干细胞移植治疗脑梗死的研究进展

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(收稿日期: 2007�07�05 ) ) (本文编辑: 张学锋 ) � � 作者单位: 063000河北医科大学唐山临床医学院神经内科 干细胞移植治疗脑梗死的研究进展 马洪颖 � 李永秋 中图分类号: � R743. 3� � � � 文献标识码: � A � � 脑血管疾病是目前导致人类死亡和致残的主要原因。 尽管临床上使用的溶栓治疗可明显改善患者的临床症状, 但 因治疗 �时间窗 等许多因素的制约, 实际只有极少部分患者 得益于此治疗。因此, 脑缺血患者受损神经功能的修复已成 为当今研究的重点。干细胞是一类具有自我更新和多向分 化潜能的细胞。在特定微环境下,干细胞可以分化成构建机 体的多种细胞。因此, 干细胞移植治疗卒中成为当前研究的 方向和热点。 1� 目前用于卒中治疗研究的干细胞 胚胎干细胞 ( embryon ic stem cel,l ESC )和成体干细胞 ( adult stem cel,l ASC )正在用于治疗卒中的研究。ESC属于 全能型干细胞, 通过各种诱导分化因素, 可成功地诱导出 3 个胚层的各型细胞。但由于 ESC的 �非定向性 分化, 同时 因 ESC来源于胚胎, 受到伦理学的影响,因此其研究和应用 都受到了极大的限制。ASC具有类似 ESC的多向分化潜能, 同时具有可由自身获得、来源丰富等优点, 使其可以作为临 床治疗和人工组织构建的种子细胞。目前, 用于卒中治疗研 究的 ASC主要有 : ! 神经干细胞 ( neura l stem cel,l NSC ): NSC 广泛存在于胚胎脑组织内以及成年的哺乳动物的生发区。 NSC终生具有增殖分化能力, 在损伤或局部环境信号变化的 刺激下, 可以通过不对称分裂 ,生成一个祖细胞和一个干细 胞。∀ 骨髓基质干细胞 ( bone m arrow m esenchym al stem ce l,l BMSC) :是骨髓细胞中除造血干细胞之外的、一类能够分化 为多种骨髓间质成分的干细胞。 Borlongan等 [ 1]研究发现, 将 BMSC移植入大脑中动脉闭塞 ( m idd le cerebra l artery occ lu� sion, MCAO)大鼠的脑内, 显示出移植 BM SC可以分化为神 经细胞和星形胶质细胞。# 造血干细胞 ( hem atopo ietic stem ce l,l H SC):近年来的研究表明, HSC并非只向多系造血干细 胞定向分化, 还可以横向分化为成骨细胞、神经细胞、血管内 皮细胞等。其主要从骨髓、脐带血及动员的外周血获得。研 究表明, 将带有 Brdu标记的外周 HSC移植入大鼠脑梗死模 型尾状核区, 移植后通过双染免疫组化发现: H SC可以分化 为星型胶质细胞、神经细胞、血管内皮细胞, 增加梗死半球血 流量, 进而促进神经功能的恢复 [ 2]。∃脂肪干细胞 ( adipose tissue�der ived stem cel,l ADSC): 2001年 Zuk等 [3]在 PA细胞 及抽取的脂肪组织中发现 ADSC, 并发现其能分化为神经细 胞、胶质细胞。 Kang等 [ 4]将 ADSC以 lacZ病毒标记注射进 大鼠脑室治疗大鼠脑缺血模型, 显示 ADSC可迁移到脑的不 同部位, 注射后 14 d发现这些细胞部分在坏死部位共同表达 微管相关蛋白 2和胶原纤维酸性蛋白,表明 ADSC可以在体 内向神经细胞分化。 2� 移植方式 2. 1� 内源性干细胞移植 脑缺血后内源性干细胞参与自我修复过程。正常情况 下存在的内源性干细胞稀少,不能满足修复的需要。