乳腺癌基因治疗研究现状

信息检索综合课程设计 综述名称：乳腺癌基因治疗研究现状 班级：临床1008班 姓名：付潇潇 学号：2211100807 乳腺癌基因治疗研究现状 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高，有超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤首位的趋势。目前，乳腺癌的常用治疗手段主要是以传统的手术治疗为主，术后辅以局部或全身的放射治疗、化疗及内分泌治疗。这些手段虽然可使患者获得较高的生存率甚至临床治愈，但术后复发及远处转移的问仍然是困扰学者们的一大难题。随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展和人类对乳腺癌发病机制认识的不断深入，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分，在乳腺癌治疗中显示出良好的应用价值，并且取得了一定的效果，日渐成为一项有前景的治疗选择。现就近年来乳腺癌基因治疗的方法与现状作一综述。 1抑制癌基因的功能 原癌基因是人体细胞固有的基因，其达产物在正常状态下为细胞增殖分化所必需的，在特定条件下，原癌基因被激活而诱导细胞向恶性转化或使细胞恶变。乳腺癌基因治疗的方式之一是敲除显性的癌基因，从而削弱肿瘤的生长和浸润能力。这个目的可以在三个水平上实现。 1．1原癌基因的翻译水平 即用反义寡核苷酸(ODNS)或RNA干扰技术阻止癌基因mRNA转录和翻译。许多与乳腺癌有关的基因可受反义寡核苷酸的有效靶击。Kenney¨的研究表明，一种myc反义核酸对雌激素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作用，转化生长因子d(TGF—o【)的反义信使RNA能抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞的增殖。反义核酸体外转化乳腺癌细胞能够下调erbB一2的表达并适当抑制细胞的增殖[1]。RNA干扰是一种由双链介导的基因沉默现象，RNA干扰能特异性抑制同源基因的表达。有研究报道，上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)siRNA能使EpCAM发生基因沉默现象，减缓了乳腺癌细胞的增殖、浸润和迁移。然而，如果直接将这些体外合成的siRNA导入哺乳动物细胞内，仅引起4～7d的基因沉默，不足以持续影响细胞生理功能。Brummelkamp等构建了一个载体系统．pSUPERo该系统使用RNA聚合酶ⅢH1．RNA基因启动子，将siRNA相应的正义链和反义链整合到启动子下游处，两序列间隔5碱基。导人哺乳动物细胞后，利用RNA聚合酶转录大量的单链RNA，再折返形成19bp的双链siRNA[2]。由于这些siRNA的一端存在发夹结构，故称为短发夹RNA(shorthairp in RNAs，shRNAs)。同样，这些被转染的哺乳动物细胞出现了持久而稳定的特异性蛋白合成的抑制，并出现了相应的表型。研究表明shRNAs的干扰效果优于siRNA的干扰效果J。 1．2基因产物水平 以显性负突变体干扰肿瘤细胞内信号转导。如酪氨酸激酶受体基因可在乳腺癌中发生扩增及过量表达，这种过量表达的受体通过与相应配体如表皮生长因子(EGF)结合而刺激肿瘤细胞的生长。向肿瘤细胞质内转染该受体的突变型基因后，其对EGF的亲和力丧失，受体内吞及生物学信号传导功能丧失，肿瘤细胞生长受抑制。Senmaru等将h-ras癌基因116位密码子的酪氨酸替换为天冬氨酸后表达显性负突变ras蛋白，竞争正常ras蛋白作用位点，干预ras信号通路，抑制肿瘤细胞增殖[3]。Lee等在雌激素受体阳性乳腺癌中转入ER显性负突变体后也能显著抑制肿瘤细胞生长。 1．3使新生的原癌蛋白不能达到正确的细胞内 位置即用细胞内抗体预先占据胞内定位系统，隔离胞内生长因子受体，从而阻断癌基因蛋白到达其适宜的细胞内靶位。如转染了胰岛素样生长因子(IGF一1)结合蛋白的肿瘤细胞只能实现胞外结合IGF-1，即便在高浓度IGF．1存在下Balb／c细胞的生长也被抑制，此外还可使生长因子受体在胞内的正常定位崩解J[4]。 