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2010基因重组

2012-01-04 50页 ppt 2MB 23阅读

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2010基因重组null DNA重组与基因工程 DNA重组与基因工程 广州医学院实验医学研究中心重组DNA技术重组DNA技术(recombinant DNA technique),在体外通过末端共价连接重新组合脱氧核糖核酸(DNA)分子,使它们能在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上,并使之在受体细胞中增殖和表达。null遗传工程(Genetic engineering )就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。 遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作(细...
2010基因重组
null DNA重组与基因工程 DNA重组与基因工程 广州医学院实验医学研究中心重组DNA技术重组DNA技术(recombinant DNA technique),在体外通过末端共价连接重新组合脱氧核糖核酸(DNA)分子,使它们能在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上,并使之在受体细胞中增殖和表达。null遗传工程(Genetic engineering )就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。 遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作(细胞工程)和分子水平上的操作,即重组DNA技术(有人称之为基因工程) 基因工程中最主要的工作是分子克隆(molecular cloning )null分子克隆 所谓克隆,是指一个细胞经过无性繁殖以后所形成的子代群体。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆(分子克隆) 分子克隆—制备DNA片段,在体外将目的基因与载体DNA结合成一个具有自我复制能力的DNA分子(复制子、重组体),继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、获得大量同一DNA分子拷贝。 分子克隆所采用的技术:重组DNA技术 (重组DNA技术←→分子克隆技术)null 重组DNA技术一般包括四步: ①产生DNA片段(目的基因的获得); ②DNA片段与载体DNA分子相连接; ③将重组DNA分子导入宿主细胞; ④选出含有所需要的重组体DNA分子的宿主细胞。null基本工程的基本程序 null基因重组所必需的元素及过程 1 目的基因 2 载体 3 工具酶 4 宿主细胞null一、目的基因序列的来源 构建基因组DNA文库 构建cDNA文库 PCR扩增 化学人工合成null(一)、构建基因组DNA文库 用物理方法或酶法将基因组DNA降解成预期大小的片段,然后与载体(噬菌体、粘粒或YAC载体)连接,转入受体细菌或细胞。每一个细胞接受了一个重组DNA分子,许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体,就称为基因组DNA文库(genomic DNA library)。nullnull(二)、cDNA文库构建 提取组织细胞的总mRNA,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(噬菌体或质粒载体)连接后转化细菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 nullnull三、聚合酶链式反应(PCR) 如果已经知道目的基因的序列,就能很方便地用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR ),从基因组DNA或cDNA中获得目的基因,而不必要经过复杂的DNA文库构建过程。 null 四、人工化学合成 现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛应用,可按照设计好的序列合成所需要的DNA片段和基因。null1.载体 载体是指能将外源DNA携带进入宿主细胞并进行扩增和表达的工具。 分离的基因和核酸序列自身不能繁殖,需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 基因工程载体一般要求:   ①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力。   ②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好。 二、 DNA片段与载体DNA分子相连接null③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来, 这才便于重组操作。 ⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。null 载体分类 按功能 ①克隆载体(目的基因拷贝 ); ②表达载体 (基因表达产物 ) 按宿主细胞 ①原核载体;②真核载体;③穿梭载体(携带两种宿主复制子,能在两种生物体内复制。) null常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体 ①质粒(plasmid)细菌细胞基因组外的共价闭合环状双链DNA分子,能自主复制,能与细菌共生的遗传成分。 ②噬菌体(phage)感染细菌的一类病毒,有的基因组较大,例如λ噬菌和T等;有的则较小,如M13、f1、fd等。 ③动物病毒(virus)质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖,不能满足真核DNA重组需要。null①质粒载体 细菌等宿主细胞中染色体以外的环状双链DNA分子。大小为1~200kb; 能独立于宿主染色体外进行自我复制,每个细胞中可含10~200个拷贝。构建的质粒载体应具有复制起始点(ori)、1~2选择标记基因(Ampr 、kana+等)以及允许外源DNA组入的克隆位点。 null ①15kb的小质粒比较容易分离纯化,>15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制 。 ③质粒对宿主生存并不是必需的 。 null质粒载体的优缺点质粒载体的优缺点⑴优点——易操作,用途广 ⑵缺点——容量小,化学法的转化率低②噬菌体载体 ②噬菌体载体 一种细菌病毒,可作为克隆载体。 优点:可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬菌体(phage)是感染细菌的一类病毒。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 nullλ噬菌体由头和尾构成,基因组是长约49kb的线性双链DNA分子,组装在头部蛋白质外壳内部,其序列已被全部测出。 λ噬菌体感染时,通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌,而将其蛋白质外壳留在菌外。 null①溶菌性方式(lytic pathway):λDNA上基因表达出构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质,λDNA复制合成许多子代λDNA,装配成许多子代的λ噬菌体,最后裂解细菌,释放出许多新的λ噬菌体。 ②溶原性方式(lysogenic pathway):进入细菌的λDNA可整合入细菌的基因组DNA中,随细菌染色体DNA复制,传给细菌后代,这个整合在细菌基因组DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage),含有原噬菌体的细菌称为溶源菌.噬菌体两种不同的方式繁殖null双链DNA,滚环复制。 溶源性(温和phage )——感染细菌后,整和到细菌染色体 溶菌性(烈性phage )——感染后大量复制,细菌死亡破裂。 感染 溶源 条件诱导 溶菌null用作克隆载体的噬菌体 λ噬菌体和M13噬菌体 噬菌体载体的优缺点 ⑴优点——容量大,转染频率高,筛选方便 ⑵缺点——操作困难(需体外包装,CsCl2超速离心),保存困难(滴度下降)③病毒载体 ③病毒载体 病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中,使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖,然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用的有改造来自猴肾病毒SV40(Simian Virus 40)、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等,其目的为将目的基因或序列导入动物细胞中表达进行功能研究或用作基因治疗等。 2. 工具酶2. 工具酶一般分四类: ①核酸酶(切割和裂解) ②连接酶 ③聚合酶 ④修饰酶 null①核酸酶 核酸酶可分为两类: 核酸外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始,一个接一个把核苷酸水解下来; 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’,5’磷酸二酯键,将核酸链切断。 null命名规则 第一个字母(大写)是细菌属名的第一个字母, 第二、三个字母小写,该酶来源的细菌种名英文 的前2个字母 第四个字母 大写 表示不同的变种/品系 小写 表示不同的菌株和型 其后再按发现的先后写上罗马数字 例如:从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。 限制性核酸内切酶 分类: 分类: 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系,切断核酸的情况不同,分为三类: Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成,兼有修饰酶活性,随机切割在识别位点1000bp以外的DNA序列。 Ⅱ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成,切割DNA特异性最强,在识别位点范围内切断DNA。通常在重组DNA技术使用的限制性核酸内切酶 null   Ⅲ类限制性核酸内切酶由两种不同的亚基组成,兼有内切酶活性和修饰酶活性,切割位点在识别序列周围25-30bp范围内。    ★其中Ⅱ型酶,由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的,并且核酸内切作用具有序列特异性,故在基因克隆中有特别广泛的用途。 nullⅡ型酶的特点 ⑴识别序列 4-6碱基对,识别序列往往是旋转对称,迴文结构的双链DNA 5’…G↓AATT C …3’ 3’…C TTAA↑G… 5’ ⑵切割方式 平末端和粘末端 ⑶同裂酶 识别位点相同,切割位点不同或相同 ⑷同尾酶 来源不同,识别序列不同,但产生的粘性末端相同null 限制性核酸内切酶识别和切割的三种情况: ①产生5’粘性末端(cohesive end):以EcoR Ⅰ为例:   5’-G↓AATT C…3’→ 5’-Gp OHTTAAC-3’   3’-C TTAA↑G…5 3‘- CTTAAOH  pG-5' ②产生3’粘性末端:以PstⅠ为例:   5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’   3’…G↑ACGTC…5’ 3’…GOH pACGTC…5 ③产生平末端(blunt end):Nru Ⅰ为例:   5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’   3’…AGC↑GCT…5 3’…AGCOH pGCT…5’ null星活性(star activity) ——非最适条件下酶的识别特异性降低,产生非特异的切割现象。 内切酶使用注意事项 ⑴选择正确的酶 ⑵酶的保存 50%甘油 -20℃,-70℃(长期保存)②连接酶②连接酶T4连接酶的功能 催化双链DNA一端3’-OH与另一双链DNA的5’磷酸根形成3’,5’磷酸二酯键。 5’…CTGCAp HOG…3’ 3’…GOH pACGTC…5 5’…TCGp HOCGA…3’ 3’…AGCOH pGCT…5 null ①间断修复 ②连接功能 连接酶的特性 催化粘末端 平末端 双链DNA分子间③ 聚合酶③ 聚合酶 ⑴DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ、Klenow、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶 ⑵RNA聚合酶 T7、T3、SP6④修饰酶④修饰酶⑴碱性磷酸酯酶 催化DNA双链分子5’端脱磷酸 CIP(小牛碱性磷酸酶) ⑵多核苷酸激酶 在5’端—OH加磷酸3.