中药指纹图谱

nullnull中 药 指 纹 图 谱 null 第一章 中药指纹图谱技术与中药质量控制 1.1 指纹图谱的起源与发展 现代指纹鉴定始于19世纪末20世纪初的范罪学和法医学。每个人的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以据以鉴别每个人的特征。 指纹图谱技术应用于植物药质量控制，是从20世纪70年代，色谱技术的发展，人们大量采用薄层色谱（TLC）方法，将植物中化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上的斑点的位置、斑点大小、斑点颜色、斑点数目的多少进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。 20世纪70年代及80年代，出现薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。 20世纪80年代及90年代，高效液相技术得到发展，同时植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的不断阐明，高效液相广泛应用于定性、定量分析。 西方普遍采用高效液相色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。目前高效液相色谱法已成为当前研究指纹图谱的主要手段。 null 1.2 中药指纹图谱的定义 中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念。 定义：运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述。 由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不仅具备个体的绝对的惟一性，更强调的是物种特征的惟一性与同种植物中的相似性。 现代分析技术：包括光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用。 中药化学信息：植物药（包括来源于植物的中药材）的提取物（包括中药的汤药）与化学合成药最根本的区别是，它（即使是单味药材）是多种化学成分的混合体。这种多种化学成分的综合体构成了“中药化学信息”。由于中药的疗效由多种成分协同作用或“相克作用”，中药中的化学信息有一定的模糊性。只有部分化学信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分）可表征于指纹图谱中。null 表征和描述：“表征”是将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；“描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。 中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校验等过程 。 分析色谱指纹图谱要求“准确的辨认”，不是“精密的测量”； 比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求“相似”，而不是“相同”； 评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图貌”，而不是求索细枝末节。 分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。 null 1.3 中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定和可控的关系 药物研究的主要内容包括药物安全性、有效性、稳定性和可控性，四者缺一不可。 已生产并临床使用的注射剂等中成药，由于经过了药效学测试、临床评价，安全性与有效性没有，但是，现有的质量控制方法的不全面性及生产过程中的不稳定性导致各批次产品之间质量出现差异，在临床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。 null 指纹图谱研究的直接目的有两个方面： （1） 对中药质量控制的补充和提高。 现有《中国药典》质量控制方法及新药申报7，往往以1个或个以上成分为控制指标，在一定程度上反映了原药材、中间体及成品的质量，但任何单一的成分都难以准确、全面地评价中药质量，不仅不能进行真伪鉴别和优劣判别，在很多情况下，所检测的指标成分（活性成分）还不具有“惟一性”，使用器材比较简单，操作比较粗糙，有时重现性差。 《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》要求将指纹图谱检测指标及持续术要求作为质量单列项目，是对现行中药质量控制标准的有益补充。 一个理想的指纹图谱不仅能达到定性鉴别的目的，色谱图中大部分药谱理应达到基线分离，对大部分成分应可进行定量分析。在没有对照品的情况下，也可以已知标准品针对其他未知或无标准品的色谱峰进行定量。因此，中药指纹图谱是对现行中药质量标准近控制方法的提高。