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朊病毒的基因及其蛋白质结构生物学的研究 韩生成田 波 ( ) 中国科学院微生物学研究所 ,北京 100080 摘要 朊病毒是一种只含有蛋白质而不含有核酸的蛋白侵染颗粒 ,能造成哺乳动物的脑部病 C 变 . 它是由正常形式的蛋白错误折叠成致病蛋白而组成的. 两种结构异型的蛋白 Pr P和 Sc Pr P来源于同一基因 ,具有相同的氨基酸序列和共价修饰 ,但是在三维结构有很大的差异 .朊病毒的繁殖是通过正常形式蛋白转变为致病形式而完成的 . 朊病毒疾病的传播具有种属特 异性和病毒株系特异性的特点 ,这是由于其一级结构的差异而在三维结构上形成不同的构象 而引起的. 关键词 朊病毒 基因 蛋白质结构 构象转变 英国的疯牛病事件和美国的 Prusiner 博士因朊病毒的发现获得 1997 年诺贝尔生理和医学奖使朊病毒研究受到各方面的重视 . 朊病毒是一种新型的蛋白感染因子 ,能够引起人和动 ( ) ( ) 物的可转移性神经退化疾病 ,如人的震颤病 ,克雅氏病 CJ D,吉斯综合征 GSS和致死性家族 ( ) ( ) 失眠症 F F I以及动物的羊瘙痒病 ,牛海绵脑病 俗称疯牛病和鹿 、猫 、水貂等的海绵脑病 . 这些疾病的共同特征是使动物和人产生认知和运动功能的严重衰退直至死亡 ,其临床和病理 特征现为脑组织的海绵体化 、空泡化 、星形胶质细胞和微小胶质细胞的形成以及致病蛋白的 积累. Prusiner 等人的一系列实验证明这种疾病是由于正常细胞蛋白的错误折叠形成的致病 ( ) 蛋白 ———朊病毒 Prio n在脑中积累而引起的. 国际病毒分类和命名委员会把朊病毒 、类病毒 1 ( ) 和卫星病毒归入亚病毒 ,以示与病毒的区别. 这也是我们将 Prio n 或 Virino译为朊病毒的 原因. 1 蛋白质致病假设 朊病毒的早期认识多源于羊瘙痒病的研究 . 朊病毒疾病的传染性和滤过性特点曾被认为 是由慢病毒引起的. 但同大多数病毒不同 ,福尔马林溶液并不能完全消除其传染性. Alper 等 2 人也观察到一定剂量的 254 nm 紫外线不能使其失活 ,相反它对 237 nm 紫外线却非常敏 3 感 ,这些特征使作者认为感染因子可能是一种不含有核酸的蛋白质. 随后 Griffit h 等人提 出蛋白质致病假设 ,认为感染因子是由正常细胞蛋白经修饰后形成的 . 4 ,5 1982 年 Prusiner 和他的同事利用生化手段从感染羊瘙痒病的金黄地鼠中纯化出此类 感染因子 ,并分别经过核酸酶和蛋白酶消化 、紫外线以及其他化学试剂的处理 ,认为羊瘙痒病 ( ) 的感染因子可能是一种不含有核酸的蛋白质 ,并取名为朊病毒蛋白 Prio n Protein, 简称 Pr P. Sc( ) 致病的朊病毒蛋白 Pr P具有抗蛋白酶 K 有限水解的能力 ,它特异地出现在被感染的动 物脑组织中 ,呈淀粉样形式存在. 经有限酶解后 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其分子量为 27, ) ( 30 ku 称 Pr P, Pr P仍保留其感染活性. 基于此蛋白质的部分氨基酸序列 ,对其基因27,30 27,30 C( ) 和正常细胞蛋白 Pr P的基因进行了克隆和序列分析. 结果表明这两种蛋白基因的核苷酸序 6 C 列完全一致 ,它们来源于同一个基因. 这使得人们认识到 Pr P 具有两种形式 , 即 Pr P和 Sc C Pr P. Pr P分子量 33,35 ku ,含有 1 对二硫键和 2 个 N 型复合寡糖链 ,二硫键和糖基化的 残基都在 Pr P 的 C 端 . N 端含有由 22 个氨基酸残基组成的信号肽序列 , C 端含有由 23 个氨 7 C ( ) 基酸组成的糖基磷酸肌醇锚受体结合位点 GP I. 