高效液相色谱法同时测定三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸

现代仪器(www．moderninstrs．org．cn) 高效液相色谱法同时测定三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸 李玉玉1韩虹琳1吕瑞芬2 肖宏展2杨晟杰1幸 (1．北京交通大学北京100044) (2．北京微量化学研究所北京100091) 摘要建立高效液相色谱法同时测定血浆、结石中三聚氰胺、三聚氰酸和尿酸的 。样品经超声提取、离心等前处理后，采用C18色谱柱进行分离，紫外检测测定， 外标法定量。本法简便、定量准确、精密度高、回收率理想。 关键词 高效液相色谱法血浆结石三聚氰胺三聚氰酸尿酸 前言 三聚氰胺和i聚氰酸都是常用化工原料，三聚 氰胺的生产过程中会产生副产物三聚氰酸。三聚氰 胺与三聚氰酸可以通过分子键氢键形成难溶予水的 网状结构晶体。三聚氰胺在人体内能与三聚氰酸结 合生成难溶的氰尿酸三聚氰胺复合物【11，三聚氰胺 还会与尿酸结合形成难溶性盐【2】，从而造成结石损 伤肾脏。2008年，三聚氰胺污染婴幼配方奶粉致 使我国出现大量婴幼儿泌尿系结石病历甚至死亡的 重大食品安全事故。因此，血浆、结石中三聚氰胺、 三聚氰酸、尿酸的同时测定对于研究三聚氰胺在动 物体内的转变和代谢有着重要意义。 目前，有关三聚氰胺的测定方法较多也较为成 熟，有高效液相色谱法纠、液相色谱．质谱法嗍、 气相色谱．质谱法【5】等。关于血液中尿酸的测定 方法也较多，有高效液相色谱法[61、液相色谱一质 谱法【7’等。国内外关于测定三聚氰酸的研究很少， 有气相色谱．质谱法(51和液相色谱．质谱法H1。其 中液相色谱法测定三聚氰酸的相关研究中所用的色 谱柱有戴安公司的AcclaimMixed．ModeWAX．1【8】、 默克时光公司的ZICHILIC色谱柱【4】、沃特世公司 的AtlantisHILIC色谱柱f9】，这些色谱柱都比较特 殊，且价格昂贵。本文旨在建立一个能够通过普通 的C。。色谱柱同时三聚氰胺、三聚氰酸和尿酸 的高效液相色谱法，并尝试其在血浆、结石中的实 际应用。 1实验部分 1．1 仪器 美国Agilent1100Series高效液相色谱仪，配 置二元泵、自动进样器、可变波长紫外检测器、在 线脱气机；德国SartoriusBPl21S型电子分析天 平，精确到0．00019；昆山禾创超声仪器有限公 司KH．300DB型数控超声波清洗器；美国Sigma LaboratoryCentrifuges3．15离心机；日本MG．200 型氮吹仪；津腾0．22pm针筒式微孔滤膜过滤器； 美国PhemomenexGeminiC18(4．6×250mmi．d．， 5斗m)，C18保护柱；CyberScan510型pH计；玛 瑙研钵。 1．2试剂 乙腈(FisherScientificCo．，色谱纯)，三聚氰 胺(北京化学试剂公司，含量：99．5％以上，分析纯)， 三聚氰酸(北京化学试剂公司，含量98．O％以上， 分析纯)，尿酸(AlfaAesar，含量：99％以上，分 析纯)。磷酸氢二钾(北京益利精细化学品有限公司， 含量99．O％以上，分析纯)，磷酸二氢钾(国药集 团化学试剂有限公司，含量99．5％以上，分析纯)， 氢氧化钠(北京化学试剂公司，含量96．O％以上， 分析纯)，所用超纯水来自Milli-Q超纯水系统(法 国Millipore公司)。 1．3样品处理 1．3．1血浆的处理称取血浆O．10009于lOmL离 心管中，加入6mL乙腈水(V：V=2：1)，超声 30min充分提取，9000r／min离心15min，将上清 液全部倒人10mL玻璃小瓶中，氮气吹干后加2mL 纯水复溶，过0．22斗m膜后，供液相色谱测定。 1．3．2结石的处理将结石用玛瑙研钵研成细 粉后准确称量O．OlOOg于lOmL离心管中，加入 6mL纯水，超声30rain充分提取，9000r／mm离心 15rain，将上清液全部倒入10mL玻璃小瓶中，过 0．