骨髓基质干细胞不同移植途径对脑缺血治疗的影响

第 31卷第 3期 2009年 6月 � � 大 连 医 科 大 学 学 报 Journal ofDalianM edical University � Vo .l 31 No. 3 June 2009 骨髓基质干细胞不同移植途径对脑缺血治疗的影响* 雷 � 阳,牟文松,雄 � 鹰,廉 � 英 (大连医科大学附属第一医院 神经内科,辽宁 大连 116011 ) 摘要: [目的 ]探讨骨髓基质干细胞 ( bonem arrow strom al ce lls, MSCs)不同途径移植后在急性局灶性脑缺血疾病治疗 中的作用及其机制。 [方法 ] 利用线拴法制作 SD大鼠大脑中动脉缺血模型 (MCAO) ( n = 80), 随机均分为: 缺血 自然恢复组 ( A组 ), 缺血 +磷酸盐缓冲液 ( PBS)对照组 ( B组 ), 缺血 + 颈内动脉 M SCs组 ( C组 )和缺血 +尾静脉 M SCs组 ( D组 ) ,分别通过颈内动脉、尾静脉移植相同数量 M SCs。再灌注 24 h后, 分别观察神经行为学评分, 脑梗 死体积, 尼氏小体平均灰度, 凋亡相关基因 Bc l- 2, Bax及血管内皮生长因子 ( vascu la r endothelia l g row th factor, VEGF)的表达。 [结果 ]通过对神经行为学评分,脑梗死体积和病理形态学 (尼氏小体、Bcl- 2、Bax免疫组化以及 VEGF的表达 ), C组最终的各种指标分析比较均要优于其他 3组, 之间的差异有显著性意义 (P < 0. 05 )。 [结 论 ] 颈内动脉移植 M SCs治疗缺血性脑损伤的疗效明显优于尾静脉移植相同数量的 M SCs。 关键词: 干细胞移植;脑缺血; B cl- 2; Bax;血管内皮生长因子 中图分类号: R- 332� � � 文献标志码: A� � � 文章编号: 1671- 7295( 2009) 03- 0253- 05 Therapeutic effect of d ifferent adm inistration channe l of bone marrow stromal ce lls for treating transient focal cerebral ischem ia in rats LE IYang, MUW en- song, X IONG Y ing, LIAN Y ing (D epartm ent of N eurology, the F irst Aff iliated H o sp ital of DalianM ed ical University, Dalian 116011, China ) Abstrac t: [ Ob jective] To investigate the effect and m echan ism o f bone m arrow strom a l cells ( MSC s) transplan tation fo r treating cerebral ischem ia in ra ts. [ M ethods] Rat m idd le cerebra l a rtery occ lusion (MCAO) mode lw as estab lished. A to� tal o f 80 SD rats w ere div ided into four group, MSC s ( 2 � 106 ) labe led was transferred into every g roup, through ex terna l ca rotid artery 24 h after stroke. Behav iora l tests w ere perform ed be fo re and a fterMCAO. Immunohistochem istry was used to identifyMSC s and expression of neuro trophic factors. [ Results] The transfe rred M SCs surv ived, m igrated and produc ing neurotroph ic factors, such as VEGF a fter the transplanta tion. Com pared w ith othe r three groups, the function o f nervous system was sign ificantly im proved(P < 0. 