自体骨髓间质干细胞移植治疗缺血性脑损伤的实验研究

�论 � 著� 自体骨髓间质干细胞移植治疗缺血性脑损伤的实验研究* 张峰1 ,步星耀2 ,张圣旭2 ,李志营2 ,刘猛2 � � 摘要!� 目的:研究自体骨髓间质干细胞移植对大鼠缺血性脑损伤的治疗作用及机制。方法:采用线拴法制作成年 雄性 SD大鼠脑缺血再灌注模型 40 只,随机分成磷酸盐缓冲液对照组和骨髓间质干细胞移植治疗组各 20 只, 分别在 1 周后经颈动脉将标记 5�溴脱氧尿嘧啶的 2∀ 106 骨髓间质干细胞悬液和等体积磷酸盐缓冲液植入脑缺血大鼠体内。术 后每天进行神经功能缺损评分,再灌注后 1, 2, 3, 4 周分别取受损伤脑组织, 检测不同时间点体感诱发电位与组织病理 学,并采用免疫组化方法检测脑源性神经营养因子的表达。结果: 治疗组在移植后各时间点神经功能缺损评分均明显低 于对照组( P< 0. 05) ;治疗组神经细胞变性坏死数量减少, 水肿明显减轻, 体感诱发电位在各时间点的恢复较对照组差 异均有统计学意义(P < 0. 05) ;治疗组脑源性神经营养因子表达水平明显高于对照组( P < 0. 05)。结论: 自体骨髓间质 干细胞移植对大鼠缺血性脑损伤有治疗作用,其机制可能与分泌脑源性神经营养因子等神经保护性因子有关。 � � 关键词!� 缺血性脑损伤;骨髓间质干细胞; 移植;神经营养因子;诱发电位 � � 中图分类号: 651. 1+ 5 � � 文献标识码: A � � 文章编号: 1674�3474( 2009) 03�0240�04 Autologous mesenchymal stem cells transplanting for ischemic brain injury ZHANG Feng, BU Xingyao, ZHANG Shengxu, et al. Depar tment of Neuro surgery, the Fir st Af filiated Hospital to Henan Univer sity o f Science and T echno logy, Luoyang 471003, China � � Abstract! Objective To invest ig ate the effect and mechanism o f autolog ous mesenchymal stem cells t ransplanted for ischem ic br ain injury in r ats. Methods T he model of rats about cerebral ischem ia� reperfusion injury w as established w ith suture emboli method. Fo rty adult male SD rats w ere randomly divided into contro l group and treatment g roup ( t reated w ith mesenchymal stem cells) . One w eek later, 2 ∀ 106 mesenchymal stem cells labeled w ith bromodeoxyuridine and the same volume of phosphate buffer ed so lut ion w ere t ransferred into tr eatment group and contr ol g roup respect iv ely through ex ter nal carot id artery. T he neurolog ical defects o f rats w er e evaluated every day after operat ion. The cerebral t issue w as obtained at 1, 2, 3, 4 w eeks after cerebr al ischemia�reperfusion injury, and areas of infarct