null （2） 控制中间体、成品的一致性，减少批间差异 中药生产的原材料，因土壤、气候等环境因素及采收加工的不同，实际使用时不能保证药材质量的稳定，经加工提取得到的中间体，每个批次在成分含量、成分组成及各成分比例方面都不能保持一致。 通过指纹图谱研究，可以掌握每一个批次的原药材、中间体中成分变化，进行有指导的合理“勾兑“，保证成品在成分含量、组成比例上一致，减少批间差异。 无论是原药材、中间体还是成品，因组方已固定、生产工艺相对恒定，药品的安全性不可能直接通过指纹图谱来保障，但中药指纹图谱可直接解决中间体、成品的批间一致性及稳定性问题，从而可以间接并最终保障成品的安全性和有效性。 nullnull 1.4 中药指纹图谱建立的意义与原则 中药指纹图谱建立的是全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。 中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分和药理学研究为依托，应体现系统性、特征性、重现性三个基本原则。 null系统性： “系统性“是指指纹图谱所反映的化学成分应包括中药有效部位所含大部分成妥的种类，或指标成分的全部。 如：中药人参中所含的有效成分多为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能多地反映其中的皂苷成分；银杏叶中的有效成分是黄酮和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法针对这两类成分，分别分析，以达到系统、全面的目的。 null特征性： “特征性“是指指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的”化学条码“。 如：北五味妇的高效液相色谱和薄层色谱指纹图谱，不仅包括多种已知的五味子木脂素成分，而且还有很多未知成分，这些成分之间的顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种的不同而不同。通过这些整体信息，可以很好地区分北五味子与南五味子以及其它来源的五味子药材，辨别药材的真伪与优劣。null重现性： “重现性“是指所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范例内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。 实现指纹图谱的重现性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理待环节规范操作外，还应建立相应的评价机制，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹图谱。 实现中药指纹图谱的三原则，保证其标准化，做到统一规范，这样才可以使中药指纹图谱得以推广应用。 null 1.5 国外植物药指纹图谱的应用 美国FDA：允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图； WHO：1996年草药评价指导原则中规定，如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。 欧共体：在草药质量指南中称，单靠测定某有效成分考察质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。在欧共体药品注册中植物药制品的“药物专家报告“要求通过已知的具有治疗作用的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。null第二章 中药指纹图谱研究方法学 2.1 常用指纹图谱研究的方法与技术 研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展。 中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法、光谱法及其它。 色谱法包括：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（CE）； 光谱法包括：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、近红外光谱法（NIR）； X射线衍射法、核磁共振法（NMR）等。 null （1） X射线衍射法及核磁共振法 这两种方法能给出药效物质基础的结构信息，部分信息也可能与特定化学成分直接关联。但该两种方法所使用的仪器在国内尚未普及，不适应该方法的应用与推广。在中药指纹图谱研究过程中不建议采用X射线衍射法及核磁共振法。 （2） 紫外可见分光光度法和红外光谱法 这两种方法能够给出药效物质基础的结构信息，但所给出的信息是所有化学物质结构结构信息的加和，不具备指纹特征，但可作为中药指纹图谱研究的辅助方法。null （3） 近红外光谱法 此方法与红外光谱法原理相同，但检测时采用近红外波长，所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和，通过一系列样本的检测（必须预先知道样品中相关成分的含量或样本的定性归属），运用化学计量学手段，建立了样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可对未知样本（如：新近购进的原药材或新生产的成品等）进行辨别分析（给出结果：合格与否、含量多少等）。 