说明 Pr P是一种膜蛋白 ,已证明它是定 8 ScC ( ) () 位于细胞膜的穴样内陷类结构域 CL Ds. Pr P同 Pr P具有下列不同的生化特性 : 1在非 Sc 9 Sc 10 C ( ) ( ) 变性去污剂中 Pr P是 不 溶 的; 2 Pr P具 有 相 对 的 抗 蛋 白 酶 水 解 特 性; 3 Pr P和 ScC ( ) Pr P都依赖 GP I 附着在细胞膜表面 ,经磷酸肌醇磷脂酶 C P IPL C酶解后 Pr P从膜上释放出 ScC Sc 来而 Pr P不释放 ,用 Trito n X- 114 进行相分配后 , Pr P处于水相而 Pr P处于 Trito n X- 114 相 11Sc C () 中; 4特异的抗体只与 Pr P有血清反应 ,而与 Pr P无反应 ,证明两者含有不同的构象表12 . 这些实验为蛋白质致病假设提供了有力支持.位 2 朊病毒基因的结构和转录调控 朊病毒蛋白是由宿主染色体基因编码的. 人的 Pr P 基因定位于 20 号染色体的短臂上 ,鼠 的 Pr P 基因也定位于第 2 号染色体的短臂上. Pr P 基因是单拷贝的 ,这意味着 Pr P 基因在哺 13 ,14 乳动物物种分化时已经存在. 朊病毒蛋白 mRNA 并不是由一个外显子组成 ,但整个开放阅读框包含在一个单一的外显 子中 ,这消除了各种结构异型体的 Pr P 是由于 RNA 的拼接形成的. 但并不排除存在像 RNA 14 编辑及蛋白质的拼接等机理的存在. 鼠 、牛和羊的 Pr P 基因是由 3 个外显子和 2 个内含子 组成 ,而人的 Pr P 基因是由 2 个外显子和 1 个内含子组成. 以前认为地鼠 Pr P 基因是由 2 个 15 外显子组成 ,Li 等人发现在地鼠基因组中还存在 1 个新的外显子 ,它的序列同鼠的外显子 2 有 83 %同源性 ,而与牛和羊的外显子 2 具有 76 %同源性. 此外显子在调节细胞表达 Pr P 方 面起作用. 大鼠的完整 Pr P 基因为 16 kb ,其中外显子 1 , 2 , 3 分别由 19,47 ,98bp 和 2 kb 组 成 ,间隔 2 个 2 . 2 和 11 kb 的内含子. 外显子 1 和 2 是非编码区 ,而外显子 3 编码 5′非翻译区 、 16 Pr P 基因完整开放阅读框以及 3′非翻译区. 在大鼠 5′端启动子区可能含有富含 G + C 区 以及 Sp 1 , Ap- 1 和 Ap- 2 结合位点 ,但没有 TA TA bo x 位点. 这说明 Pr P 基因可能是一个持家 16 基因. 最初有人认为 Pr P 在成年动物脑组织中是组成型表达的 ,而在发育过程中可能是受调控表达. 对其 cDNA 5′端进行分析发现其 mRNA 在不同位点起始 ,No ut her n 杂交也说明鼠的不 16 同组织中 Pr P mRNA 水平各不相同 ,最高表达量在脑部和胎盘. 原位杂交实验进一步证 明 ,在鼠脑组织中 Pr P mRNA 主要存在于海马组织的锥形细胞 、丘脑和新大脑皮层的大神经 元以及蒲肯野氏细胞 ;在胎盘组织中 ,高水平 Pr P mRNA 不只定位于蜕膜细胞 ,同时也在卵黄 囊的羊膜和中胚层中表达 . 而且 Pr P mRNA 也在子宫肌层和精巢的精细管中表达 ,但在肺 、 17 脾以及肝和其他胎儿组织中没有检测到 ,这说明 Pr P 的表达是组织依赖型的. 3 朊病毒蛋白的一级结构 经克隆和序列分析 ,目前已获得了近 40 个物种的 Pr P 核苷酸序列及由此推断出的氨基酸 序列. 整个开放阅读框的氨基酸序列同源性为 70 % ,而成熟的蛋白质 Pr P序列同源性为 23,231 76 %. 在患病的人中 ,已发现在 Pr P 序列中有 12 个残基位置发生点突变而在 3 个位置发生氨基酸残基的多态性变化. 另外在 53,90 位的八肽重复区发现有 2,9 个八肽插入及 1 个八肽 () 重复的缺失突变 图 1. 