were invest igated w ith HE dyeing. T he somatoseneo ry evoked potent ial and histopatho logy w er e exam ined at differ ent t ime points. Results The neurolo gical defects of tr eatment group w ere much low er than contro l g roup. Compared w ith contro l group, histopatho logy of brain tissue presented that quantity o f degenerativ e and necrot ic neuro cyte reduced, dropsy lessened obviously in t reatment group, somatosensor y evoked potent ials o f r ats no ticeable recovery in different time po ints( P< 0. 05) . T he expression of brain�derived neuro tr ophic factor in tr eatment g roup w as higher than that in contro l g roup( P< 0. 05) . Conclusion T he transplanted mesenchymal stem cells could reliev e cerebr al ischemia�r eper fusion injur y. T he mechanism may be the secret ing of the brain� derived neur ot rophic factor. � � Key words! Ischemic brain injury; mesenchymal stem cells; t ransplantat ion; neurot rophic factor s; evoked potent ials * 基金项目:河南省科技攻关项目资助( 0424410054) 作者单位: 1.河南科技大学第一附属医院神经外科,洛阳市 471003; 2. 河南省人民医院神经外科 作者简介:张峰( 1976年- ) ,男,硕士,住院医师,研究方向:血管神经外 科。 通讯作者:步星耀( 1965年- ) ,男,博士后,主任医师,研究生导师,研究 方向:微创修复神经外科。 � � 脑血管疾病是中枢神经系统常见病、多发病, 也是 目前人类疾病死亡的三大原因之一, 病死率和致残率 均较高,其中缺血性脑损伤是主要原因。脑缺血性损 伤后, 坏死的神经组织不能自然恢复。内源性神经干 细胞虽然能启动自发修复反应,但数量有限, 不能起到 临床效果。因此研究探索治疗缺血性脑损伤的新方法 �240� 中华实用诊断与治疗杂志第 23卷第 3期 一直是人们关注的焦点。近年来发现, 骨髓间质干细 胞( mesenchymal stem cel ls, M SCs)是骨髓中能够向 多胚层分化的非造血干细胞,具有多向分化潜能和自 我更新能力,并参与组织细胞的替代和修复 [ 1�2]。本研 究采用线拴法制作大鼠脑缺血再灌注模型, 通过体外 培养 MSCs,经颈外动脉移植治疗缺血性脑损伤,进一 步研究 MSCs脑保护及修复的作用机制, 为探索治疗 缺血性脑损伤的新方法提供依据。 1 � 材料与方法 1. 1 � 材料 � 健康成年 SD雄性大鼠(由河南省实验动 物中心提供) 40只,体质量 250~ 300 g/只,随机分为2 组,磷酸盐缓冲液( phosphate buf fered solut ion, PBS) 对照组和 MSCs治疗组各 20 只, 每组再随机分为 1, 2, 3, 4周 4个时间点, 每组每个时间点各 5只。 1. 