2恢复抑癌基因的功能 抑癌基因又称肿瘤易感基因，是一大类可抑制细胞生长、增殖、分裂的基因，可诱导细胞凋亡，其缺乏和失活与肿瘤的发生、发展有密切的关系。通过恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常细胞表型称抑癌基因的基因治疗。目前已分离克隆的抑癌基因主要有p53、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，Rb)基因、ERBA、WT1、结肠直肠癌缺失(deleteincolorectalcarcinoma，DCC)基因、大肠癌突变(mutatedincolorectalcarcinoma，MCC)基因、腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli，APC)基因、nm23、多肿瘤抑制(multipletumorsuppressor，MTS)基因、TIMP、脆性组氨酸三联体(Fragilehistidinetriad，FHIT)基因、BRCA1和BRCA2等，而以p53、FHIT、BRCA1和BRCA2等实验研究较多。现在常用的方法是以腺病毒为载体，将相应的抑癌基因转染乳腺癌细胞，抑制乳腺癌细胞的生长[5]。p53基因是研究较为深入的一种，野生型可直接抑制DNA复制，使细胞出现G期阻滞，调控细胞凋亡。乳腺癌患者中有40％出现p53基因的缺失或突变。Obermiller等将野生型p53基因导人p53基因缺失或变异的乳腺癌细胞，可抑制肿瘤细胞的生长，促使肿瘤细胞凋亡。FHIT基因是一种新发现的抑癌基因。FHIT基因的大片段缺失常存在于包括乳腺癌在内的许多肿瘤中。有研究表明用腺病毒转染FHIT(Ad—FHIT)后，可激活caspase一2释放细胞色素2，最终导致乳腺癌细胞凋亡[6]。 3基因免疫治疗 免疫治疗是一种诱发针对肿瘤细胞相关抗原特异性免疫反应的治疗。基因免疫治疗的目的是提高肿瘤细胞的免疫原性，激发机体抗肿瘤免疫。目前应用于临床试验的免疫基因治疗有以下3种 3．1全肿瘤细胞疫苗 即采用转基因手段促进机体对肿瘤细胞的免疫反应。将编码促进免疫反应细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内，将肿瘤细胞经放射线照射灭活后，自身移植于体内，以增强免疫反应。目前用于该方面研究的免疫增强细胞因子包括白细胞介素-2、12，干扰素，粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte—macrophage colony．stimulatingfactor，GM，CSF)等[7]。直接注射这些细胞因子效果差，且有一定副作用，而通过基因转导方法修饰肿瘤细胞或免疫效应细胞，能增强免疫细胞的活性，发挥机体抗肿瘤免疫功能，从而达到治疗目的。近年有报道泰素联合编码IL．12基因的质粒p2CMVmIL．12治疗对泰素不敏感的4T1小鼠乳腺癌模型，其抑制肿瘤生长和肺转移的作用明显优于单纯泰素治疗组，且未增加对机体的毒副作用，而IL一12基因的这种抗肿瘤作用可能与NK细胞关系密切¨[8]。JanatAmsbury等叫将IL一12复合物局部肿瘤注射联合多西紫杉醇化疗治疗小鼠乳腺癌。结果显示，无论是多西紫杉醇耐药组还是敏感组，联合用药均较单用化疗组在肿瘤体积和肺转移方面疗效更明显。Shi等¨报道用GM．CSF体外转染乳腺癌细胞制备的细胞疫苗，在体外和体内动物实验中均可诱导肿瘤特异性免疫反应，疗效优于直接全身应用外源性GM—CSF，有望能尽早应用于临床实验。Peplinski等¨建立了l7例重组疫苗病毒编码的细胞因子联合强、弱疫苗病毒启动子的模型。将多种细胞因子基因如GM．CSF、IL一2、hIL一1、IFN．B、IFN一^y等转导人同一种乳腺癌细胞中，可进一步抑制肿瘤生长，显示了联合基因治疗比单一的基因疗法更有效。 3．2肿瘤抗原靶向基因治疗 肿瘤抗原在一定条件下能够激发机体的体液和细胞免疫产生抗肿瘤作用。这种方法较全肿瘤细胞作为疫苗用于增强对肿瘤的免疫反应更具吸引力。