这些突变都是非保守性替代 ,它们同人的散发性 、遗传性及传染性朊 病毒疾病相关 . 大多数 CJ D 和一部分 GSS 以散发形式存在. 在这些病人中 , Pr P 基因没有发生突变. 目前也不知道在人体中致病的蛋白怎样以散发形式出现 ,有人曾推测可能是由于患病的动物和 C Sc 人的水平传播 、Pr P 基因的自身突变以及 Pr P向 Pr P的自发转变造成的. 现在已经证明这 些疾病与 Pr P 序列中某些位置的氨基酸残基如 M129V ,N171 S 和 E219 K 等的多态性有关. ( ) 图 1 人的成熟朊病毒蛋白 Pr P的氨基酸序列 23- 232 序列上面的残基指此处的氨基酸发生突变 ,序列下面的残基指此处的氨基酸发生多态性变化 ,序列中划线处残基指八 肽重复区 研究者最早观察到 GSS 以常染色体遗传的方式发病 ,而后发现羊瘙痒因子侵染鼠后发病 的潜育期长短与 Pr P 基因在 108 和 187 位密码子处氨基酸之间存在遗传连锁 . 这使得他们认 为 Pr P 基因发生突变可能是造成遗传性朊病毒疾病的原因. 约 10 %CJ D 是家族性发生 ,这也 说明 CJ D 具有一定的遗传基础. 人的 Pr P 基因 102 位残基的点突变 P102L 的发生被证明同 GSS 存在遗传连锁 ,后来发现所有的 GSS 病人都含有此突变. 现已证明人类遗传性朊病毒疾 病的分子基础是 Pr P 基因的突变 . 转基因研究也证明 Pr P 基因的突变能引起神经退化性疾 病 . GSS P102L 突变基因导入鼠中 ,表达出大量突变蛋白 ,结果使 5 个株系的鼠表现出中枢神 ( ) 经系统退化性疾病. 这也说明朊病毒可由 Pr P 基因突变后从头 de novo产生. 进一步在 Pr P 基因中引入点突变 A113V ,A115V 和 A117V ,也造成病变 . 而且经脑内接种可以将此病传染 给表达地鼠 ———鼠嵌合基因的转基因鼠. 已发现在 Pr P 序列的 53,90 位密码子区插入一段 144bp 的八肽重复序列同 4 个家族的 CJ D 病人相连锁 ,而且这些家族起源于一个共同的祖先 . 有人也证明在 53 位残基处插入 2, 9 个八肽重复序列都可引发朊病毒疾病 . 4 朊病毒蛋白的三维结构ScC ScPr P与 Pr P都由同一基因编码 ,其氨基酸序列完全相同. 因此 Pr P的形成是一种转录 18 ScC 19 后修饰的过程. 通过对 Pr P与 Pr P的比较研究发现两者并无共价修饰的区别. 利用 ( ) ( ) Fo urier 转换红外光谱 F T IR和圆二色 CD对两者结构进行比较 ,发现它们在二级结构上有 C Scαββ很大区别 : Pr P含 40 %的- 螺旋 ,而含有很少或几乎不含- 折叠 ,相反 Pr P则含有 43 %的- 20 ,21 Sc C C α折叠及 30 %的- 螺旋. 采用分子模式对 Pr P与 Pr P的三维结构进行预测 ,认为 Pr PSc( ) αβ是一个含有 4 个- 螺旋 H1- H4的球形蛋白. 在 Pr P中有 2 个螺旋 H1 和 H2 形成 4 个- 折 ScC 22 () 叠链. 一个二硫键将 H3 和 H4 连接在一起 ,稳定 Pr P和 Pr P的结构 表 1. 利用 CD 对 50,89 位氨基酸残基的八肽区重复片段的研究表明八肽区采用一种无规则 23 的延伸型构象 ,此结构类似于多聚 L- 脯氨酸形成的左手螺旋结构. 通过对一段包括 90, ( ) α145 位氨基酸残基的合成肽段进行核磁共振 N M R研究 ,发现这段肽段能以- 螺旋形式存 βα在 ,但是受环境影响后可以形成分子间- 折叠结构 . 在疏水环境中检测到 H1 螺旋区有- 螺 旋存在 ,在 H2 中则只有形成螺旋的倾向性 . 在所有已知的 Pr P 氨基酸序列中 ,113- 128 位残 Sc Sc C 基是最保守的 . 