2 � 药品和试剂 � DMEM 培养基由美国 GibcoBRL 公司提供; 胎牛血清( fatal bovine serum, FBS )由美 国 Hyclone公司提供;淋巴细胞分离液由上海恒信公 司提供; 5�溴脱氧尿嘧啶( Brdu)及兔抗脑源性神经营 养因子( brain�derived neurot rophic factor, BDNF)单 克隆抗体由武汉博士德生物工程公司提供; 鼠抗 Br du 单克隆抗体由北京中山生物技术有限公司提供。 1. 3 � 动物模型制作及成功的判定 � 参照文献[ 3]采用 线栓法建立 SD大鼠大脑中动脉闭塞模型。观察其体 征,出现以下体征者表明模型制作成功: 右侧肢体瘫 痪,以前肢为重,表现为提尾时大鼠右前肢屈曲,内收; 或者行走时向右侧转圈或倾倒。 1. 4 � 骨髓 MSCs培养、Br du 标记与移植 � 取 250~ 300 g 健康成年 SD 大鼠, 麻醉后,无菌条件下从双侧 四肢胫骨平台抽取骨髓 1 mL, 与等体积的 PBS 混合 后, DMEM 洗涤, 胰酶消化传代。取第 4 代的骨髓 MSCs, 在移植前 1 d以终浓度为 0. 1 mmol/ L 的 Br du 标记。移植时, 制成单细胞悬液, 移植细胞个数为 2 ∀ 106 ,治疗组在缺血 2 h 再灌注 1 周后经颈动脉注 入。 1. 5 � 神经功能缺损评分 � 采用爬行记分法[ 4] ,即将长 2 m ,宽 2. 5 cm 的木杆一端抬高 45#,术前 3 d 训练大 鼠由低向高爬行, 直至熟练爬完全程。将木杆分为 4 段,大鼠在每段的爬行按 6 分计算, 共 24分, 4 段相 加,即得到其最后得分。计分: 6 分: 不能爬行或 滚落或趴于患侧; 5分:患侧肢体拖行; 4分: 跌落或滑 倒∃3次; 3分: 无滑落,但对侧后爪不触及木条侧面; 2 分:单侧爬行(肌力下降) ; 1分:四肢支撑变宽, 位于木 杆下; 0分: 正常, 无明显神经功能缺陷。于术后每天 观察、评分。 1. 6 � 体感诱发电位的测定 ( somato seneory evoked potential, SEP ) � 大脑皮质 SEP 检测采用尼高力 Viking %型肌电诱发电位仪,分别于大脑中动脉闭塞 术前、术后 1周(移植前)以及移植后 1, 2, 3, 4 周对 3 组大鼠胫神经进行 SEP 检测。大鼠用 250 g/ L 乌拉 坦浅麻醉(睁眼、清醒、四肢肌张力降低)。记录电极放 置在矢状缝与两耳尖连线的交点上, 参考电极安置在 额极, 接地电极安置在大腿肌肉丰富处。刺激方式为 直流电脉冲, 刺激部位在踝部的胫神经, 刺激强度为 14~ 24 mA,刺激频率为 2 Hz,刺激时程 0. 2 ms, 叠加 次数> 400次。观察指标:治疗组和对照组脑缺血大 鼠在 SEP 测定中 P1�N1峰峰值、P1潜伏期及 N1潜伏 期的差异。 1. 7 � 标本及切片制备 BDNF、Brdu表达检测 � 各组 于相应时间点将大鼠深度麻醉,迅速开胸暴露心脏,行 主动脉插管, 剪开右心耳作为灌注液流出口,在 10~ 20 min经左心室灌注 37 & 生理盐水 200 mL 快速冲 洗,然后灌注 4%多聚甲醛/ 0. 01 mol/ L FBS ( 4 & , pH= 7. 4 ) 300 mL 灌注固定, 40 m in内灌注完,迅速 断头取脑。取大鼠视交叉后 6~ 11 mm 的脑组织, 制 备石蜡切片。免疫组化染色检测 BDNF, Brdu 表达参 照文献[ 5]方法进行, 结果用阳性细胞数表示。BDNF 细胞浆中呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; Brdu细胞核中 呈棕黄色颗粒者为阳性细胞, 在 400倍光镜下选定脑 组织相关部位切片, 统计 5个视野下的阳性细胞数,取 平均值,每例标本选 5张切片。 1. 8 � 统计学处理 � 应用 SPSS 12. 0进行统计分析,所 有统计结果均以均数 ∋ 标准差( �x ∋ s)表示。两样本均 数比较采用 t检验,取 �= 0. 05作为检验水准。 2 � 结 � 果 2. 1 � 实验动物数量分析 � 实验选用大鼠 40只,全部 进入结果分析, 中途无脱落。 2. 