优点：检测速度快（通常为1 min）、操作简单、适宜过程控制等。 数据处理需掌握一定的化学计量学知识。 近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，方法的成熟度较高，在中药质量控制方面有较好的应用前景，可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。 null （4） 薄层色谱法 薄层色谱法为传统的定性、定量分析方法，广泛应用于道地药材的定性鉴定。 2000版《中国药典》，采用薄层色谱法进行定性鉴别，列于【鉴别】项下；采用薄层扫描法进行含量测定，列于【含量测定】项下。 优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。 缺点：重现性、精密度差。 可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。 （5） 液相色谱法 最常用的指纹图谱研究方法，其中高效液相色谱法（HPLC）具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点。 中药样品中含有的成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，方法成熟，中药指纹图谱研究应优先考虑高效液相色谱法。null （6） 气相色谱法 气相色谱法主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压的固体，或者沸点在500℃以下，相对分子质量400以下的物质。 在中药质量控制中主要用于挥发油、极性较小的成分或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。 特点：灵敏度高、分离度好、分析速度快，定量分析的精密度优于1%，但分析范围只局限于低沸点成分是其主要不足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。 null （7） 高效毛细管电泳法 高效毛细管电泳法是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型分离分析技术。适用于中药中带电荷的化合物（蛋白质、氨基酸、黄酮、生物碱）、有机酸、单糖及一些中性分子的分离分析，可作为中药指纹图谱研究的补充。 （8） 其它 高效液相色谱与质谱联用（HPLC-MS）、气相色谱与质谱联用（GC-MS）、毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）等。 这些方法可在指纹图谱中的部分色谱峰在无标准物质验证的情况下，起到定性鉴别的作用。 最常用的为：TLC、HPLC、GC。 null 2.2 指纹图谱研究常用的仪器与设备 2.2.1 薄层扫描仪 （1） 薄层扫描流程 （2） 薄层扫描仪主要部件 典型的薄层扫描仪主要由机械扫描装置和数据处理两部分组成，新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。 （3） 主要厂家及仪器型号 日本岛津CS系列；美国Schoeffel SD3000等。 2.2.2 高效液相色谱仪 2 2.2.3 气相色谱仪 null 2.3 指纹图谱研究对高效液相色谱仪的要求 2.3.1 柱外效应 应特别注意“柱外效应”对分析结果的影响。 由于样品分子在液体流动相的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1~2个数量级，因此，样品注入色谱柱后，在柱子以外任何死空间（如进样器、柱接连接管和检测器）中，样品分子的扩散和滞留都会显著引起色谱峰的扩散，而使柱效降低，所以柱外死体积的影响量不能忽略。 在制造和使用高效液相色谱仪时，应使柱外效应减至最小,以获得理想的分析结果。 建议：色谱柱及检测器前死体积应最小。 null2.3.2 流动相的脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），防止在洗脱过程中，因压力降低而产生气泡。若在低死体积检测池中存在气泡，会增加基线噪声，严重时会造成分析灵敏度下降而无法进行分析。 溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测；可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 常用的脱气方法有离线式脱气和在线式脱气。 离线式脱气：吹氦脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声波脱气法等。离线式脱气会因流动相存放时间的延长以致有空气重新溶解在流动相中； 在线式脱气技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱气法的脱气效果明显优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂体系。 