有人认为这段残基是在新生 Pr P产生过程中 Pr P和 Pr P结合的中心结构 24 域. 利用多维异核 N M R 对大肠杆菌表达的地鼠朊病毒蛋白片段 Pr P和鼠的朊病毒片段90,231 C 25 ,26 ( ) Pr P进行 研 究 发 现 两 者 都 呈 现 螺 旋 形 式 的 结 构 , 类 似 于 Pr P. 地 鼠 表 1 121,231 ( ) αPr P和鼠 Pr P都含有 3 个- 螺旋 HA- HC,螺旋的残基所处的位置区别不大 ,而且 90,231121,231 C HB 与 HC 同预测的 Pr P结构中 H3 和 H4 的位置相当 . 但是在地鼠 Pr P 中参与螺旋形成的 α残基更多 ,地鼠 Pr P- 螺旋相对鼠 Pr P 更长. 鼠 Pr P中含有 2 个包括 4 残基的反平行 121,231 ββ- 折叠片层 ,而地鼠 Pr P 只发现一个类似的反平行- 折叠. 在另一位置的残基构象表现出有 β() β形成- 折叠的倾向性 ,却没有表现出标准的- 折叠构型. 在 S2 和 HB 之间环区 Loop165,171 在地鼠 Pr P 的 N M R 结构中表现出有序性 ,在鼠 Pr P 中却呈无序性 ,而此段环区据认为含有两 C 种不同的构象 ,它同 HC 一起在稳定 Pr P结构方面起着一定的作用. 同鼠 Pr P相比地 121,231 α鼠 Pr P多出 90,120 段残基. 在 N M R 谱中这段残基表现出一定的- 螺旋谱峰性质 ,同 90,231 时又表现出无规则卷曲的谱峰特征. 因此认为它可能含有瞬间结构的特征 ,能进行构象之间 的快速转变. 113,125 段疏水残基聚集区表现出能选择多种构象的特征 ,因此这段残基在 C ScPr P向 Pr P转变的构象变化中可能起关键作用 . 这与前面的合成肽段 90,145 的 N M R 谱 结果相符合. C Sc 朊病毒蛋白 Pr P和 Pr P的二级结构的比较表 1 对 大 肠 杆 菌 表 达 的 完 整 朊 病 毒 蛋 白 的 N M R 研究表明整个朊病毒三维结构 呈 很 长 α β 朊病毒蛋白- 螺旋- 折叠 H1 109,122的舒展状态 ,可以分为 2 个结构域 ,其中 N 端 H2 129,141C 推测的正常蛋白 Pr P结构 含有 23,120 位残基 ,处于舒展的无规则卷曲 H3 178,191状态 ,缺少确定的二级结构 ,具有很高的柔韧 H4 202,218性 . 而 C 端包括 121,231 位残基 ,是一个球 S1 108,113 116 ,122H3 178,191α形结构域 ,由一个二硫键相连接的 2 个- 螺旋 Sc 推测的致病蛋白 Pr P结构 H4 202,218 S2 128,135αβ组成 V 形骨架 ,另一个- 螺旋和 2 条- 折叠 138,14427 ,28 链附着在此骨架上构成. 对于致病形式 HA 144,154Sc S1 128,231的 Pr P的三维结构 ,由于其在非变性溶液中 鼠的 NMR 结构193 Pr PHB 179,121,231 ,164S2 161 HC 200,217 的不溶性 ,很难得到它在溶液中的构象. 因此 这有待于固相 N M R 技术的发展 ,或利用其他 HA 144,156地鼠 Pr P的 NMR 结构 HB 172,193 S2 161,16390,231方法来对其结构进行解析 . HC 200,227 5 朊病毒蛋白的构象转变C Sc 对 Pr P 基因的序列分析表明 Pr P和 Pr P具有相同的氨基酸序列和共价修饰 , 而利用 C F T IR和 CD 对其二级结构的研究又证明两者之间存在构象上的差别 ,那么 Pr P是如何转变 Sc29 Sc ( ) 成 Pr P的呢 ? 研究者提出两种不同的机理 图 2: 一种转换模式认为 Pr P的形成是一种 Sc 核依赖的聚合过程 ,即“种子”模型 , Pr P低级聚合物C Sc 充当种子. 