目的基因与载体的连接 3.目的基因与载体的连接 将目的基因或序列插入载体,主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。 ⑴粘性末端连接 ⑵平末端连接 ⑶利用人工接头连接 ⑷加入同聚体尾连接null 粘性末端连接nullDirectional cloningnull平末端连接 可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头,使DNA末端产生新的限制内切酶位点,经内切酶割后,即可按粘性末端相连 。T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。 null利用人工接头连接利用人工街头进行连接三、基因序列导入宿主细胞 ⑴常用的宿主细菌 DH系列 DH1 DH10B. JM系列 JM 101 JM109 HB101、 C600 等 特点:野外生存能力差,是重组缺陷型三、基因序列导入宿主细胞 null转化 transformation : 将质粒DNA或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞,并使其获得新的表型的过程。 宿主细胞:大肠杆菌 感受态细胞的制备:冷Cacl2处理 转化操作:外源DAN与感受态细胞混合后置冰上30分钟→→42 ℃ ,90 秒→→冰上 2 分钟→→ 不含抗生素的培养基培养1 小时→→接种含有关抗生素的琼脂平板感染 infection 感染 infection 以λ噬菌体和真核细胞的病毒为载体的重组DNA分子,必须在体外经过包装成具染能力的噬菌体颗粒或病毒,才能用来感染适当的细胞并在细胞内扩增。 转染 Transfection 转染 Transfection 由转化和感染构成,指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 四.目的基因序列的筛选与鉴定四.目的基因序列的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的,因而最后生长出来的细胞并不同都带有目的序列。 一般一个载体只携带某一段外源DNA,一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体(recombinant)。①根据重组载体的标志作筛选①根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志,如抗氨芐青霉素(ampr)、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时,只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖,这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。 ② 、-半乳糖苷酶显色反应选择法② 、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶 Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色1. 原理:载体上有一段-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的片段其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因( 片段缺失)。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。2. 选择过程假阳性:如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码;(不破坏肽)。2. 选择过程null-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。③用核酸杂交法进行筛选③用核酸杂交法进行筛选以标记的核酸为探针与转化细胞内的DNA进行分子杂交,可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。 常用的方法菌落原位杂交,将转化后生长的菌落印迹到尼龙膜上,用碱裂解细菌,菌落释放的DNA就吸附在膜上,再与标记的核酸探针温育杂交,核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。④ PCR法进行筛选④ PCR法进行筛选PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列,则可以设计合成一对引物,以转化细胞所得的DNA为进行扩增,若能得到预期长度的PCR产物,则该转化细胞就可能含有目的的序列。 ⑤免疫学方法进行筛选⑤免疫学方法进行筛选 利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因,而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞,因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 ⑥ DNA限制性内切酶图谱分析⑥ DNA限制性内切酶图谱分析  这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱(restriction map)发生变化. 抽提质粒DNA后,特定限制性内切酶梅切,琼脂糖凝胶电泳,结果分析。⑦核苷酸序列测定⑦核苷酸序列测定克隆已知序列的核酸必须要经序列测定确认;未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能,用作进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。 Essential Cloning StepsEssential Cloning Steps五、克隆基因的表达五、克隆基因的表达要使克隆基因在宿主细胞中表达,就要将它重组到带有基因表达所需要的各种元件的载体中,这种载体就称为表达载体(expression vector)。null 克隆基因在大肠杆菌中的表达 克隆基因在哺乳动物细胞中的表达 克隆基因在其它表达系统中的表达 ㈠ 昆虫表达系统 ⒈ 果蝇表达系统(DES) ⒉ 杆状病毒表达系统 ㈡ 酵母表达系统
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