诺如病毒

null诺如病毒的流行及实验室检测诺如病毒的流行及实验室检测沈阳市疾控中心 高丹一、流行病学一、流行病学 诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的急性胃肠道感染，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，临床上常称为“冬季呕吐病”，诺如病毒是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。 null1、流行形势 20世纪70、80年代世界上发生的非细菌性腹泻暴发中19%～42%系NVs所致。 在美国流行更加严重，1976～1981 年美国成人非细菌性急性胃肠炎暴发流行中有 42%是由NVs引起的。 1996年1月～1997年6月美国疾病预防控制中心收到的90起非细菌性胃肠炎暴发中，96%是NVs引发。null据欧洲食源性监测网络对丹麦、英国、威尔士、芬兰、德国、匈牙利、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、荷兰等国监测结果显示，1995-2000年85%以上的暴发性胃肠炎系NVs所致。 2000-2005年挪威310次胃肠炎暴发中，204次与NVs有关。 2006年，诺如病毒在全球引起腹泻暴发流行，据欧洲、澳大利亚及北美地区食源性疾病监测网络显示，这些地区报道的诺如病毒胃肠炎疫情流行程度都显著超过往年。 null疫情迅速蔓延到日本，使日本发生了25年来最严重的一次由诺如病毒引起的急性胃肠炎疫情。 日本国立传染病研究所传染病情报中心在约3000家医疗机构调查了诺如病毒胃肠炎患者，统计分析显示，从9月1日至12月10日，上报的患者人数累计达35.76万人。据推算，全国至少已有近304万人感染，数人死亡。其中195万名患者是在12月10日为止的一个月时间内发病的。 日本此次疫情检测出的诺如病毒大部分属于“GⅡ4”基因型。null12月日本发生的相关群体事件： 日本秋田市政府职员食用了一饭馆在11日至13日加工的外卖盒饭后，从12日起陆续有52名职员出现呕吐和腹泻的中毒症状。14日，当地卫生防疫部门检出了诺如病毒。 日本大馆市8所中小学校内发生了集体食物中毒事件，共有340多名师生出现了中毒症状。当地卫生防疫部门于16日从14位病例的排泻物中检出诺如病毒。 12月15日，日本东京池袋大都会酒店发生怀疑集体食物中毒事件，有347人集体感染诺沃克病毒，引发急性肠胃炎。 12月16日在山口市举行的全国中学长跑接力赛，原定48支参赛队中，有7支参赛队的队员因患腹泻等疑似传染性胃肠炎而放弃参赛。 12月17日，日本群马县草津町的“草津温泉度假旅馆”有32名旅客出现腹泻等食物中毒症状，其中5人检出诺如病毒。 北海道上川町发生了167名住宿在层云峡观光旅馆的观光客集体食物中毒的情况。null其他地区发生的相关群体事件： 10月10日，新加坡丹福小学有41名学生因出现呕吐或腹泻的病状而缺课，使过去一个多星期来发生在这所小学的病人数增至约290人。学生及教职员集体出现呕吐及腹泻症状的有四所中小学，病倒的总师生人数超过540人。新加坡卫生部已经证实这些中小学师生是患上诺如病毒所导致的胃肠炎或胃肠感冒。 11月14日，一艘由意大利首都罗马开往美国弗罗里达州的“自由号”超级邮轮上，有700多名乘客出现了胃部不适、呕吐、发烧、腹泻等症状。美国疾病控制预防中心已证实这些乘客感染了诺如病毒。 null1995年方肇寅等首次在我国河南省腹泻患儿粪便中检测到诺如病毒起，陆续对山西、北京、安徽、福州、武汉、广州等地区NVs感染暴发进行调查，结果证明NVs感染在我国是普遍存在的。null2006年2月下旬在广西大新县某农场发生一起急性胃肠炎疫情，农场有483人，72人出现急性胃肠炎症状，结果取其8份样本检测，全部为诺如病毒。 2006年9月至10月，香港共有20起诺如病毒暴发流行。东南亚地区的国家，该病毒感染的病例也大幅上升，我国广东地区发生了多起暴发疫情。 2007年3月湖南师范大学附属中学局部暴发诺如病毒引起的感染性腹泻疫情，共有149名师生发病。 为防止疫情的传入和扩散，2007年1月，卫生部下发了《关于加强诺如病毒感染性腹泻防控工作的紧急通知》。 null2、流行特征 传染源 ：病人、隐性感染者 传播途径：粪－口途径为主 食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料； 接触诺如病毒污染的物体或面，然后手接触到口； 直接接触到感染者(如照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具)。 易感人群：普遍易感，主要是成人和学龄儿童 nullnull诺如病毒胃肠炎多在寒冷季节发生暴发，但在其他季节也可出现小暴发。 暴发中涉及的食物广泛，以贝类、沙拉、三明治、蛋糕、冰霜、冰块、饮水和木莓等直接食用品为主，其中贝类很可能来自污染水域，在贝类生物体内累积，木莓也因污水浇灌而遭污染。 null暴发地点以社区、学校、餐馆、医院、军队、幼儿园、孤老院及轮船上居多。 美国2006年诺如病毒引起的急性胃肠炎数量美国2006年诺如病毒引起的急性胃肠炎数量二、病原学二、病原学1、分类 诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NVs）属的原型代表株。 诺如病毒是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。 诺瓦克病毒最早是从1968年在美国俄亥俄州诺瓦克镇一所小学暴发的急性腹泻的患者粪便中分离的病原。 1972年美国学者Kapikian等首先用免疫电镜技术从1968年暴发的胃肠炎患者样本中检出了病原定名为诺瓦克病毒。