建议：选择在线脱气。null2.3.3 梯度洗脱 梯度洗脱是流动相中含有两种或两种以上的不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分获得最理想的分离效果，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。 由于高压梯度装置中，每种溶剂是分别由泵输送的，进入混合器后，溶剂的可压缩性和溶剂混合时的热力学体积的变化，可能影响输入到色谱柱的流动相的组成，因此高压梯度洗脱过程中为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。 低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。 优点是：①仅需要使用一个高压输液泵；②减小了溶剂可压缩性的影响，并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化带来的误差。 建议：选择低压梯度。 null 2.3.4 样品进样 进样器有以下几种： （1） 停流进样装置 为防止在带压操作下引起流动相泄露，此装置要求进样前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。 （2） 六通阀进样装置 该方法重现性较好，较常用。 （3） 自动进样器 自动进样器由计算机自动控制定量阀，按预先编制的注射样品操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按预定程序自动进行，一次可进行几十个或上百个样品的分析。 自动进样的样品量可连续调节，适合大量样品分析，节省人力。 （4） 建议：中药指纹图谱研究过程中，由于对样品的进样量精确度要求不高，因此对进样器的选择可结合研究者的实际情况，建议选择六通阀手动进样装置。null2.3.5 色谱柱 2.3.6 柱温 不同柱温下同一成分在的保留时间往往发生迁移，有时还影响成分之间的分离效果。 由于中药样品成分的复杂性，尤其是中药指纹图谱技术要求色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的相对恒定，对柱温的要求应严格控制，以保证分析方法的重现性。 建议：选择柱温箱。 null 2.3.7 检测器 （1） 紫外线检测器 应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。 特点：灵敏度高、线性范围宽，可做成很小池体积的流通，对流动相的流速和温度变化不太敏感，易操作，不破坏样品，波长可以选择及可用于梯度洗脱。 （2） 示差折光检测器 示差折光检测器是通用型检测器，对在可见光或紫外线区无吸收的样品一般选用。不破坏样品，缺点是对温度变化敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。 （3） 荧光检测器 （4） 电化学检测器 null （5） 二极管阵列检测器 光束通过流通池、分光系统后，使所有波长在二级管阵列检测器同时检测器，可得三维的时间-色谱信号-吸收光谱图。 特点：可进行全波长检测，一次进样可以检测到样品中不同波长下的所有组分；光谱分辨率高，可以检测色谱峰的纯度；灵敏度高，线性范围宽，基线噪声小。 可得到所有组分的全波长扫描图，可用于定性分析，通过对三维色谱图的分析，可以优化检测波长。 （6） 蒸发激光光散射检测器 通用性检测器。可以检测挥发性低于流动相的任何样品，可作于无生色团物质的检测，如碳水化合物（多糖）、类脂类（磷脂）、皂苷、不进行衍生化的脂肪酸和氨基酸，以及结构不明又无标准样品的未知物。 根据具体情况，进行选择。据统计，95%的中药组分在可见光或紫外线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（VWD）。 建议：在指纹图谱研究过程中，由于并不完全了解样品中所含组分的化学结构，尤其是复方制剂所含组分结构类型不一，最大吸收波长各不相同，很难一次成功地选择好检测波长。因此最好选用二极管阵列检测器。 null第三章 中药色谱指纹图谱研究过程中的关键问题 指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研究方法与研究思路相对成熟，已形成共识，普遍采用HPLC、TLC、GC或NIR（近红外技术），对植物药有效组分进行全成分质量控制，即指纹图谱技术。 null3.1 设计与思路 3.1.1 研究对象的确定 植物药或中药的成分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。 当研究某个注射剂品种的指纹图谱时，首先必须调研相关的文献、新药申报资料（质量部分和工艺部分）及其它研究结果， 尽可能详尽地了解药材、中间体及成品中所含水量成分的种类及其理化性质，经综合分析后找出成品中的药效成妥或有效成分，作为成品或中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。 