如能提 高卒中患者内源性干细胞水平,既符合机体自身损伤的反应 性修复机制, 又可以避免异基因移植引起的免疫排斥反应。 因此, 学者们开始探讨应用外源性细胞因子增强内源性干细 胞的活性。 Shyu等 [5]的研究表明, 粒细胞集落刺激因子能 动员骨髓干细胞入血, 并向脑内迁移, 分化为神经细胞, 促进 微血管再生, 减少梗死体积, 改善脑缺血大鼠的远期预后。 脑缺血后神经干细胞的增殖与多种因素有关 [ 6�7], 进行外源 性全脑刺激, 如成纤维细胞生长因子 2、血管内皮生长因子、 脑源性神经营养因子、促红细胞生成素等, 均能调节成年神 经干细胞的内源性增殖, 进而调控脑缺血后的神经发生。 2. 2� 单纯外源性干细胞移植 从胚胎或成年体内分离出干细胞,或经定向诱导分化形 成 NSC或神经细胞,将这些细胞移植入脑梗死区的周围, 利 用干细胞的特性来修复脑神经功能缺损。M im ura等 [ 8]将 BMSC经体外诱导分化为神经细胞后, 移植入脑梗死模型大 鼠脑内, 神经功能可获得明显改善。 %45%中国脑血管病杂志 2008年 1月 18日第 5卷第 1期 � Ch in JC erebrovasc D is, Jan�18, 2008, Vol�5, No�1 2. 3� 干细胞与细胞因子的联合移植 干细胞是神经系统疾病的理想移植细胞, 但移植的早 期很难对局部病理生理过程产生积极的影响。细胞因子可 调控神经细胞再生所需的微环境 , 调节干细胞的生长、增 殖、分化 ,加强神经发生、突触形成、神经传递及促进神经递 质的释放。如成纤维细胞生长因子 ( fibroblast grow th facto r, FGF)对中枢神经系统是一种有丝分裂原, 能增加增殖细胞 的数量和运动功能的恢复 [ 9]。如 NSC与脑源性生长因子 联合移植, 对胆碱能神经细胞起到填充和保护作用, 并能明 显促进干细胞存活和再生, 从而使神经细胞的代谢功能 增强 [ 10]。 2. 4� 两种干细胞或神经组织的联合移植 近年来的研究发现, ! BM CS不仅能分化为神经细胞, 而且能促进和增强脑组织本身内在因子分泌能力和受体的 表达能力, 对干细胞具有支持、调控作用, 进而促进其增殖、 分化 [ 11�12]。M orizane等 [ 13]发现, NSC接种于骨髓培养皿中, NSC可以被大量诱导分化为神经细胞。∀ 中枢神经系统损 伤后, 尤其是大面积损伤后常留下一个空洞。空洞内没有血 流和支持性基质, 即使再大量的干细胞移植也很难使功能恢 复。而 Schw ann细胞和嗅鞘细胞可以作用于细胞桥架引导 轴突生长, 到达相应的靶组织 ,进一步改善损伤的中枢神经 系统的再生环境。同时 Schw ann细胞分泌多种神经营养因 子、细胞外基质及细胞黏附因子。 Jeong等 [ 14]研究发现, 大 鼠的 NSC与 Schw ann细胞共培养,可以显著促进神经干细胞 分化为神经细胞样细胞, 同时神经细胞突起增长并且有序排 列形成突起样结构。 # 血管生成与神经生长是协调调控和 相互联系的信号系统。有研究表明,神经发生和血管发生通 过 SDF�1 /Ang�1的血管产物相联系 [ 15], 因此, NSC与血管内 皮祖细胞共同移植治疗脑缺血性卒中具有良好的前景, 但目 前有关研究尚较少。 2. 5� 基因修饰的干细胞移植 细胞因子对干细胞的增殖、分化有着重要的作用, 但其 半衰期短, 扩散性能差。所以单纯的细胞因子或干细胞与细 胞因子联合移植可能对于微环境的调整,尤其是对干细胞的 长期作用可能很小。干细胞能够转染和表达外源性基因, 更 新率低, 能长期存活, 并能通过血�脑屏障, 同时具有分化为 神经细胞和星形胶质细胞的潜能,是理想的治疗脑缺血的载 体细胞。