目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER一2、癌胚抗原(CEA)、MAGE一1、MUC一1等。这些抗原在肿瘤组织中的表达高于周围正常组织，并具有被细胞毒性T细胞(CTL)识别的抗原簇[9]。应用基因工程技术，将编码HER-2、CEA、MAGE．1、MUC．1等肿瘤相关抗原的基因修饰后，隆到逆病毒载体，转入体内，诱导机体产生针对这些抗原的特异性抗体，或者在体外将这些抗原的不同抗原簇进行克隆和表达，筛选出能够抑制肿瘤细胞生长的抗体。目前已经成功应用于临床的赫赛汀(herceptin)就是针对乳腺癌细胞表面erbB一2抗原决定簇的人工合成单克隆抗体。其主要作用机制是：(1)herceptin与HER-2受体结合，抑制细胞生长信号传递通路；(2)加速HER-2受体降解，使HER一2受体表达下调；(3)在人外周血单核细胞存在时，herceptin对人肿瘤细胞株可介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，杀伤靶细胞；(4)抑制血管内皮生长因子的生成，阻断肿瘤内血管组织生长14]。MUC．1存在于腺上皮细胞表面的顶端，为跨膜蛋白，在乳腺癌多数有过度表达和异常糖基化，具有特异抗原性，是免疫治疗的靶目标。它由肿瘤细胞产生，经常存在于循环系统内，可被不同的抗体作为肿瘤标志物(CAI5．3)发现，可作为早期复发的检测和评估疗效的重要指标。Scholl等将人MUC一1和IL-2基因重组到TG1031疫苗病毒，对9例失去手术机会的晚期乳腺癌患者，采用肌肉内注射方法接种TG1031。尽管仅发现1例患者体内CEA水平下降，10周保持临床稳定，但在2例患者体内发现MUC-1特异性T淋巴细胞毒反应，未发现临床严重副作用。免疫组织化学检查显示，接种疫苗后在肿瘤活检中T记忆细胞(CD45RO)增加[11]。 3．3激发针对不同肿瘤相关抗原的免疫反应 近年来，新的肿瘤疫苗概念已建立在T细胞双识别信号的新理论上，只有在肿瘤抗原和MHC抗原同时被识别时才能激活CTL。对于大多数肿瘤抗原来说，只有少部分能符合这一，由抗原递呈细胞(antigenpresentcell，APC)参与的抗原处理是启动细胞免疫的必备条件。APC包括树突状细胞(dendriticcell，DC)和激活B细胞。外来抗原和体内异常蛋白均由APC处理变为可被免疫细胞识别的抗原后，才能激活免疫反应。DC作为抗原递呈细胞，可诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫。近年来通过遗传学改建DC，将肿瘤抗原的编码基因转染DC，能在DC内持续表达肿瘤抗原，既克服了肽与DC负载后MHCII抗原多肽复合物的解离问题，又能使表达的抗原有效地与MHC分子结合并呈递给CTL。动物试验及临床结果表明，它能诱导机体产生特异性CD4和CD8 T细胞抗肿瘤免疫应答，且不良反应较小，显示了良好的应用前景[12]。Wan等¨以腺病毒作为载体，将表达PymT(PolyomamiddleT)基因的腺病毒转染DC，回输给乳腺癌小鼠动物模型后，全部动物都激发了特异性抗移植瘤反应，且均未出现明显的肝脏毒性反应。鉴于MUC-l在乳腺癌、卵巢癌等腺癌细胞上大量表达，Koido等将编码MUC一1抗原的RNA借助质粒转染DC，并通过小鼠的尾静脉注人体内，对表达MUC-1蛋白的肿瘤细胞诱导出特异性免疫应答。 4自杀基因治疗 静脉内化疗有其局限性，要想全身无明显的毒性反应，在肿瘤局部就很难达到必需的药物浓度。应用自杀基因疗法可以解决这个问题。自杀基因又称为药物敏感基因，一般为某种外源性酶解前药基因。该基因导人细胞后，其表达的编码产物可使无毒的前药成分酶解成为有毒性的物质，杀死肿瘤细胞，增强化疗效果，却无全身的或局部的毒性反应。这类基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV—tK)基因，水痘．带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV—tK)基因，胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，CD)基因，细胞色素P-450基因，黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)基因，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因，大肠杆菌硝基还原酶(EC—NR)基因，亚麻苦甙还原酶(1inamarase)基因等。