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自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑创伤的实验研究

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自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑创伤的实验研究 � 306�� � 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J Transplan t ( E lectron ic Ed ition) , November 2009, Vol 3, No. 4 � � 基金项目: 河南省杰出人才计划项目 ( 084200410011) � � 作者单位: 450003郑州, 河南省人民医院神经外科 (刘猛、步星 耀、程培训、张圣旭 ) ;河南省眼科研究所 (鲍玉洲 ) � � 通讯作者: 步星耀, Em a i:l bux ingyao@ 126...
自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑创伤的实验研究
� 306�� � 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J Transplan t ( E lectron ic Ed ition) , November 2009, Vol 3, No. 4 � � 基金项目: 河南省杰出人才项目 ( 084200410011) � � 作者单位: 450003郑州, 河南省人民医院神经外科 (刘猛、步星 耀、程培训、张圣旭 ) ;河南省眼科研究所 (鲍玉洲 ) � � 通讯作者: 步星耀, Em a i:l bux ingyao@ 126. com � 实验研究� 自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑创伤的 实验研究 刘猛 � 步星耀 � 程培训 � 张圣旭 � 鲍玉洲 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 摘要!� 目的 � 探讨自体骨髓间充质干细胞 ( BM SC)移植治疗脑创伤的疗效和机制。方法 采用 Feeney DM 方法将 Sprague�Daw ley大鼠制作脑创伤模型后随机分为自体 BM SC移植治疗组 和生理盐水对照组。用神经功能缺损评分 ( NSS)和 Y型电迷宫测试大鼠神经功能, 采用免疫组 织化学方法检测 5�溴脱氧尿嘧啶核苷 ( BrdU )、胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)、脑源性神经营养因子 ( BDNF )、nestin和∀因子,采用 TUNEL法检测细胞凋亡。结果 � 与对照组相比,自体 BM SC移植 治疗组大鼠 NSS评分降低、Y型电迷宫实验错误反应次数减少, 脑组织水肿和坏死面积及瘢痕形 成均减少, B rdU /GFAP荧光双标、BDNF、nestin阳性达细胞数和微血管数均增多, 细胞凋亡数 减少 (均 P < 0. 05)。结论 � 手术移植的自体 BMSC可在脑损伤区存活、增殖、分化, 促进神经营 养因子分泌, 减少细胞凋亡,参与损伤区新生血管生成和组织修复,从而促进神经功能恢复。 � � 关键词!� 骨髓间充质干细胞; � 自体移植; � 创伤性脑损伤 Experim ental study on auto logous bonemarrowm esenchymal stem cell transp lantation for traumatic brain in jury � LIU M eng*, BU X ing�yao, CHENG P ei�xun, ZHANG Sheng�xu, BAO Yu�zhou. * Depar tm ent of N eurosurgery, H enan Provincial P eop le# sH osp ital, Zhengzhou 450003, China Corresp ond ing author: BU X ing�yao, Em ail: bux ingyao@ 126. com � � Abstract!� Objec tive� To explore the e fficacy and mechan ism of treating traum atic brain injury ( TBI) in rats by surg ical transplantation o f auto logous bone m arrow mesenchyma l stem cells ( BMSC ). M ethods� After be ing g iven TBI by using Denn is M. Feeney method, Sprague�Daw ley rats were random ly d iv ided into the treated group in w hich auto logous BM SC w ere transplanted into the trauma