在没有“种子”存在时 , Pr P和 Pr P单体 C 之间发生快速的可逆性构象变化 ,但 Pr P单体构象 ScSc 比 Pr P稳定. 当 Pr P“种子”存 在 时 , 它 可 通 过 与 ScSc C Sc Pr P单体的结合稳定 Pr P构象 ,加速 Pr P向 Pr P 的转变. 对于这种稳定转换过程的障碍就是起始的 核形成过程. 低级聚合物的形成在热力学上并不是 有利的 , 因为依靠分子间相互作用所获得的自由能 不足以抵消结合所带来的熵增加 , 直到一个最小规 模的核形成后这种状况才得到改观. 这种模式表现 出聚合反应的一些特征 , 如需要超过临界浓度的蛋 白质浓度以及动力学反应是一个拖后的相变化 . 此 模式能够解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病 . 另一种转换模式是模板介导的转换过程 , 即重折叠 ScC 模式. 这种模式认为 Pr P构象比 Pr P更稳定 ,这种 C Sc 图 2 Pr P向 Pr P转变的模式() ( ) a“重折叠”模式 , b“种子”模式 转换在热力学上有利但在动力学上却进行得十分缓慢 ,两者之间存在能量屏障. 在这种模式ScC Sc 中 , Pr P依靠催化 Pr P或一个不稳定的中间体的重排来提高转换 ,以形成更稳定的 Pr P构 Sc象 . 感染性将依赖于 Pr P结合和催化中间分子转换的能力. 这种模式能够解释由于点突变 而引起的遗传性朊病毒疾病. 点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量同时加快它转换 Sc成 Pr P的速率. 然而这两种模式并不是相互排斥的 ,在朊病毒繁殖过程中有可能是这两种模 式共同作用. 30 ,31 Sc C 在体外实验中 Caughey 和他的同事利用预先存在的 Pr P把 Pr P转变成一种类似 ScPr P的抗蛋白酶水解的结构异型体 ,这种异型体经蛋白酶 K 消化后类似于 Pr P. 因为只 27,30 C Sc Sc 有很少数量的 Pr P发生转变 ,还存在大量预先加入的 Pr P,因此检测新生 Pr P是否具有感 Sc 染性在技术上是不可能的 . 比较有意思的发现是利用 3 mol/ L 盐酸胍对 Pr P进行预处理 ,造 ScSc Sc成 Pr P不可逆折叠 ,增加了新生的 Pr P的转换 ,这可能意味着 Pr P本身也需要一个构象的 改变以适应转换过程. C Sc 在体外条件下不同 p H 、温度及缓冲液成分都影响 Pr P向 Pr P转换. 有实验表明 ,在还 Sc β原条件下特别是 p H > 7 . 0 后 ,纯化的 Pr P 表现出高- 折叠含量 ,溶解度降低 ,类似于 Pr P. C 32 α 而在氧化条件下表现出高的- 螺旋含量 ,类似于 Pr P. C 体外转变实验不能证明 Pr P能够变成有感染性的结构异型体 ,这使人们更加怀疑是否在 C Sc体内有别的因子参与 Pr P向 Pr P的转变. 利用培养的细胞研究 Pr P 蛋白的合成和转变过程 C Sc可以得知 Pr P向 Pr P的转变可能发生在细胞内吞过程. GP I 锚点蛋白一般定位于富含胆固 C Sc 醇的质膜表面 . 曾证明抑制胆固醇的合成 ,同时也抑制 Pr P向 Pr P的转变. 进一步研究表 C ScSc 明 Pr P和 Pr P共同定位于膜的穴样内陷类的结构域中 ,而且 lovastatin 能够抑制 Pr P的形 33 34 ,35 成 . 这些实验表明 CL Ds 可能是朊病毒合成的地方. Prusiner 和他的同事利用转基 Sc因鼠研究朊病毒繁殖过程发现除 Pr P 外可能还有别的蛋白分子参与 Pr P的形成 ,此蛋白分子 C 被命名为蛋白质 X. 