2 � 神经功能缺损评分 � 对照组神经功能缺损明显, 治疗组神经功能缺损恢复显著。对照组在各时间点神 经功能缺损评分明显高于治疗组, 组间比较差异有统 计学意义( P< 0. 05)。见表 1。 表 1� MSCs 对大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损评定的 影响 � ( �x ∋ s) 组别 1周 2周 3周 4周 对照组 15. 78 ∋ 2. 65 14. 42 ∋ 3. 23 11. 42 ∋ 3. 30 9. 82 ∋ 2. 19 移植组 9. 77 ∋ 2. 541) 7. 31 ∋ 1. 881) 6. 97 ∋ 2. 461) 4. 89 ∋ 1. 141) � � 注: 1)与对照组相比 P < 0. 05。 2. 3 � 脑组织病理变化( HE 染色) � 对照组和移植组 均可见明显梗死灶, 位于基底节、皮质下白质和皮层, 缺血区可见神经细胞变性、坏死,呈胞体皱缩,核固缩、 碎裂、溶解,胞浆浓缩红染,神经纤维疏松,间质水肿明 显,炎症细胞浸润。脑缺血再灌注各个时间点,治疗组 病理变化较对照组减轻, 神经细胞变性、坏死数量明显 变少,间质水肿较轻。见图 1�2。 �241�中华实用诊断与治疗杂志第 23卷第 3期 2. 4 � 脑组织 BDNF、Br du 阳性细胞表达 � 光镜下对 照组未见到 Brdu 阳性细胞, 治疗组各时间点在梗塞 半球有大量 Brdu 阳性细胞, 对侧半球也可见少量 Brdu阳性细胞,主要存在于大脑皮质、皮质下和海马 等处,同时在血管内皮细胞处也可见到 Brdu 阳性细 胞(见图 3�4)。对照组和治疗组 BDNF 的表达水平均 在 1周时开始明显升高,第 2 周达高峰(见图 5�6) ,之 后表达开始下降。治疗组表达升高程度更为明显, 高 表达时程明显延长, 于第 4周仍高于对照组。组间比 较差异有统计学意义( P< 0. 05)。见表 2。 图 3� 培养的 M SCs Brdu 标记阳性( ∀ 400)� � � � 表 2� MSCs 对大鼠脑缺血再灌注后 BDNF 表达的 影响 � ( �x ∋ s) 组别 1周 2周 3周 4周 对照组 38. 42 ∋ 6. 35 51. 46 ∋ 5. 41 39. 43 ∋ 5. 83 21. 92 ∋ 5. 03 移植组 38. 25 ∋ 5. 61 65. 81 ∋ 7. 861)60. 48 ∋ 6. 461)45. 71 ∋ 6. 671) � � 注: 1)与 PBS组相比 P< 0. 05。 2. 5 � MSCs 移植对 SEP 的影响 � 应用 SEP 测定了 P1�N1峰峰值、P1 潜伏期和 N1 潜伏期 3 项指标, MSCs移植治疗大鼠各项指标与移植前相比有所好转 ( P< 0. 05或 P< 0. 01) ;治疗组与对照组相比, 差异有 统计学意义( P< 0. 05或 P< 0. 01)。见表 3�4。 表 3� P1�N1 峰峰值的测定结果 � ( �x ∋ s, �V) 组别 MCAO 术前 移植前 移植后 1 周 移植后 2 周 移植后 3 周 移植后 4周 移植组 4. 85 ∋ 1. 84 2. 34 ∋ 1. 62 2. 56 ∋ 1. 34 3. 43 ∋ 0. 93 3. 98 ∋ 1. 90 4. 26 ∋ 1. 53 对照组 4. 37 ∋ 1. 77 2. 37 ∋ 1. 09 1. 59 ∋ 0. 67 2. 81 ∋ 0. 77 3. 12 ∋ 1. 62 3. 57 ∋ 1. 34 �242� 中华实用诊断与治疗杂志第 23卷第 3期 表 4 � P1 潜伏期测定结果( �x ∋ s, ms) 组别 移植前 移植后 1周 移植后 2周 移植后 3周 移植后 4周 移植组 17. 33 ∋ 2. 35 17. 05∋ 1. 67 15. 70 ∋ 1. 96 14. 12 ∋ 2. 21 14. 07 ∋ 3. 01 对照组 17. 44 ∋ 3. 25 17. 87∋ 1. 41 17. 26 ∋ 3. 27 16. 62 ∋ 3. 20 16. 52 ∋ 1. 