22斗m膜，再稀释20倍后，供液相色谱测定。 1．4色谱条件 流动相：100％磷酸盐缓冲溶液(K2HP04+ ’通讯作者：杨晟杰，北京交通大学理学院；邮编：100096；电话：010-86386799，E-mail：shjyang@bjtu．edu．cn 30 万方数据 研究报告 KH2P04，10mmol／L，pH=7．50)；流速：lmL／min； 柱温：室温；检测波长：200nm；进样量：20斗L。 1．5标准曲线的制作 用纯水将三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸的标准储 备液逐级稀释，分别配制成质量浓度为50129／mL， 20I．tg／mL，lO“g／mL，51ag／mL，lI．tg／mL，0．1lag／mL 的单一标准溶液。由于三聚氰胺响应较高，故最低 浓度再加一个0．051,tg／mL。在1．4色谱条件下各进 样20斗L，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制 标准曲线，得线性回归方程。 2结果与讨论 2．1标准溶液溶剂的选择 溶剂的选择需要考察溶质的溶解性。l列出 3种物质在水中的溶解性，从表中可以看出尿酸在 水中的溶解性较低，而易溶于氢氧化钠溶液。为同 时满足3种物质的溶解条件，假设选择氢氧化钠溶 液为溶剂。三聚氰酸可以溶于氢氧化钠溶液，符合 条件。三聚氰胺呈弱碱性(pH值=8)，遇强酸或 强碱水溶液发生水解，胺基逐步被羟基取代，最后 生成三聚氰酸。针对三聚氰胺，需要考察不同浓度 的氢氧化钠溶液对三聚氰胺的影响。 表1 3种物质在水中的溶解性(常温) 溶解性 三聚氰胺可溶于水，3．39／L 三聚氰酸可溶于水，2．79／L 尿酸 微溶于水，0．069／L易溶于1mol／L氢氧化 二===二 纳盗速：§Q吐 分别以超纯水、lmol／LNaOH水溶液、0．1 mol／LNaOH水溶液、lmmol／LNaOH水溶液配制 同浓度的三聚氰胺溶液(2001,tg／mL)。准确称取 0．00209三聚氰胺溶于10mL溶剂中涡旋混匀后稀 释20倍至10“g／mL进质谱分析(稀释溶剂与溶 解溶剂一致)。 以纯水为溶剂的三聚氰胺标准溶液在ESI+模 式下127．3(即三聚氰胺的加氢离子峰)的响应很 高，而所有氢氧化钠溶液作为溶剂的三聚氰胺标准 溶液，在质谱中都找不到对应的离子，这说明浓度 高于lmmol／L的氢氧化钠溶液都会使三聚氰胺发 生变质。而lmmol／L的氢氧化钠溶液，可以溶解 尿酸的最大浓度为50肛g／mL。为保证定量曲线浓 度范围，不再考虑更低浓度的氢氧化钠溶液。 因此，氢氧化钠溶液不适合作为3种物质共同 的溶剂，最终确定三聚氰胺与三聚氰酸的溶剂为超 纯水，尿酸的溶剂为lmmol／L的氢氧化钠溶液。 2．2提取溶剂的选择 血浆由于大量血红蛋白的存在严重影响色谱分 析，所以对于血浆的前处理需要沉淀蛋白，通常使 用乙腈来达到这一目的。实验讨论不同比例的乙腈 水溶液(1：l；2：l；3：1)作为提取溶剂的效果。 实验发现乙腈水比例为l：1时，离心后上清液呈 橘红色，而乙腈水比例2：1和3：1时，蛋白沉 淀效果较好，离心后上清液通透，呈无色。考虑到 不浪费乙腈，提取溶剂采用2：1的乙腈水溶液。 2．3色谱条件的选择 2．3．1 检测波长的选择三聚氰胺的最大吸收波 长为240nm，尿酸的最大吸收波长为280nm，三 聚氰酸的最大吸收波长为200nm。为保证三聚氰酸 的良好检测，检测波长确定为200hm。 2．3．2流动相的选择本实验中流动相的选择和优 化，应使3种物质充分分离，并尽量与基质中干扰 物质分离。因此各物质问必须保持合适的分离度。 本实验考察5％乙腈：95％磷酸盐缓冲溶液(K：HP04 +KH2P04，10mmol／L，pH=7．50)、100％磷酸盐缓 冲溶液(K2HP04+KH2PO,，10mmol／L，pH=7．