如：黄芪含黄酮、皂苷及多糖；黄芪多糖注射液是以黄芪中的多糖为原料，因此对黄芪多糖注射液进行指纹图谱研究时应以多糖作为研究对象；研究其中间体时也应以多糖为研究对象；研究原药材的指纹图谱时应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。 复方应以君药、臣药中有效成分作为主要研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。null3.1.2 研究方法的选择 主要采用色谱法。各种色谱法是互补的，应根据研究对象的实际需要和可能以及按照不同色谱技术的特点和优势而定，目的是保证方法的重现性和确能反映产品质量的主要化学成分。 一个中药制剂指纹图谱应可以同时采用两种或更多种方法进行研究。 指纹图谱研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择，大多数方法可采用HPLC法。通常挥发油类采用GC。一些难以检测或采用上述方法得不到较理想的分离效果时，可采用TLC或CE。 null3.1.3 研究内容 根据国家药品监督管理局下发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。 null3.2 原药材、中间体及注射剂样品选择与收集 中药是天然产物，中药的活性成分都是次生的代谢产物，本身有它内在的不稳定性。我国药材品种多、产地广、分散度大，造成了中药材基源复杂，形成许多同名异物的品种，这些品种在传统中医临床中并未加以细分，其中多数已收入《中华人民共和国药典》。对于《中国药典》收载的品种，从中医的角度均可入药，这种多基源药材增加了色谱指纹图谱研究的难度。 近年由于药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人为因素造成了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱的研究与应用。 我国药材GAP工程已起步，将有利于中药注射剂及其它制剂的质量控制。 null 已生产的注射剂，因生产中药材来源基本确定，在补充其指纹图谱时，原药材样品的收集应遵循以下原则： ①药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法； ②对已往生产使用过的药材应结合临床使用情况选择收集样品，对工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少出现异常医疗事故的药材批次应重点选择； ③另外还应收集不同产地、不同采收期的药材，这些药材虽然含量高低不同，组成比例各异，但当正常使用的药材一旦出现偏差时，可通过这些批次的药材实行合理“勾兑”。通过对指纹图谱的研究，可以对“勾兑”过程进行指导。 中间体、注射剂因其生产工艺已经恒定，样品的收集原则也应重点选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少出现医疗事故的批次。 根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）之规定，原药材、中间体及注射剂样品至少应收集10批次。不可以同一批次的样品分散成数个批次，充当样品。null3．3 原药材、中间体及注射剂的预处理 在指纹图谱研究过程中，供试品（原药材、中间体及注射剂）溶液的制备过程不是关键性的技术问题，但操作烦琐。 原药材的供试品制备最为复杂。原药材所含的多种组分混杂在一起，样品制备时，应根据所含成分和物理化学性质，通过萃取、沉淀、吸附或通过化学反应，分离富集样品。 如：黄芪药材中的黄酮类成分通过碱水萃取，皂苷类成分通过大孔树脂吸附；苦参中的总生物碱通过阳离子树脂吸附与解吸附。 中间体是原药材经过了多步处理而得，已经滤过了大部分成分，只保留一小 部分有效组分，样品制备时，可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。 样品富集后，尚需过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，以除去色素等杂质，避免干扰或对色谱柱的损耗。 注射液中除少数品种添加助溶剂外，所含化学成分均具有较好的水溶解性能，面且研究生产工艺时考虑到色素、生物大分子等因素，生产过程中已通过微孔滤膜、脱色等操作，因此，样品无需特殊处理，可直接分析检测。null3.4 色谱条件选择 指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。 我们以HPLC法为例，阐述各影响因素及解决途径。 3.4.1 流动相 可用作流动相的溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、正已烷等。反相高效液相，以乙腈-水系统比较适合梯度洗脱。醇-水系统由于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基线漂移。 