87 3 � 讨 � 论 诱导多能干细胞分化为新的组织细胞进行细胞移 植,借助于体外分离纯化和培养扩增技术直接移植,或 基因修饰后移植以修复受损的脑组织, 是近年研究热 点[ 6�7]。MSCs由于具有强大的增殖能力和多向分化 潜能,易于从骨髓中分离培养、纯化及体外扩增,自体 移植不存在免疫排异反应问题, 越来越受到国内外学 者重视。MSCs移植治疗脑损伤是一种很有前景的治 疗策略[ 1�2]。 本研究采用自体 MSCs移植, 结果显示其神经功 能改善明显好于对照组, 与 Zin�kova 等[ 8] 研究结果一 致。脑生物电活动检测为神经功能的恢复提供了物质 基础, P1�N1峰峰值、P1 潜伏期和 N 1潜伏期 3 项指 标,分别从不同方面检测神经系统电生理变化,结果显 示,治疗组与对照组 SEP 波幅和潜伏期均有明显恢 复,而这种脑生物电的变化可能通过 2种途径产生: ( 脑缺血时,移植的MSCs刺激局部微环境改变,病变脑 组织产生自我修复功能, 使脑生物电发生变化; ) 移植 的 MSCs分化为神经细胞,这些有功能的神经细胞产 生脑生物电的恢复。结果表明, M SCs 移植对脑缺血 性损伤所致神经功能缺损有一定的修复治疗作用。组 织病理观察发现,治疗组较对照组脑组织神经细胞变 性、坏死数量明显变少,炎症细胞减少, 间质水肿减轻。 提示, M SCs移植治疗对脑缺血性损伤具有神经保护 作用,这为 MSCs移植治疗缺血性脑损伤提供了实验 依据,表明 MSCs可能是治疗缺血性脑损伤较为切实 有效的种子细胞,为临床缺血性脑损伤的治疗开辟了 新途径[ 1�2]。 本研究发现, Brdu标记的 MSCs主要位于缺血侧 大脑半球的缺血周边区的大脑皮质、海马及血管内皮 细胞处,而对侧半球仅有少量表达。说明 MSCs经颈 动脉移植后部分细胞存活并迁移。缺血性损伤的脑组 织 BDN F 表达水平较正常脑组织显著升高, BDNF 阳 性细胞主要见于梗死灶周围皮质、海马; BDNF 表达水 平是在缺血性脑损伤 1周时开始明显升高,第 2周达 高峰,之后表达开始下降; M SCs移植治疗缺血性脑损 伤使损伤的脑组织 BDNF 表达升高程度更为明显,高 表达时程明显延长, 于第 4周仍高于对照组。结果表 明,缺血性脑损伤后大鼠脑内 BDNF 表达水平升高可 能是神经细胞的一种自我保护机制; MSCs 移植后部 分细胞存活并迁移至缺血灶周围的皮质、海马及血管 内皮细胞处, 明显改善神经功能, 减轻脑组织病理变 化, 其作用机制可能与分泌多种神经营养因子如 BDNF 表达显著上调有关。 MSCs移植治疗缺血性脑损伤作用机制可能包括 以下方面[ 1�2] : ( 1) M SCs 与宿主神经细胞相互作用导 致MSCs自分泌营养因子或周围脑组织旁分泌营养因 子的增加,可能有助于损伤神经的恢复[ 9]。( 2) M SCs 移植后,可在脑缺血或坏死信号的诱导下迁移至缺血 组织,并分化为神经元样细胞和星型胶质样细胞, 以修 复坏死的神经组织,使神经功能得到改善。但这些细 胞是否能与脑组织融合, 并同宿主神经细胞建立突触 联系,参与宿主神经功能的重建及修复,还有待研究证 实。( 3) M SCs通过分泌某些因子激活内源性存在于 室管膜区、脑室下区域和海马等部位的神经干细胞,使 其发挥功能代偿作用。这一观点尚需进一步研究证 实。( 4) M SCs可参与正常的基质代谢, 修复细胞外基 质,促进神经元的增殖、分化和迁移, 参与中枢神经系 统损伤的修复[ 10] 。 4 � 参考文献 1!� 步星耀,李志营,张永福.骨髓间质干细胞移植在神经科学领域的 应用研究[ J] .河南医学研究, 2005, 14( 4) : 376�379. 2!� 步星耀,黄志起,张永福.骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑损 伤的研究进展[ J] .实用诊断与治疗杂志, 2004, 18( 2) : 113�115. 3! � Kuge Y, Minem atsu K, Yamaguchi T, et al . 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