方法 , 只需要很少量的样本。但归根 结蒂 , 与临床结果相关是对一种检测方法最基本的要求 , 能 反映最终临床结果的方法才是最理想的方法 , 适当联合应 用多种方法是目前比较明智的选择。 参考文献 : [1 ] Clay TM , Hobeika AC , Mosca PJ , et al . 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