area by surg i� ca l opera tion and the contro l group w ith sa line. Function o f the nervous system in rats was ana lyzed by Y�e lectric maze test and the neuro log ical severity scores ( NSS). H istopatho logy was observed and immu� noh istochem istry w as perform ed to detect bromodeoxyur id ine ( BrdU ), g lia l fibrillary acid ic pro te in ( GFAP ), brain�de rived neurotrophic factor ( BDNF ), nestin, and factor ∀ antigen. Te rm ina l deoxynu� cleo tidy l transferase b iotin�dUTP nick end labeling ( TUNEL ) was used to detect apoptosis o f ce lls. R esults� In the treated group, the NSS scores and error reaction tim es in Y� electr ic maze tests w ere significantly low er and fewer, the edem a and necros is area and neura l scar fo rma tion were less, the num� ber o f B rdU /GFAP positive ce lls, expression o f BDNF, and nestin and ang iogenesis w erem uch g reater, and the number of apoptotic cellsw as sign ificantly few er as com pared to thoses in the contro l group (P < 0. 05). Conclusion� Auto logous BM SC transplanted surg ically can surv ive, pro liferate, and differentia te in the damage reg ion of bra in to promote secretion of neurotroph ic factors, reduce apoptosis, improve an� g iogenesis in rats. � � Keywords! � Bonem arrow m esenchym a l stem ce l;l � Auto transplantation; T raum atic bra in injury � � 脑创伤即创伤性脑损伤,是由外伤引起的脑组 织损害。脑创伤后多出现偏瘫、失语等功能障碍,甚 至持续性植物状态,传统的救治效果不理想,现代干 细胞移植治疗方法越来越受到人们的关注。骨髓间 充质干细胞 ( bone m arrow mesenchym al stem ce l,l BM SC)作为最主要的内源性干细胞, 有其他干细胞 不可比拟的优越性 [ 1]。目前, 脑创伤的移植治疗研 究多为异体 BMSC[ 2�3] , 临床上自体 BMSC移植治疗 的前景应更为广阔和实用。为此, 本研究采用大鼠 脑创伤模型,对其进行自体 BMSC移植治疗, 观察大 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J T ransp lan t ( E lectron ic Ed it ion) , November 2009, Vo l3, No. 4 � 307�� � 鼠神经功能、脑组织形态学、抗原表达、细胞凋亡的 变化, 探讨自体 BMSC移植疗效和机制。 1� 材料与方法 1. 1� 材 � 料 选用由华中科技大学同济医学院实验动物中心 提供的体质量为 250~ 300 g的无特定病原体级成年 雄性 Sprague�Daw ley大鼠。 5�溴脱氧尿嘧啶核苷 ( bromodeoxyuridine, B rdU )、鼠抗 BrdU单克隆抗体 ( S igma公司 );淋巴细胞分离液 ( Sigma公司 ) ; ∀因子 抗体、羊抗鼠胶质纤维酸性蛋白 ( g lial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体、二抗异硫氰酸荧光素 ( fluorescein iso th iocyanate, FITC) 标记羊抗兔 IgG、兔源性巢蛋白 ( nestin)抗体及大鼠脑源性神经营养因子 ( brain derived neurotrophic facto r, BDNF)试剂盒 (北京中杉 金桥生物技术公司 ) ; TUNEL试剂盒 ( Roche公司 )。 1. 2� 方 � 法 1. 2. 