最有前景的方法是通过转基因技术将基因治疗、细 胞治疗和细胞因子三者结合起来治疗卒中。利用干细胞良 好的组织相容性和向病灶迁徙的能力,改变或调控受损神经 细胞的基因表达, 既发挥干细胞的替代、修复作用,又发挥细 胞因子的保护、促进作用。 Zhu等 [ 16]将转染血管内皮生长因 子基因的 NSC移植到大鼠缺血的纹状体半暗带, 通过神经功 能评分和观察移植后 1和 12周转基因 NSC在脑内迁移、表 达、分化情况。结果发现, 转基因 NSC及其分化的子代细胞 在缺血早期表达基因产物, 并能重建宿主局部神经环路及微 循环, 缩小梗死体积。 3� 干细胞移植治疗脑缺血的可能机制 3� 1� 直接替代作用 人体内不同的细胞, 具有相同的遗传基础, 细胞分化是 部分基因选择性的被激活或差异性表达的结果。脑梗死后 体内微环境的改变, 使干细胞基因编码的顺序发生改变, 改 变细胞既定的分化模式, 向病变所缺失的细胞方向分化, 分 化为神经细胞, 修复神经组织结构, 参与神经环路的形成。 干细胞分化为神经细胞的模式可能为: ! 去分化: 干细胞可 能首先去分化产生一种更原始的细胞,然后经过新的途径再 分化为其他细胞。研究发现, 脑缺血损伤可能刺激脑内成熟 的间质细胞或星型胶质细胞分化为 NSC, 然后再分化成受损 最严重的细胞类型, 发挥重塑神经细胞网络的作用 [ 17]。∀ 转决定: 组织干细胞水平上的一种分化, 干细胞转化为 NSC 再分化为神经细胞。Shyu等 [ 2]的研究发现 ,移植的 HSC可 以分化为神经干细胞。 3. 2� 促进轴突的再生和髓鞘的形成 大量的研究表明, 移植的 H SC促进多肽类、干细胞因 子、神经营养因子等细胞因子的产生。神经营养因子可以使 cAM P水平增高。胞内 cAMP的提高, 可激活蛋白激酶 K ( protein k inases K, PKA )。 cAM P对 PKA的激活又可引起精 氨酸酶 I的转录, 其可催化聚胺产物的形成, 而聚胺产物可 促进细胞骨架形成而使轴突延伸。损伤后的神经组织中加 入脑源性神经营养因子 ( brain�der ived neuro trophic factor, BDNF )引起生长相关蛋白和 Tal- a-微管蛋白的上调, 使中 枢神经系统损伤后轴突再生。 3. 3� 细胞连接作用 移植的干细胞与再生轴突形成缝隙连接和紧密连接, 直 接与其进行信息传递和物质交换,进而促进中枢神经系统损 伤后神经传导速度和功能恢复。同时通过细胞与细胞的接 触作用, 诱导邻近的残存轴突和损伤近端轴突出芽与靶神经 细胞形成新的突触。 3. 4� 减少瘢痕 中枢神经系统损伤后,活化的星形胶质细胞与小胶质细 胞、炎性细胞和髓磷脂之间相互作用形成胶质瘢痕, 瘢痕中 的一些细胞组织还分泌一些抑制因子。移植的干细胞可降 低卒中病灶胶质瘢痕壁的厚度, 从而减少轴突再生时的屏 障, 而且可以降低瘢痕壁的小胶质细胞和巨噬细胞的数量, 有利于减少吞噬缺血周围区损伤较轻微的细胞 [ 18]。 3. 5� 基因调控作用 干细胞移植使内源性 NSC的 cAMP反应元件结合蛋白 激活, 将信号传入细胞核, 上调某些转录因子、mRNA和相应 蛋白的表达, 激活静止状态的 NSC [19]。 BMSC能够表达多种 生长因子, 其中成骨蛋白 ( bone m orphogen�etic prote in, BMP )包括 BM P2和 BMP4对星形细胞的分化具有重要意义。 星形细胞在体外缺氧条件下, 内源性 BMP2 /4表达下调。 BMSC共培养能明显上调缺氧条件下星形细胞的 BM P2 /4 mRNA的表达,会明显增加体外脑室室管膜下区神经前体细 %46% 中国脑血管病杂志 2008年 1月 18日第 5卷第 1期 � C h in J Cereb rovasc D is, Jan�18, 2008, Vol�5, N o�1 胞培养中胶质纤维酸性蛋白和 Tuj1阳性细胞的比例 [ 20�21]。 