null此后，世界各地陆续自胃肠炎患者粪便中分离出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒样颗粒，均以发现地点命名。 先是称为小圆结构病毒，后称为诺瓦克样病毒（Norwalk-like virus,NLV）。 2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NVs）。 诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV）现在的正式名称为札如病毒(Sapovirus,SVs)，合称为人类杯状病毒。 null根据其基因组的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋白核苷酸序列的差异，诺如病毒可分为5个遗传组（GI、GII、 GIII、GIV、GV)，感染人类的主要是GI、GII和GIV。 GⅡ是世界范围内诺如病毒流行的主要基因型，优势株为GⅡ-4。诺如病毒暴发和流行与GⅡ-4变异株有关。 在动物体中发现了感染牛和鼠的基因组属于基因群GIII和GV。 null2、形态结构   诺如病毒直径约为26～35nm，无包膜，球形，呈二十面体对称，外壳为由同一种外壳蛋白组成的90个二聚体构成，表面粗糙，但无明显的嵌杯凹陷或表面孔洞。 nullNV基因组是单股正链 RNA，全长约7.5kb，由3 个开放阅读框（Open Reading Frames，ORF）组成，在3‘端有polyA尾。 ORF1编码非结构蛋白，由5396个碱基（bp）组成，该序列类似于微小RNA病毒的2C解旋酶、3C蛋白酶和3D RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp） ORF2与ORF1有14个碱基的重复，长约1600bp，编码病毒的外壳蛋白VP1。VP1蛋白可自聚形成病毒样颗粒，这些颗粒作为抗原可用于检测血清中特异性抗体。 ORF3编码一个212氨基酸的小蛋白，可能对病毒颗粒的形成起作用。 null诺如病毒基因变异大，分型复杂，除基因组GI、GII共计31个基因型外，在RdRp和衣壳蛋白基因的重叠部位还可发生重组。由于重组NV的出现，使基因分型变得更为复杂。 即使在同一群内，由于个别碱基的变异，还可细分为不同的亚群/亚型，这些亚群/亚型的交替出现也可导致疾病流行情况的改变 。null3、培养特性 不能在细胞或组织中培养 无合适的动物模型null4、理化特性 诺如病毒对热、乙醚和酸稳定，室温pH2.7环境下存活3h，20%乙醚4℃处理存活18h，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通饮水中3.75～6.25ppm的Cl-浓度(游离氯0.5～1.0ppm)，室温下在受污染的水、食物或环境中可存活一天至数天，容易造成大规模的集体感染事件。但在处理污水的10ppm的Cl-浓度中被灭活。 null5、宿主范围 以前认为人是唯一宿主，但近来在猪、牛等动物的粪便中也检测到该病毒。有很多关于食用双壳贝类引起暴发的报道，但它们并不是宿主，只是寄生，具有富集海水中病毒的作用。 null6、致病性 诺如病毒致病力极强，感染剂量低，100个病毒颗粒即可导致发病。 小肠壁被病毒感染后，小肠近端的绒毛变宽、变平，还可见单核细胞浸润、核胞浆内空泡形成。NVs引起腹泻的原因是一些短暂性的糖类与脂肪吸收不良以及一些与吸收有关的酵素活性减低。 null7、免疫性 人群感染后产生的免疫力有两种类型：短期免疫和长期免疫。 短期免疫表现为型特异性，即发病6-14周后，对同株病毒的再攻击有免疫力；但若用异性病毒攻击，仍可发病。约半数病人患病后可获得这种短期对同株病毒的免疫力，因此认为短期免疫与抗体水平有关。 长期免疫则与基因决定的肠道病毒受体差异有关。总的说来，血清中诺如病毒抗体没有明显的保护作用，尤其是无长期免疫作用，所以极易出现反复感染。 三、诊断三、诊断1、临床表现 潜伏期多在24～48h，最短12h，最长72h。 感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血。大便常规镜检WBC<15，未见RBC。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状，故在临床上常称“冬季呕吐病”。 此外，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，感染多数症状轻，脱水情况罕见，但可致死，尤其对于年老体弱者。null2、诊断 临床诊断病例：主要依据流行季节、地区、发病年龄等流行病学资料、临床表现以及实验室常规检测结果进行诊断。 在一次腹泻流行中符合以下者,可初步诊断为诺如病毒感染： （1）潜伏期24～48h； （2）50%以上发生呕吐； （3）病程12～60h； （4）粪便、血常规检查无特殊发现； （5）排除常见细菌、寄生虫及其它病原感染。 确诊病例：除符合临床诊断病例条件外，在粪便标本或呕吐物中检测出诺如病毒。 四、实验室检测四、实验室检测诺如病毒的检测多种多样，早期主要用电镜和免疫电镜，随着技术的发展，建立了分子生物学检测方法和免疫学检测方法。 null诺如病毒属于危害程度第三类的病原微生物，在进行病例样本的采集、处理和检测等实验活动时，应当采取隔离防护即需要穿防护服，戴口罩、手套等。 由于诺如病毒的感染剂量特别低，因此标本的处理和包含全病毒的实验在二级生物安全柜内进行。 运输时应按照B类包装，并办理申报手续。null1、标本采集、运送与保存 粪便标本应在发病首日采集，最佳采样时期不要超过急性期(48～72h)，此时为稀、软便，粪便中的病毒含量最多；成形便和肛拭子其病毒含量较少。每份标本量约10ml～50ml，标本置4℃不超过3天，近期不能检测，应直接在-20℃以下，最好-70℃以下长期贮存，并避免反复冻融。 呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断，标本的采集、储存和运送条件同于粪便。 从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NVs意义重要。若是饮用水，需用大容量(5L～100L)浓集病毒后检测。 样品采集后最好在2h内转运。 null2、标本处理 粪便中成分复杂，对试验影响较大，需对标本进行处理。一般制成10%便悬液，进行检测或置-20℃冰箱保存备用。 3、实验室检查3、实验室检查电镜和免疫电镜法： 电镜检测具有直接、可靠的优点，对于检测新出现的基因型的病毒具有其它方法不可替代的优越性，但观察的灵敏度较低，设备昂贵，技术条件要求高，不适于大规模流行病学调查。 与普通电镜法相比，免疫电镜采用恢复期患者血清浓缩粪便中的病毒，比电镜法的敏感性可提高 100 倍，从而增加检出率。 null免疫法 包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。 RIA法的灵敏度比IEM 法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，且需要放射性同位素标记。 为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。null1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的 NVs 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。 目前，重组表达的不同型的免疫血清的联合应用，大大提高了检测敏感性。酶联免疫法特异性强，灵敏度高（检测同型病毒其敏感性与RT-PCR相似），方法简便，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法。null分子生物学检测方法 由于诺如病毒基因变异性很大，ORP1的基因较ORP2的基因保守性略高，因此检测所用的引物多来自ORP1，主要在RNA多聚酶区域，但即使这样也没有一对引物能检测出所有型的病毒，但这些引物对目前引起暴发的基因型基本可以检测到。 现有的检测方法包括探针杂交、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光PCR。 探针杂交由于过程复杂，已基本不采用，现主要采用RT-PCR和实时荧光PCR，是检测病毒检测的金标准。 检测基本过程包括RNA核酸提取、PCR扩增和产物观察。 null逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：可准确、灵敏地检测标本中的诺如病毒,尤其是低浓度的感染 。该方法最大优点在于可以进一步进行病毒基因型的研究，这对于流行病学具有重要意义。 缺点：粪便中抑制PCR反应的成分多，可能影响PCR反应，造成假阴性，对此可通过稀释标本降低抑制物浓度来解决。由于诺如病毒基因变异大，目前还没有一对引物能把所有的基因型都检测出来，这也可能造成假阴性，因此如果流行病学特征明显，但检测结果阴性，应考虑换用其它引物进行检测。 采用套式PCR方法还可进一步提高检测的灵敏度，也可提高特异性。 null实时荧光PCR ：特异性和敏感性较传统RT-PCR高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。目前国内商业化的试剂主要针对GII的病毒，因此如果检测结果为阴性不能排除该病毒感染。 4、食物中NVs的检测 4、食物中NVs的检测 RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。 病毒浓缩 病毒浓缩 NVs 浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品 pH 值，使毒粒与样品微粒分开，PEG 把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。null膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。 检测海水、生活污水中的NVs曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NVs提供了参考。 核酸提取 核酸提取 食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是 RT-PCR 反应抑制因子。 NVs是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。目前应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀 RNA 相比起来，效果较好，只是成本偏高。 五、治疗五、治疗目前无特效的抗病毒药物，以对症和支持治疗为主，一般不需要使用抗生素，预后良好。 脱水是诺如病毒感染性腹泻的主要死因，对严重病例尤其是幼儿及体弱者应及时输液或口服补液，以纠正脱水、酸中毒及电解质紊乱。 六、预防与控制六、预防与控制在流行地区根据当地实际情况开展疫情监测工作，特别加强对集体单位急性胃肠炎病例异常增多情况的监测，以及时了解病毒性腹泻的流行现状、病原特征，正确判断疫情形势。 null卫生行政部门在疫情流行季节应加大食品卫生执法力度。疫情发生时采用适用于经粪-口途径传播疾病控制的卫生措施。及时隔离病人，做好排泄物和呕吐物的卫生处理；加强健康教育，养成良好的个人卫生习惯，要勤洗手，不进食生的或未彻底煮熟的海水产品（尤其是贝壳类）；做好饮用水和游泳池等娱乐水体的消毒监测。 null 谢 谢！