在流动相中可加入磷酸、乙酸、三乙胺、二乙胺、正丁基溴化胺、十二烷基磺酸钠等各种改性剂，或采用磷酸-磷酸氢二钠/磷酸二氢钠、乙酸-乙酸钠缓冲溶液，以达到改善色谱峰分离程度及改善峰形的目的。 样品中如有部分成分的极性较小，在流动相中可加入少量异丙醇、四氢呋喃、氯仿、环糊精等，增加流动相对样品的溶解性，一方面改善峰形，另一方面可快速洗脱。 对黄酮类、酚酸类成分可参考选择乙膊-水-酸系统的流动相；对皂苷类成分可参考选择乙腈-水系统的流动相，生物碱类成分可参考选择乙腈-水-三乙胺等系统的流动相。null3.4.2 检测波长 选择有以下方法： ①参照样品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值； ②参照对照品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值； ③根据君、臣、佐、使的组方理论，在尽可能兼顾佐使药的同时，主要选择君、臣药中有效成妥的及收峰值。 一个检测波长下的色谱图如不能达到控制质量的目的，可建立多个检测波长下的指纹图谱。 null3.4.3 柱温 柱温的选择与恒定是影响指纹图谱技术稳定的主要因素之一。适宜的柱温不仅影响色谱峰的分离效果，而且柱温发生变化将导致色谱峰保留时间的迁移，技术参数的设置就失去了意义，因此，柱温必须限定。 当色谱图某个色谱峰因溶解度差而峰形较“钝”时，可适当提高柱温（30~50℃）；如样品中组分在常温或高温下不稳定，易发生水解、分解等变化时，可降低柱温。 null3.4.4 色谱柱 不同厂家的色谱柱由于采用的填料不同，柱效相差较大。即使流动相条件一致，用不同填料的色谱柱重复测试时，不仅分离效果大不相同，而且保留时间的迁移程度也比较明显。 可供选择的色谱柱填料型号：Zorbax、Polaris、Kromasil、MataSil、Nucleosil。 由于中药样品的复杂性，一方面所含成分极性高低不等，另一方面部分成分结构相似，极性相差不大，分离比较困难，因此选择色谱柱时应以主要成分得到分离为目的，柱效不易过高。 同时要考虑填料的稳定性和载样量。指纹图谱一般选用5~10μmC18填料柱，以4.6mm×250mm较适宜，其它特殊的色谱柱，如氨基柱、腈基柱、酸性柱、碱性柱等，可视研究对象的不同而采用。null3.4.5 进样量 进样量对指纹图谱的结果影响不大，但加大进样量，可以减弱梯度洗脱时基线漂移的程度；然而色谱柱的载样量有一定的限度，进样量过大，色谱柱超载，导致色谱峰峰宽增加或色谱峰尖钝化，并影响柱的寿命。研究发现，进样量应控制最高色谱峰的吸收值在1000mAU以下适合。当等度洗脱时，基线平稳，进样量较平稳，进样量应尽量减少，一般控制最高色谱峰的吸收值在100mAU左右，不宜超过500mAU。null3.4.6 色谱条件的优化 当一个指纹图谱初步建立后，尚需进一步优化。首先应选择不同操作者、不同型号的仪器进行测试；其次应在其它实验室、研究单位进行测试。 国外一个成熟的指纹图谱在形成法规之前，选择世界各地有名的检测机构（分布于公司、医院、大学等的独立分析检测室）进行复核，以保证所建立的指纹图谱技术稳定、可靠。 null3.5 指纹特征选择 指纹图谱一量建立，按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）规定，除提供指纹图谱外，还应说明相应的技术参数。但大量的相对保留时间、共有峰峰面积比值等技术参数，不能直观地用来鉴定、判别。 通过大样本的指纹图谱的挖掘，找出隐藏其中的指纹特征，是指纹图谱研究的直接目的。 如：欧美植物药领域普遍采用以人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的峰面积作为鉴别中国人参、朝鲜人参、越南人参、西洋参及三七参的特征参数；淫羊藿中的“五指峰”是《中国药典》收载品种Epimedium breuvicornum Maxim。的典型特征，根据“五指峰”特征区色谱峰的组成及相互间峰面积的比值，可定性鉴别、定量分析不同产地、不同提取工艺及不同品种的淫羊藿。 指纹图谱研究的建立、分析、比较、评价和校验应逐渐形成规范并取得共识。指纹图谱的研究应结合当前的实际情况，同时结合生产工艺的筛选及药效和临床观察，当前阶段宜简不宜繁、宜易不宜难，基本保证产品质量的基本稳定和一致.null第四章 中药色谱指纹图谱的建立与评价 按技术要求分析/抽检成品，并与对照色谱指纹图谱及技术参数比较，判别检测产品是否合格，是实施中药指纹图谱的最终目的。 实现中药指纹国库券谱技术革新，除了研究中药色谱指纹图谱，还包括对照指纹图谱及其技术参数的建立与指纹图谱评价等过程。 4. 1 对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价 目前对中药材、中间体及成品（主要为注射剂）的指纹图谱研究大多采用图谱法，经分析检测得到了大量的色谱数据。按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行），需对以上色谱数据进行处理，才能得到指纹图谱技术参数。 如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。 