3. 6� 神经通路的建立 干细胞移植有可能分泌一些能上调内源恢复机制的蛋 白, 如胶原蛋白 I、纤维酶等, 促进未梗死的宿主细胞建立新 的神经电位通路, 保持或弥补损伤侧丧失的某些功能。 3. 7� 促进血管再生 血管生成与干细胞微环境关系密切。新生血管的形成 和血液循环的重建, 有助于脑缺血半暗带区受损而未死亡神 经细胞的修复, 为植入的组织与细胞的成活和分化提供必要 的微环境。血管再生机制可能有: ! 干细胞具有多重分化活 性: 移植的干细胞诱导分化为内皮细胞, 具有成血管活性, 促 进缺血组织血管新生。H ess等 [ 22]将绿色荧光蛋白标记的雄 性小鼠骨髓移植给同系用线栓法制作大脑中动脉阻塞 ( m iddile cerebra l arte ry acclusion, MCAO)模型的雌性小鼠,跟 踪绿色荧光和 Y染色体探针, 发现标记的骨髓细胞被整合到 缺血部位, 并且呈现内皮细胞表型。∀ 神经营养因子或细胞 因子的作用: H SC能够以旁分泌或自分泌形式分泌血管紧张 素& ( Ang & ), 并以剂量依赖方式促进内皮细胞迁移, 诱导 内皮细胞向着产生 Ang & 的方向移动, 而有助于血管内皮 组 /干细胞植入组织中, 启动和促进血管新生。# 基因水平 的调控作用: 研究表明, BM SC可通过上调内源性血管上皮 生长因子 mRNA的表达作用,诱导血管生成。 3. 8� 抑制细胞凋亡 移植的干细胞可能通过转录因子上游元件调节神经细 胞内基因的表达, 如 c�fos mRNA表达下调, 从而阻断第二信 使兴奋性氨基酸、调节炎性介质、抑制 Ca2+的内流, 抑制神 经细胞凋亡的发生。同时干细胞移植后分泌的神经生长因 子可通过跨胞质膜上的 T rk受体和 P75糖蛋白启动一系列 反应, 激活 Ra f�MAPK�ERK通路, 使酪氨酸残基磷酸化, 产生 信号传递, 提高自由基清除活性, 稳定细胞内 Na+ /K +浓度, 诱导钙结合蛋白, 阻断细胞凋亡。大鼠短暂性 M CAO 后 14 d, 对照组梗死灶周围仍有较多的 TUNEL阳性凋亡细胞, 而接受骨髓干细胞移植组,凋亡细胞数量则明显减少 [ 23]。 4� 展望 干细胞增值、分化机制是一个复杂的网络, 它与体内各 种因子的分泌和相互作用、各种因子与不同受体的结合、周 围环境与细胞间的相互作用、细胞与细胞间相互作用有密切 关系。干细胞移植治疗脑缺血是一种新的治疗方法, 有可能 成为形态、结构与功能的修复和替代的康复治疗。这将极大 地造福于广大卒中患者。但是 ,目前移植治疗仍处于实验研 究阶段, 仍有许多问题需要解决。例如, 哪种类型的细胞更 适合移植、移植细胞的长期存活、轴突的生长和正确突触的 形成、细胞移植的最佳治疗时间窗、移植途径、干细胞移植最 佳移植细胞数量、移植的干细胞在脑内分化的机制和特性、 哪些因素将会对移植有利或不利、如何克服不同移植物尤其 是多能干细胞的肿瘤形成特性、移植细胞的免疫排斥反应等 问题。这些均需要我们在今后的工作中进一步研究、解决。 参考文献 [ 1 ] Bo rlongan CV, L ind JG, D ilon�Carter O, et a.l Bone m arrow g rafts resto re cerebra l b lood flow and blood brain barrier in stroke rats [ J ]. 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