50) 的流动相体系，结果发现：采用5％乙腈：95％磷 酸盐缓冲溶液(K2HP04+KH2P04，10mmol／L， pH=7．50)流动相体系时，3种物质的峰无法得到充 分分离。而采用100％磷酸盐缓冲溶液(K2HPO。+ KH2P04，10mmol／L，pH=7．50)的流动相体系，标 准溶液的稀释溶剂为2：1乙腈水时，3种物质的峰 依然无法得到很好的分离。当标准溶液用纯水配制， 纯水稀释后，3种物质的峰得到很好的分离。本实 验采用100％磷酸盐缓冲溶液(K2HPO。+KH2PO。， 10mmol／L，pH=7．50)流动相体系，标准溶液的稀 释溶液为超纯水，且样品用2：1乙腈水溶液提取 离心后的上清液需要吹干并用超纯水进行复溶。 2．4标准曲线及线性关系 以浓度(x)对峰面积(Y)作标准曲线，得线 性回归方程，三聚氰酸与尿酸在O．1～50t29／mL范围 内线性关系良好。三聚氰胺在0．05～50．g／mL范围内 线性关系良好，其线性方程和相关系数(见表2)。 表2 3种物质的线性方程和相关系数 2．5精密度实验 趾2--"聚氰胺51,tg／mL的标准溶液为例，连续进 样测定6次，得到的结果(见表3)。 3l 万方数据 现代仪器(洲．moderninstrs．org．cn) 表3三聚氰胺的精密度实验结果 (nlin) 6．0416．045 6．046 6·046O·1281 峰面积笔黧篡冀2222661M．2226们o．062t 2．6最低检出限与最低定量限 根据性噪比(S／N)为3确定方法的最低检出限。 性噪比为10确定方法的最低定量限(见表4)。 表4最低检出限与最低定量限 2．7样品测定 在1．4色谱条件下，三聚氰酸、尿酸、三聚氰 胺的标准溶液(10．dmL)的色谱图(见图1)，按1．3、 1．4中所述样品处理和色谱条件进行测定，血浆空 白样品，血浆空白样品分别添加三聚氰酸、尿酸、 三聚氰胺、结石样品的色谱测定结果(见图2～6o 图1 3种物质的标准溶液的高效液相色谱图(10llg／mL) 1．三聚氰酸；2．尿酸；3．三聚氟胺 I．尿酸 I．三聚氰酸；2．尿酸 32 1．尿酸 图5血浆空白样品添加三聚氰胺的高效液相色谱图 1．尿酸；2．三聚氰胺 1．三聚氰胺 2．8回收率 取空白血浆分成3组，分别为添加三聚氰酸组、 添加尿酸组、添加三聚氰胺组。每组血浆平均分成 3份，其中1份为空白，另外2份分别添加不同浓 度的标准物质。按1．3、1．4中所述样品处理和色谱 条件分别进行测定。结果表明：三聚氰酸、尿酸、 三聚氰胺的回收率在92．6％～101．3％之间，回收 率良好。 表5回收率实验结果 3结论 本文建立高效液相色谱法测定血浆、结石中三 聚氰酸、尿酸、三聚氰胺的同时检测方法，该方法 简便、结果准确、可靠，具有良好的灵敏度、分离度、 精密度，回收率理想。该方法可用于三聚氰胺在动 物体内转变代谢研究中血浆、结石等的成分分析。 参考文献 1胡虎，盛宏强，马晓琼等．三聚氰胺及其同系物三聚氰酸 的生物学效应和毒理学研究进展，浙江大学学报(医学 版)，2008。37(6)：544-,-550 2孙宁，沈颖，李旭冉等．婴幼儿三聚氰胺相关泌尿系 (下转第41页) 万方数据 研制与开发 $3C2440处理器，能够满足实时采集大量心率数 据并做出是否电击除颤的要求，同时系统运行在 Linux操作系统，大大增强系统的可靠性。同其他 AED相比较，本系统实时性强，系统稳定，智能 方便，具有很好的应用前景。 参考文献 1胡大一．推动AED任重而道远【J】，临床心电学杂志， 2008，17(4)：244～245 2班东坡．人体电阻抗测量系统设计[D】，天津：天津大学， 2004 3刘文，唐辉，商洪涛．光电脉搏传感器在脉搏采集中的 研究[J】，中国医学装备，2005，(9)：22～23 4王黎明，陈双桥等．ARM9嵌入式系统开发与实践【M】。 北京：北京航空航天大学出版社，2008 5宋宝华．Linux设备驱动开发详解【M】，北京：人民邮电 出版社。