1� 动物模型建立和分组 采用改良的 Feeney等 [ 4]方法, 以 600 g� cm功 力冲击大鼠脑皮层,建立大鼠脑创伤模型,将建立模 型 24 h后神经功能缺损评分 ( neurolog ical severity scores, NSS)为 13~ 17的大鼠 100只纳入实验,去除 建模失败的或死亡的大鼠。 100只成功建立模型的 大鼠单纯随机分为自体 BMSC移植治疗组 ( 50只 ) 和生理盐水对照组 ( 50只 )。 1. 2. 2� 自体 BMSC制备和移植 大鼠脑创伤模型建立前 7 d开始腹腔注射B rdU 50mg� kg- 1� d- 1;脑创伤模型建立 24 h后, 麻醉下 沿胫骨嵴切开,暴露胫骨内侧面近心端 1 /4处骨面, 用 2mL注射器浸润肝素后进针, 分别向近心端和远 心端穿刺并抽取骨髓, 双侧可得到 0. 4mL骨髓。参 照文献 [ 1]方法, 将取得的骨髓洗涤 2次 (加入 PBS 液 5mL吹打 2次成单细胞悬液, 1500 r/m in, 离心半 径 3 cm, 离心 5m in,弃上清液 ),取沉于底部的细胞, 用D�H anker�s液等倍稀释,吹成单细胞悬液 1mL。另 取加入 2mL淋巴细胞分离液,将上述单细胞悬液用 毛细吸管轻轻沿管壁加在淋巴细胞分离液面上 (注意 保持液面清楚 ), 2000 r/m in,离心半径 3 cm,离心 20 m in,用毛细吸管吸取界面处包色云雾层,收集中间层 单个核细胞悬液。用 0. 2%锥虫蓝计数确定含有 1 ∃ 10 6单个核细胞悬液 0. 1 mL。治疗组于脑皮质受损 中央区注射 0. 1mL 1 ∃ 106单个核细胞,对照组注射 等体积的生理盐水。两组分别在模型建立后 24 h、1 周、2周、3周、4周作神经功能检测、组织形态学观察 以及抗原表达和细胞凋亡检测。 1. 2. 3� 神经功能检测 按照 NSS对每只大鼠进行神经功能评分 [ 5] , 每 天 1次。运用 Y型电迷宫对大鼠认知功能、反应能 力进行测试 [ 6] , 以大鼠受电击后 10 s内从起步区直 接逃到安全区为正确反应, 否则为错误反应。记录 大鼠错误反应次数并以此为评定标准, 每天 1次。 两组在模型建立后 24 h和 1、2、3、4周 5个时间点 各取 10只大鼠 NSS评分值和 Y型电迷宫错误反应 次数值进行数据统计。 1. 2. 4� 组织形态学观察 两组在模型建立后 24 h和 1、2、3、4周 5个时间 点采用单纯随机法各处死 10只大鼠, 将大鼠以 10% 水合氯醛 ( 300mg /kg) 腹腔注射麻醉,采用生理盐水 心脏灌注冲洗脑组织, 4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包 埋、切片,行常规 HE染色组织病理学检查。 1. 2. 5� 抗原表达检测 采用免疫荧光方法检测 B rdU /GFAP荧光双标 细胞,采用免疫组织化学 SP法检测 BDNF、nestin和 ∀因子表达。 1. 2. 6� 细胞凋亡检测 采用 TUNEL分析法检测细胞凋亡,操作均参照 试剂盒说明书进行。结果判定参照文献 [ 7]方法, 分别在荧光显微镜和普通光学显微镜下观察计数。 1. 2. 7� 统计学方法 所得数据均以均数 %标准差表示, 应用 SPSS 12. 0统计软件包进行数据处理, 采用 t检验。以 P < 0. 05为差异有统计学意义。 2� 结 � 果 2. 1� 两组神经功能比较 2. 1. 1� NSS评分 模型建立后 1、2周时治疗组与对照组 NSS评 分差异无统计学意义 (均 P> 0. 05), 3、4周时治疗 组 NSS评分显著低于对照组 (均 P < 0. 01), 见表 1。 2. 1. 2� Y型电迷宫测试 模型建立后 1周时 Y型电迷宫测试结果显示 治疗组与对照组错误反应次数差异无统计学意义 (P > 0. 05) ; 2、3、4周时治疗组错误反应次数少于 对照组 (均 P < 0. 01) ,见表 2。 2. 2� 两组脑组织形态学变化比较 两组模型建立后 24 h,脑组织均可见脑损伤区 � 308�� � 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J Transplan t ( E lectron ic Ed ition) , November 2009, Vol 3, No. 4 表 1� 两组脑创伤模型建立后各时间点 NSS评分比较 ( x % s ) � 组别 例数 24 h 1周 2周 3周 4周 对照组 10 13. 80 % 0. 84 7. 80 % 1. 30 5. 80 % 1. 84 4. 20 % 0. 84 2. 20 % 0. 45 治疗组 10 13. 60 % 1. 14 7. 20 % 1. 15 4. 30 % 1. 35 1. 80 % 0. 45 0. 80 % 0. 84 t值 0. 45 1. 09 2. 08 8. 00 4. 67 P值 0. 661 0. 229 0. 052 0. 000 0. 000 表 2� 两组脑创伤模型建立后各时间点 Y型电迷宫测试 结果比较 ( x % s ) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 20. 60 % 2. 01 18. 40 % 2. 60 14. 80 % 2. 18 9. 80 % 1. 20 治疗组 10 18. 60 % 3. 72 12. 60 % 2. 46 8. 00 % 1. 