05). And, the the rapeutic effect o f the d ifferen t adm in istration channe,l C group w as better than theD group. [ Conclusions] The the rapy o fM SCs transferring into rat bra in a fter cerebral ischem ia is effec� tive. The neuro trophic facto rs produced byM SCs m ay exp lain the pro tective m echan ism. K ey words: stem ce lls transp lantation; cerebral ischem ia; Bcl- 2; Bax; VEGF � � 脑血管意外的发病率、致残率和死亡率在国内、 外均名列前茅, 而脑梗死占了其中的 85%。因此, 对于缺血性脑损伤的研究具有重要的现实意义。普 通的药物及溶栓治疗等虽然显示一定的效果, 但对 * 收稿日期: 2009- 03- 11;修回日期: 2009- 04- 13 � 作者简介: 雷 � 阳 ( 1970- ), 男,辽宁沈阳人, 主治医师,硕士。 � 通信作者: 牟文松,硕士。E- m ai:l song6912@ 163. com 254�� 大 连 医 科 大 学 学 报 第 31卷 于已坏死区域却作用甚微, 而干细胞移植是目前有 可能实现对缺血坏死区结构与功能重建的方法之 一 [ 1]。探讨干细胞治疗脑缺血的研究已经成为热 点 [ 2]。骨髓干细胞作为一种多潜能干细胞, 已证实 在中枢神经系统变性、缺血和损伤性疾病中发挥着 神经保护和神经修复的作用, 具有广阔的应用前 景 [ 3]。 本实验对以往的线栓法制作大鼠大脑中动脉局 灶性脑缺血模型略加改良。通过对神经行为学、梗 死体积、细胞形态学及病理免疫组化指标的观察,来 验证和探讨骨髓基质干细胞通过不同途径移植在急 性局灶性脑缺血疾病治疗中的作用及其机制。 1� 材料和方法 1. 1� 实验动物及分组 清洁级健康雄性 SD大鼠 (体重 200~ 250 g ) 80 只,月龄 2~ 3个月, (由大连医科大学实验动物中 心提供 )。随机分为 4组, 每组 20只。分别为 A 组:缺血自然恢复组; B组: 缺血 + 磷酸盐缓冲液 ( PBS)对照组; C组: 脑缺血 +颈内动脉 MSCs组; D 组:脑缺血 +尾静脉 MSCs组。 1. 2� 实验方法 1. 2. 1� 大脑中动脉局灶性脑缺血模型的制备: 采用 线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血 (MCAO )模型,缺 血 2 h后拔出栓线即形成再灌注。栓线插入深度约 为 8~ 10 mm。 1. 2. 2� MSCs的提取和 MSC s悬浊液的制备: 健康 成年 SD大鼠,在无菌条件下分离双侧胫骨和股骨, 用 DMEM培养液冲洗髓腔, 搜集混匀, 叠加于淋巴 细胞分离液上层, DMEM洗涤, 于细胞沉淀中加入 DMEM培养基 (含体积分数为 10% FCS) , 接种于 T275培养瓶中,置于 37 、体积分数为 5% CO2饱 和湿度的孵箱培养, 5 d后更换培养液, 弃去未贴壁 细胞, 以后每 3 d换液 1次, 待贴壁细胞完全融合 后, 2. 5 g /L胰酶消化传代, 每 3 d全量换液 1次。 移植时,制成单细胞悬液, 移植细胞数约为 2 � 106。 1. 2. 3� MSC s移植:阻断大脑中动脉 2 h后,将尼龙 线拔至颈外动脉残端,剪断尼龙线,并按分组分别将 等体积的 MSCs悬液和磷酸盐缓冲液 ( PBS )沿颈总 动脉切口处向远端缓慢注射,然后彻底结扎颈内动 脉,缝合皮肤切口。同样的方法做好缺血模型,缺血 2 h后从大鼠尾静脉缓慢注射已经准备好的同体积 的 MSC s,然后处理好注射伤口。 1. 2. 4� 神经行为学评估: 神经行为学评估采用 Be� derson6级 5分评分标准进行。 Bederson评分标准: 5级 0分:正常 (无功能障碍 ) ; 4级 1分:对侧上肢不能完全伸展; 3级 2分:向对侧推时抵抗力下降; 2级 3分:提尾时向对侧转圈; 1级 4分:自动转圈; 0级 5分:无自发性活动伴意识障碍。 脑缺血各组于再灌注 24 h后进行神经行为学 观察、评分,采用双盲法评估, 由一不了解实验分组 情况的观察者进行评估, 并真实各组神经行为 学评分。 1. 2. 5� 制备病理标本:大鼠麻醉后,开胸暴露心脏, 左心室穿刺并经升主动脉用 100 mL冰生理盐水快 速灌注后,再以 4%多聚甲醛 400 mL灌注固定, 先 快后慢, 时间约 1 h, 取脑, 浸泡于 10%多聚甲醛固 定液中 4 固定 24 h。 1. 2. 