2008 6CorbetJonathan，RubiniAlessandro，Kroah2HartmanGreg． Linux设备驱动程序【M】第3版．魏永明，译．北京：中国 电力出版社，2006 DesignofcontrolsystemforAEDbasedonARMandLinux XiaJianqiLinJianzhongCaiJindal (CollegeofMechanicalEngineeringUniversityofShanghaiforScienceandTechnologyShanghai200093) AbstractThepaperproposedadesignschemeofcontrolsystemforautomatedexternaldefibrillatordesigned withembeddedprocessor$3C2440basedonARM9kemal，introducedhumanbodyimpedancemeasurementsys— tem，heartratemeasurancesystemandcompositionofthesystem’Shardwarestructureanddesignofdefibrillator controlsoftwarebasedonembeddedLinuxoperationsystemindetails，anddescfibedfunctionsdivisionofsystem softwareandrealizationofcontrolstrategy．Theautomatedexternaldefibrillatorhavefunctionsofcardiacrhythm analysissystemandshockadvisorysystem． Keywords$3C2440EmbeddedLinuxAutomatedexternaldafibrillator(AED) (上接第32页) 结石并发急性肾衰竭诊疗分析，中华儿科杂志，2008， 46(11)：810-815 3王亚吨，林海丹，邓国东等．反相高效液相色谱法测定饲 料中三聚氰胺的含量，广东饲料，2008，17(3)：4143 4MichaelSmoker．AlexanderJ．Krynitskyeta1．InterimMethod forDeterminationofMelamineandCyanicAcidResiduesIn FoodsusingLC—MS／MS：Version1．0，U．S．FoodandDrug Adminstration，2008 5李峰格，姚伟琴，苏敏等．气相色谱．质谱法快色测定牛 奶中的三聚氰胺和三聚氰酸，色谱，2009，27(2)：233—236 6郁颖佳，郑晓伟，黄滔敏等．高效液相色谱测定人体血 浆中尿酸的浓度，复旦学报(医学版)，2006，33(2)： 273—275 7戴新华，杨梦瑞，金灿．液相色谱．同位素稀释质谱法准 确测定血清中的尿酸，计量技术，2008，10：27～30 8LeoWang。StacyM．Henday．戴安公司为您提供同时测定 三聚氰胺和三聚氰酸的解决，2008 9祝伟霞，袁萍，杨冀州等．亲水色谱．串联质谱法对牛奶 与奶粉中三聚氰胺及其衍生物含量的测定，分析测试学 报，2008，27(12)：1288～1292 Simultaneousdeterminationofmelamine，cyanicacidanduricacidby HPLC LiYuyulHanHonglinlLvRuifen2XiaoHongzhan2YangShengiiel· (1．BeijingJiaoTongUniversity,Beijing100044) (2．BeijingInstituteofMicrochemistry,Beijing100091) AbstractHighperformanceliquidchromatographicmethod(HPLC)havebeendevelopedforthesimultaneous determinationofMelamine，CyanicAcidandUricAcidinbloodandurinarycalculi．