21 4. 20 % 0. 89 t值 1. 50 5. 12 8. 62 11. 85 P值 0. 152 0. 000 0. 000 0. 000 有出血、脑皮质分层消失、血管充血扩张、神经细胞 缺血水肿,治疗组与对照组差别不明显; 1周时, 创 伤脑组织液化、表面有铁锈色斑,治疗组脑组织水肿 和坏死面积均小于对照组; 脑创伤后 4周,两组均有 瘢痕形成,治疗组瘢痕形成少于对照组,见图 1。 A1、B1:模型建立后 24 h, 脑组织损伤区有出血、脑皮质分层消失、 血管充血扩张、神经细胞缺血水肿、炎症细胞浸润,治疗组与对照组 差别不明显; A2、B 2:模型建立后 1周,创伤脑组织液化、表面有铁 锈色斑,治疗组脑组织水肿和坏死面积均小于对照组; A3、B3:模型 建立后 4周治疗组瘢痕少于对照组 (如箭头所示 ) 图 1� 两组脑创伤模型建立后各时间点脑组织形态学变化 2. 3� 两组脑组织抗原表达变化比较 2. 3. 1� B rdU和 GFAP表达 模型建立后 1、2、3、4周两组脑组织均有 B rdU 和 GFAP阳性表达 (见图 2) ,治疗组 B rdU和 GFAP 阳性细胞数均多于对照组,见表 3。 B rdU标志细胞核,荧光下显示绿色; GFAP标志细胞质荧光下显示 绿色。A1、A2:对照组模型建立后 1周、4周少见有双标阳性细胞; B1、B2:治疗组模型建立后 1周、4周可见有双标阳性细胞表达 (如 箭头所示 ) 图 2� 两组模型建立后脑组织 B rdU和 GFAP表达变化 表 3� 两组脑创伤模型建立后各时间点 B rdU和 GFAP 荧光双标阳性细胞数比较 ( x % s) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 1. 40 % 0. 76 0. 70 % 0. 48 0. 40 % 0. 18 0. 60 % 0. 86 治疗组 10 6. 20 % 2. 72 6. 00 % 2. 86 5. 20 % 1. 46 3. 80 % 1. 95 t值 5. 38 5. 78 10. 32 4. 75 P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 2. 3. 2� BDNF表达 模型建立后 1、2、3、4周, 两组脑组织均可见 BDNF表达 (见图 3) ,治疗组 BDNF表达阳性细胞数 均多于对照组,见表 4。 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J T ransp lan t ( E lectron ic Ed it ion) , November 2009, Vo l3, No. 4 � 309�� � 治疗组模型建立后 1周时可见大量 BDNF表达于胞浆,呈褐色 (如箭头所示 ) 图 3� 两组模型建立后 1周时脑组织 BDNF表达 表 4� 两组脑创伤模型建立后各时间点 BDNF表达 细胞数比较 ( x % s) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 14. 40 % 3. 76 12. 80 % 2. 98 13. 40 % 4. 78 9. 60 % 5. 86 治疗组 10 48. 60 % 6. 28 39. 40 % 5. 84 32. 80 % 2. 86 26. 40 % 3. 17 t值 14. 78 12. 83 11. 02 8. 00 P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 2. 3. 3� nest in表达 模型建立后 1、2、3、4周, 两组大鼠脑组织均有 nestin阳性细胞表达 (见图 4), 治疗组 nest in表达阳 性细胞数均高于对照组,见表 5。 模型建立后 2周时治疗组 nestin阳性 (呈褐色,箭头所示 )细胞多于 对照组 图 4� 两组脑创伤模型建立后 2周时脑组织 n est in表达 表 5� 两组脑创伤模型建立后各时间点 nestin阳性表达 细胞数比较 ( x % s) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 4. 40 % 1. 76 4. 80 % 0. 98 3. 40 % 0. 78 3. 60 % 1. 86 治疗组 10 18. 60 % 2. 28 19. 40 % 2. 84 22. 80 % 2. 56 16. 40 % 2. 17 t值 14. 79 15. 27 22. 93 14. 67 P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 2. 3. 4� ∀因子抗原表达 (微血管计数 ) 模型建立后 1、2、3、4周, 两组脑组织均有 ∀因 子抗原表达 (见图 5) ,治疗组微血管数多于对照组, 见表 6。 治疗组∀因子抗原阳性 (呈褐色,箭头所示 )多于对照组 图 5� 两组模型建立后 1周时脑组织∀因子抗原表达 表 6� 两组大鼠脑创伤模型建立后各时间点∀因子抗原表达 微血管数比较 ( x % s ) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 17. 40 % 5. 73 21. 80 % 4. 98 20. 