其中研究最深入且与肿瘤基因治疗关系最密切的是HSV—tK基因和CD基因。有报道，HSV—tK能特异性地将核苷类似物更昔洛韦(ganciclovir，GCV)代谢为毒性产物。用GCV治疗已转有HSV—tK基因的乳腺癌大鼠模型，可以观察到肿瘤排斥现象。Zeng等建立了强力霉素调控逆病毒介导体系，转染的MCF-7细胞经过强力霉素和GCV治疗后停滞于S期，体内实验显示治疗后肿瘤急剧缩小，出现坏死。目前研究显示，转染一种自杀基因，即使每一种前药物的浓度达到最高，也不能完全阻止肿瘤生长，而把两种自杀基因联合转染肿瘤细胞，即使每一种前药物的浓度很低，也能杀伤肿瘤，取得良好的治疗效果¨[13]。因此，联合转染至少两种自杀基因效果更佳。当前自杀基因治疗研究趋势为将靶向转导和靶向转录方法应用于自杀基因，设计组织特异性调控因子如CEA、hTERT启动子、热休克蛋白(HSP70)启动子、erbB一2启动子／增强子调控靶基因在肿瘤细胞中选择性表达[14]。Hernandez等利用基因工程方法构建含雌激素反应元件和低氧反应元件的杂和启动子，调节HSV—tk基因在乳腺癌细胞中的转录，使自杀基因表达更具可控性。Pandha等利用含erbB一2启动子驱动的CD基因质粒DNA原位注射到肿瘤部位使CD基因在erbB．2阳性乳腺癌细胞中高效表达，加入前药物后，显著抑制了肿瘤生长。该方法安全，无明显毒副作用，提供了一个靶向驱动自杀基因转录的治疗模式[15]. 5存在的问题和展望 乳腺癌基因治疗已经取得了初步成功。但要使其真正成为临床综合治疗的一部分，或成为乳腺癌根本的对因治疗而应用于临床，还有很长的路要走。许多问题需要在未来工作中进一步完善和解决。目前乳腺癌基因治疗存在的问题主要有：(1)在治疗基因的选择上，大多数研究仅仅局限于乳腺癌病理生理过程中的某一环节，并没有找到乳腺癌发病的关键问题，基因转染效率低、缺乏旁观者效应、细胞杀伤效率低、治疗效果不理想，因此，真正可用于临床治疗的新基因太少，而通过靶向沉默明显降低癌细胞转移的目的基因更加匮乏。(2)目前仍缺乏高效性、特异性、导向性治疗基因载体。(3)如何使治疗基因持续有效的高表达并进行精确的调控，目前尚无合理的手段。(4)基因治疗用于人体的剂量、途径、安全性及伦理学等方面的问题尚未解决。(5)目前绝大多数研究仅限于细胞或动物实验，缺少临床大宗病例的对照研究，临床实验结果尚不能支持大规模的随机Ⅲ期临床实验。目前的临床应用仅局限于局部治疗，如肿瘤瘤体内直接注射、腔内注射等，全身系统性治疗尚未见报道。但是，随着乳腺癌基因研究不断深入和分子医学不断进步，医学实验设备、细胞生物学、蛋白质组学、纳米技术的不断发展，乳腺癌基因治疗的研究一定会取得更大的进展。 【关键词】乳腺癌；基因治疗 参考文献 [1]KenneyN J，SaekiT，GottardisM，eta1．Expression oftransforminggrowth factor，an antisensemRNA，inhibitstheestrogen—induced production of TGF2 and estrogen—inducedproliferationofestrogen—responsive humanbreastcancercells．JCellPhysiol，1993，156：497—514． [2]OstaW A，ChenY，MikhitarianK，eta1．EpCAM isoverexpressed in breastcancerand is apotentialtargetforbreastcancergenetherapy．CancerRes，2004，64：5818—5824． [3]BrummelkampT R，BernardsR，AgamiR．A system ofrstable expression 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