Inthisprocedure，melamine， cyanicacidanduricacidareextractedfrombloodwithacetonitrile-waterextractionsolution(v：v=2：1)andfrom ultrasoundwithwater,followedbyultrasoundfor30minandcentrifugationfor15min．Theextractionfromblood needtobedryedandredissolvedinwater．TheanalytesareseparatedbyHPLCusingaC18column．Themethod issimpleandaccurateforthesimultaneousdeterminationofthesethreecompounds．Ithashi【ghrelativestandard deviation(RSD)andperfectcoemcientofrecovery． KeywordsHPLCBloodUrinarycalculiMelamineCyanicacidUricacid 41 万方数据 高效液相色谱法同时测定三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸 作者： 李玉玉， 韩虹琳， 吕瑞芬， 肖宏展， 杨晟杰， Li Yuyu， Han Honglin， Lv Ruifen ， Xiao Hongzhan， Yang Shengjie 作者单位： 李玉玉,韩虹琳,杨晟杰,Li Yuyu,Han Honglin,Yang Shengjie(北京交通大学,北京,100044) ， 吕瑞芬,肖宏展,Lv Ruifen,Xiao Hongzhan(北京微量化学研究所,北京,100091) 刊名： 现代仪器 英文刊名： MODERN INSTRUMENTS 年，卷(期)： 2010,16(4) 参考文献(9条) 1.祝伟霞;袁萍;杨冀州 亲水色谱-串联质谱法对牛奶与奶粉中三聚氰胺及其衍生物含量的测定[期刊论文]-分析测 试学报 2008(12) 2.Leo Wang;Stacy M Henday 戴安公司为您提供同时测定三聚氰胺和三聚氰酸的解决方案 2008 3.戴新华;杨梦瑞;金灿 液相色谱-同位素稀释质谱法准确测定血清中的尿酸[期刊论文]-计量技术 2008(10) 4.郁颖佳;郑晓伟;黄滔敏 高效液相色谱测定人体血浆中尿酸的浓度[期刊论文]-复旦学报（医学版） 2006(02) 5.李峰格;姚伟琴;苏敏 气相色谱-质谱法快色测定牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸 2009(02) 6.Michael Smoker;Alexander J.Krynitsky Interim Method for Determination of Melamine and Cyanic Acid Residues In Foods using LC-MS/MS:Version 1.0 2008 7.王亚吨;林海丹;邓国东 反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量[期刊论文]-广东饲料 2008(03) 8.孙宁;沈颖;李旭冉 婴幼儿三聚氰胺相关泌尿系结石并发急性肾衰竭诊疗分析[期刊论文]-中华儿科杂志 2008(11) 9.胡虎;盛宏强;马晓琼 三聚氰胺及其同系物三聚氰酸的生物学效应和毒理学研究进展[期刊论文]-浙江大学学报 （医学版） 2008(06) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdyq201004010.aspx