40 % 7. 78 28. 60 % 7. 06 治疗组 10 31. 60 % 9. 70 37. 00 % 6. 86 40. 60 % 4. 80 45. 80 % 7. 05 t值 3. 99 5. 67 6. 99 5. 45 P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 2. 4� 两组细胞凋亡数比较 模型建立后 1、2、3、4周,两组脑组织均有细胞 凋亡 (见图 6), 且治疗组细胞凋亡数均少于对照组, 见表 7。 对照组凋亡小体 (呈褐色,箭头所示 )表达多于治疗组 图 6� 两组模型建立后 4周时脑组织细胞凋亡情况 表 7� 两组脑创伤模型建立后各时间点 TUNEL阳性细胞 计数比较 ( x % s ) 组别 例数 1周 2周 3周 4周 对照组 10 54. 60 % 9. 76 46. 80 % 2. 98 43. 40 % 8. 18 39. 60 % 8. 26 治疗组 10 12. 60 % 6. 28 9. 80 % 5. 84 10. 20 % 3. 86 11. 40 % 3. 47 t值 11. 44 17. 85 11. 61 9. 95 P值 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 3� 讨 � 论 至今颅脑损伤尚无明确有效的治疗方法。有研 究表明 BMSC移植对脑创伤治疗有效且作用持久 [ 8 ], 特别是自体 BMSC移植具有更广阔临床应用前景 [ 1 ]。 � 310�� � 中华移植杂志 (电子版 ) 2009年 11月第 3卷第 4期 � Ch in J Transplan t ( E lectron ic Ed ition) , November 2009, Vol 3, No. 4 由于 BMSC移植在颅脑损伤中的显著有效性,其在颅 脑损伤中的应用已经领先于其他临床方法。与以往 异种或异体 BMSC移植研究不同,本研究采用来源于 脑创伤大鼠自体的 BMSC移植,避免了异体移植所带 来的排斥反应,又避免了异体细胞采集需要一定的时 间有可能错过治疗脑缺血的时间窗问题。 本研究中 NSS评分及 Y型电迷宫测试结果均显 示治疗组大鼠神经功能改善程度显著好于对照组,表 明自体 BMSC脑内移植可以有效改善脑创伤大鼠神 经功能,对脑创伤有明确的治疗效果。本文脑组 织形态学检查证实,自体 BMSC脑内移植可减轻脑创 伤组织水肿、坏死、瘢痕形成等病理损害,为受损组织 功能恢复创造了有利的局部环境。通过示踪剂 B rdU 观察到脑创伤 4周后治疗组 BrdU阳性细胞、BrdU + GFAP双标阳性细胞仍然在脑创伤区存在,表明移植 的自体 BMSC可在脑创伤区存活、聚集,并分化为星 形胶质细胞从而参与脑创伤的修复;治疗组 nestin阳 性细胞较对照组明显增多,提示移植的自体 BMSC部 分可在脑创伤区分化为神经样细胞。研究中观察到 对照组大鼠脑创伤区亦可检测到有少量 GFAP、nestin 阳性细胞,推测脑创伤后机体自身存在的神经干细胞 通过 &归巢∋作用向损伤区聚集, 并可诱导分化为星 形胶质细胞和神经元进行自我修复,但因其量极少作 用甚微 [ 9] ,本实验通过设置对照组来消除这种影响因 素。有报道提示, BM SC可在脑创伤区聚集并向神经 细胞分化,修复或替代损伤的神经组织 [ 10] ,这也与本 研究的结果相符。 本研究采用自体 BMSC移植治疗大鼠脑创伤的 结果显示,自体 BMSC脑内移植治疗组各时间点脑 组织细胞凋亡数均明显少于对照组, 表明自体 BMSC 脑内移植后可通过抑制细胞凋亡而发挥改善脑创伤 大鼠神经功能的作用,早期治疗效果更明显。对照 组脑创伤大鼠脑组织中可见 BDNF表达, 提示 BDNF 表达水平升高是神经细胞自我修复的一种机制,治 疗组 BDNF表达水平显著高于对照组, 提示移植的 自体 BMSC可通过增加 BDNF的合成及分泌,从而 促进脑创伤组织的修复。自体 BMSC脑内移植治疗 组脑创伤大鼠各时间点脑组织微血管数均明显多于 对照组, 表明移植的自体 BMSC参与了大鼠脑创伤 区新生血管的生成, 在脑创伤大鼠脑组织的修复及 神经功能恢复中发挥重要作用。国内外有关 BMSC 移植治疗缺血性脑损伤的研究证实, BM SC具有抗 损伤区细胞凋亡作用 [ 5 ] ,可通过促进神经营养因子 释放促进受体脑内细胞增生 [ 1, 11] , 并可分化为血管 内皮细胞等,参与脑损伤区的新生血管生成 [ 5, 12] , 与 本研究结果一致,支持上述自体 BMSC脑移植治疗 脑创伤的观点。 综上所述, 本研究结果表明, 注射移植的自体 BMSC可在脑损伤区存活、增殖、分化, 促进神经营 养因子分泌,减少细胞凋亡, 参与损伤区新生血管生 成和组织修复,促进神经功能恢复。 参考文献 1� 张峰, 步星耀, 张圣旭, 等. 自体骨髓间质干细胞移植治疗缺血 性脑损伤的实验研究 [ J] . 中华实用诊断与治疗杂志, 2009, 23: 240�243. 2� H essDC, Abe T, H illWD, et a.l H em atopoiet ic orig in ofm icroglial and perivascular cells in b rain[ J] . 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