6� TTC标本的制备:将已经剥离好的大脑冷冻 5m in,然后弃去小脑和延髓, 将脑从额极向后连续 冠状切面,每 2 mm 1片, 共 5~ 6片。将脑片置于 2%氯化三苯基四氮唑 ( TTC )溶液中, 于 37 孵育 20~ 30m in,然后置于 10%多聚甲醛溶液中, 4 固 定。正常脑组织为鲜红色, 梗死脑组织为白色。将 固定的脑片按切片顺序排列, 拍照后扫描输入计算 机。用图像处理软件计算每一脑片白色区域的面积 及红色区域的面积,乘以厚度 ( 2 mm )并将所得数值 相加得相应的体积。 1. 2. 7� 制作病理切片: 取出浸泡于 10%多聚甲醛 固定液中的鼠脑, 冰冻切片, 48 h后取出制作病理 切片,并采用甲苯胺蓝染色法,进行尼氏小体染色。 每张切片在缺血区大脑皮层各随机采集 10个 高倍视野。输入医学图像分析系统 ( Im age- Pro p lus Ana lysis so ftw are )进行图像处理, 检测 bcl- 2、 bax及 VEGF蛋白阳性的平均灰度值。 1. 3� 图像分析 每张尼氏染色切片采集 10个高倍视野, 输入图 像分析系统,进行平均灰度分析。每张免疫组化切片 在染色阳性区域随机采集 10个高倍视野。在光学显 微镜下计阳性细胞率,所得数据进行统计学处理。 1. 4� 统计学方法 实验结果应用 SPASS 11. 5软件进行分析。各组 神经行为学评分、脑梗死体积、尼氏体平均灰度、免疫 第 3期 雷 � 阳, 等:骨髓基质干细胞不同移植途径对脑缺血治疗的影响 255�� 组化数据采用 ANOVA方差分析,数据采用均数 !标 准差表示,以 P < 0. 05为差异有显著性意义。 2� 结 � 果 2. 1� 神经行为学评估 再灌注 24 h后神经功能评分, 正常大鼠应为 0 分, A组与 B组明显高于 C组和 D组, 之间差异有 显著性意义 (P < 0. 01)。各组间相比, C组又优于 D组, 差异有显著性意义 (P < 0. 01)。A组与 B组 之间的差异无显著性意义。 2. 2� TTC染色测量脑梗死体积的比较 TTC染色测量脑梗死体积, C组的梗死体积明 显小于 A组、B组及 D组 (P < 0. 05) ,之间差异有显 著性意义 (表 1)。 2. 3� 病理形态学实验结果 2. 3. 1� HE染色: 正常大鼠神经元椎体细胞呈多角 形或三角形,突起明显。神经胶质细胞核大而圆,核 仁清晰,胞质着色浅淡。神经胶质细胞多位于椎体 细胞周围,排列整齐, 体积大小较均匀一致。缺血自 然恢复组可见大片坏死灶,镜下结构彻底消失,纤维 组织崩解,边缘为残留组织,二者之间有过度。组织 结构不完整,胶质纤维及神经细胞崩解,椎体细胞皱 缩,可见核固缩 (图 1、2)。 C组细胞受损较缺血自 然恢复组明显减轻。镜下可见散在的小软化灶,其 余组织结构相对较好,椎体细胞轻度水肿,结构尚好 (图 3)。尾静脉移植后的病理切片组织结构较差 (图 4)。 2. 3. 2� 尼氏染色结果: 正常大鼠神经细胞形态完 好,细胞饱满, 胞浆内尼氏体含量丰富, 分布均匀。 A组、B组与另外两组都形成鲜明对比,神经细胞内 的尼氏体呈弥漫性消失, 仅在个别细胞内可见尼氏 体残留,且残留的尼氏体的分布不均 (图 5、6)。颈 内动脉给予 MSCs治疗后较其他 3组有了明显改 观,细胞内尼氏体的数量和分布均匀程度都有明显 改善 (图 7)。而尾静脉注入 MSCs治疗后的尼氏染 色效果虽然差于 C组, 尼氏体数量较少, 但优于 A 组和 B组 (图 8)。 尼氏体数量的多少在图像分析中用平均灰度来 表示。尼氏染色的数据处理需借助于图像处理技 术。平均灰度在图像分析中表示图像的透光率, 分 为 256级, 最暗为 0级,最亮为 256级。尼氏体平均 灰度值越低,说明其染色越深,即细胞内尼氏体含量 越高。A组尼氏体的平均灰度值最低, 尼氏体的含 量最高, B组仅次于 A组。C与 A组和 B组相比, 尼氏体含量有了明显提高, 差异有显著性意义。而 C组优于 D组, 结果之间差异有显著性意义 (表 1)。 表 1� 各组大鼠神经行为学评估、脑梗死体积以及尼氏体数 量的比较 组别 神经行为学评估分值 梗死体积 ( mm 3 ) 尼氏体数量 A 3. 7 ! 0. 5 208 ! 26 178. 18 ! 21. 66 B 3. 6 ! 0. 6 210 ! 18 163. 64 ! 20. 29 C 2. 0 ! 0. 61) 2) 130 ! 171) 2) 124. 36 ! 14. 851) 2) D 3. 0 ! 0. 4 174 ! 20 149. 73 ! 10. 96 � � 1 )P < 0. 05 vs groupA; 2 )P < 0. 05 vs group B 2. 3. 