目前多采用人工手动计算的方法或借助于Microsoft Excell等应用软件计算这些参数，繁琐，易出差错，计算操作的过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。 nullnullnull4.1.2 中药色谱对照指纹图谱的建立与中药色谱指纹图谱评价的原则 中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就可以作为“标准”或“对照”/“参照”，所起作用如同对照药材，样品的色谱图谱可与对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药指纹图谱评价过程中须综合考虑以下原则。null4.1.2.1 整体性 对照指纹图谱的建与评价应注意指纹特征的整体性。 一个品种的对照指纹图谱是由各个具有指纹意义的峰组成的完整图谱构成的，各个有指纹意义的峰（或薄层色谱的斑点）其位置（保留时间或比移值）、大小或高你（积分面积或峰高）、各峰之间相对的比例是指纹图谱的综合参数，建立和评价时从整体的角度综合考虑，注意各有指纹意义的峰相互的依存关系。 null 中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效的稳定性及用药安全性方面有相关性，因此对照指纹图谱中所有色谱峰在样品指纹图谱中均应体现且可追溯。只有在对照指纹图谱中所有色谱峰的稳定体现，才是保证产品真正稳定可控的前提。为保证色谱指纹图谱在整体上相似，在建立对照指纹图谱时： ①应尽可能包含所有具有指纹意义的特征峰，尤其是含量少面指纹意义显著的色谱峰、指纹特征区、共有特征区； ②排除溶剂峰及其他可以追溯的杂质峰，供试品的制备应与工业生产相似，并尽可能采用流动相来溶解。 通过比较指纹图谱在整体上的相似，楞以判断出样品的真实性。null4.1.2.2 模糊性 在实际过程中由于受到各种因素的影响，样品指纹图谱中有可能出现个别色谱峰的增加/减少，色谱峰图谱行为可能发生改变，如峰形、峰宽、峰高发生变化及保留时间发生偏移等，不可机械性地通过色谱图的叠加来评价反指纹色谱图和相似。 增加/减少的色谱峰对指纹图谱整体相似的贡献，不是单纯性的降低，有可能出现相互消长的现象。对于难以把握的色谱峰，建议由软件去进行判别评价，尽可能避免人为判别评价。 null4.2 对照指纹图谱的建立方法 4.2.1 典型指纹图谱的建立模式 4.2.1 .1典型指纹图谱选择法 通过一组或一系列样品的指纹图谱研究，从中选择一个具有典型意义或有代表性的指纹图谱作为对照指纹图谱。 当样品间指纹特征相近时，该方法较好。但所选择的典型指纹图谱只包含单个样品的特征，选择旱过程可能出现随意性。当样品间指纹特征差异较大时，典型指纹图谱的选择就很困难。 4.2.1.2 共有模式生成法 通过对一批色谱指纹图谱的研究，模拟出对照指纹图谱或生成对照指纹图谱数据，即共有模式生成法。 由于共有模式生成法综合了所有样品的指纹图谱信息，因此建议使用共有模式生成法。 null 4.3指纹图谱评价方法 指纹图谱相似性的评价从两个方面考虑： （1） 色谱的整体“面貌”，即有指纹意义的峰的数目、峰的位置和顺序、各峰之间的大致比例（薄层色谱还有斑点的颜色）等是否相似，以判断样品的真实性。 （2） 以样品与对照样品或“标准图谱”之间或不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较。如总积分面积相差较大（如+20%），则说明同样量的样品含有的内在物质上有明显差异，这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。 能 比较应在同一台仪器平行进行测定，评价的结果可能陈致误判或不同评价者得到不同的评价结果，建议通过计算机辅助指纹图谱相似度评价软件来进行。 null4.3.1 评价指标 采用相似度作为指纹图谱评价的指标。 4.3.1 引用变量 根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）之规定，与中药指纹图谱有关的技术参数如下：①保留时间（RT）；②峰高（height）；③峰面积（area）；④峰面积比（A%）；⑤相对保留时间（RRT）；⑥积分面积相对比值（RA）。 相对保留时间（RRT）和积分面积相对比值（RA）是中药指纹图谱的两个核心参数，可作为指纹相似度评价的重要变量。 参照国外实验室的做法，现选择积分面积相对比值（RA）作为计算指纹图谱相似度的变量。 null 4.3.3 数据获取途径 ①将中药色谱指纹图通过扫描仪等设备，即可将图形/图像转化成ASCII数据。 ②从色谱软件中均可采集到截片数据，即时间与电信号响应值。 ③从色谱软件中均可直接读取色谱数据（如保留时间、峰面积等）。 4.3.4 相似度算法 （1） 相关系数算法 （2） 夹角余弦算法。 null 重要文件： （1） 关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）的通知 （2） 《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行） （3） 《中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南》（试行）