3� Bc l- 2免疫组化染色结果: B cl- 2染色阳 性的部位主要在细胞胞浆,呈棕黄色或棕褐色,但部 分胞核亦可阳性, 呈棕黄色或棕褐色。实验各组的 细胞胞浆均可见染色阳性反应, 部分细胞核染色阳 性, 以神经胶质细胞多见。C组的胞浆染色的阳性 程度最强,与 A组、B组和 D组相比有明显改善 (P < 0. 05,表 2)。 2. 3. 4� Bax免疫组化染色结果: Bax染色阳性的细 胞胞浆呈棕褐色, 部分细胞核亦可呈现棕褐色。正 常时细胞中的 Bax仅有少量表达, 当细胞受到损伤 时 Bax表达明显增强, 缺血自然恢复组以及 PBS组 细胞胞浆呈弥漫性中等强度阳性,呈网状,多数细胞 核亦呈中等强度阳性。给予 MSCs移植后, Bax的表 达明显减弱。C组可见胞浆部分弱阳性, 呈点线状, 仅有少数胞核呈弱阳性 (P < 0. 05,表 2)。 2. 3. 5� 血管内皮生长因子 ( VEGF )染色: 正常 VEGF染色阳性的细胞胞浆着色为棕褐色或棕黄 色, 胞核亦可呈现阳性反应。MCAO再灌注后 C组 的梗死灶侧 VEGF阳性细胞数比 B组、A组和 D组 明显增多, D组较 B组及 A组也有增多表现, B组及 A组仅有极少量 VEGF阳性细胞 (P < 0. 05, 表 2)。 256�� 大 连 医 科 大 学 学 报 第 31卷 第 3期 雷 � 阳, 等:骨髓基质干细胞不同移植途径对脑缺血治疗的影响 257�� 表 2� M SCs对大鼠 Bcl- 2、Bax、VEGF表达的影响 group Bc l- 2 Bax VEGF A 0. 39 ! 0. 04 0. 54 ! 0. 05 3. 345 ! 1. 400 B 0. 41 ! 0. 03 0. 45 ! 0. 03 3. 940 ! 0. 945 C 0. 68 ! 0. 111) 2) 0. 27 ! 0. 031)2) 7. 207 ! 2. 2451) 2) D 0. 55 ! 0. 02 0. 34 ! 0. 04 5. 856 ! 1. 920 � � 1)P < 0. 05 vs group A; 2)P < 0. 05 vs group D � � 实验数据表明, 缺血性脑损伤移植 MSC s治疗 后,明显改善神经功能缺损, 缩小梗死体积, 减轻神 经细胞水肿,改善神经细胞代谢。免疫组化分析可 见,移植 MSCs后 Bcl- 2 /Bax的比值明显增加, VEGF的表达也有明显的增强。 3 � 讨 � 论 研究证实, 缺血性脑损伤时的细胞死亡不仅存 在坏死,而且会有大量细胞凋亡。细胞凋亡从缺血 中心区向梗死灶周边的缺血半暗带发展, 说明较温 和的缺血损伤以诱导细胞凋亡为主 [ 4] , 严重脑缺血 则以细胞坏死为主。而移植骨髓基质干细胞能显著 减少缺血半影区凋亡细胞的数量, 这也提示骨髓基 质干细胞移植治疗对脑缺血有一定的功能保护作 用。本实验中也证实了这一点,颈内动脉移植骨髓 基质干细胞后梗死体积明显少于其他几组。而脑缺 血后神经再生、神经功能的恢复与缺血部位新血管 的形成、重塑密切相关。 2003年, Chen等 [ 5]报告, 静脉移植人 MSC s可促进中风大鼠缺血区域内血管 内皮生长因子 ( VEGF) 的分泌和 VEGF受体的表 达,从而促进新生血管生成, 提示 MSCs可以通过促 进新生血管生成改善神经功能。本实验中, 各组免 疫组化分析可见移植 MSCs后 Bcl- 2 /B ax的比值明 显增加, VEGF的表达也有明显的增强,促进新生血 管形成,使缺血边缘区的血流改善,从而影响神经功 能的恢复。L i等 [ 6 ]将 BrdU标记的骨髓基质干细胞 植入大脑中动脉梗塞小鼠模型纹状体, 发现小鼠缺 失的躯体感觉及运动功能明显改善。 而对于移植的途径, 目前多选用经血管内注射 移植骨髓基质干细胞 [ 7] , 在对鼠的实验研究中多将 骨髓基质干细胞注入鼠尾静脉。这种方法的优点 是:有广泛分布的潜能,具有传送大量细胞的能力, 对神经组织的干扰比较小,并有重复应用的可行性。 但也存在不利因素, 如需要通过血脑屏障, 存在栓 塞并发症的可能。经尾静脉移植时, 还存在肝脏的 首过代谢,有毒害肝脏的潜在危险。同时尾静脉移 植时,干细胞要 ∀长途跋涉#,并要经过其他的组织 器官,其中包括肝脏等, 这样可能对干细胞造成了一 定数量的破坏和局部分化, 使得到达缺血脑组织的 干细胞数量少于颈内动脉移植。 随着组织细胞工程学和基因工程的发展, 骨髓 基质干细胞在组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面 的应用已成为研究的热点。而真正促进卒中和外伤 的恢复, 仍在进一步的研究中。 参考文献: [ 1] Z iv in, Justin A. 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