突变分析发现在 Pr P分子结构表面有同蛋白质 X 相互作用的不连续表 C 位 ,它们是第 167 , 171 , 214 和 218 位氨基酸残基 . 从已知的 Pr P三维结构得知这些残基位C 于 Pr P的 HB 和 HC 形成的 V 型结构的开口处 ,214 位和 218 位氨基酸残基侧链从螺旋的表 面突出与环区的 167 位和 171 位残基形成一个不连续的表位 ,是蛋白质 X 结合的位置. Eden2 36 C ( ) hofer 等人利用双杂交显示法 t wo- hybrid screen证明地鼠 Pr P同分子伴侣 Hsp 60 之间存 C C 在特异的相互作 用 , 其 作 用 位 点 在 Pr P的 180 , 210 位 的 残 基. 其 他 实 验 也 表 明 Pr P和 Hsp 60 存在于相同的亚细胞部位 . 由此可以推测 Hsp 60 可能就是蛋白质 X. 一般情况下 , 在新生肽链的折叠和成熟过程中 ,糖基化起着非常重要的作用. Pr P 含2 个 Sc 37 N 型寡糖链 ,由此推测这 2 个糖链在 Pr P生成的构象转变过程中可能起着一定的作用. C Sc 实验表明糖基化位点的残基发生突变后 Pr P仍可转变为 Pr P,并且在糖基化抑制剂突尼卡 Sc Sc ( ) 霉素 t unicamycin存在的情况下 , Pr P仍可合成 . 这些结果说明 N 型糖链对 Pr P的形成并 Sc 不是必需的. 但有实验表明糖链的存在可以改变 Pr P形成的效率 . Tarabo ule 等人发现经突 Sc 尼卡霉素处理羊瘙痒因子感染的细胞后 ,导致潜育期缩短和 Pr P的更快产生. 体外实验也证 明了这一点. 在一种人的朊病毒疾病的患病个体中发现其 Pr P 蛋白的 183 位残基发生突变使181 位的糖基化失活 ,发生了遗传性海绵脑病. 这些结果意味着 Pr P 分子中糖链帮助维持正 C Sc常的 Pr P构象 ,它的缺失有利于 Pr P的形成. 6 朊病毒的种属特异性和株系特异性C Sc 体外实验证明 Pr P能同预先加入的 Pr P共同温育形成具有抗蛋白酶水解的结构异型 ScC Sc Sc 体 ,这为 Pr P的繁殖是通过 Pr P向 Pr P的直接转变的假设提供了证据. 在 Pr P的繁殖过 程中存在朊病毒的种属特异性和株系特异性的现象. 种属特异性是指一个物种对另一物种产生的朊病毒颗粒的侵染具有抗性的现象 ,其外在 表现为潜育期的延长甚至不发病. 例如正常的小鼠对由地鼠产生的朊病毒株具有抗感染的能 力 ,但是转地鼠朊病毒基因的转基因小鼠却对地鼠产生的朊病毒株具有很高的感染性. 而且 C 当自身的 Pr P缺失后 ,转基因小鼠对小鼠朊病毒株也表现出抗性. 目前认为种属特异性的根本原因在于组成 Pr P 的氨基酸一级结构的差异 , 造成三维构象 上的不同所引起的. 在完整 Pr P 序列中鼠和地鼠共有 14 个氨基酸残基不同 , 而在构建成的 鼠和地鼠嵌合基因中 , 鼠的 112,180 位残基代替相对应的地鼠基因. 在这部分序列中有三 个氨基酸残基不同 :地鼠 Met 139 ?鼠 Ile 、地鼠 Asn155 ?鼠 Tyr 和地鼠 Asn 170 ?鼠 Ser . 而这 Sc38 足以阻止地鼠的 Pr P诱导嵌合的 Pr P 产生抗蛋白酶 K 水解的蛋白结构异型体. 从地鼠 Pr P 三维结构上看出包含 Met 139 ,Asn155 和 Asn170 三个残基的氨基酸片段形成的疏水区位 C Sc于 Pr P结构的表面 , 在转换过程中这段疏水区可能同 Pr P发生相互作用. 其他实验也表明 34 96,167 位氨基酸残基的不同对种属特异性的维持起关键作用. 由此说明 Pr P 一级结构 决定其种属特异性. 在朊病毒的繁殖过程中还存在株系的特异性 , 表现在潜育期长短不同 、脑中受到损伤的 Sc39 部位不同和 Pr P的蛋白酶 K 酶切位点不同形成不同分子量的蛋白几方面. 这些特征即使 40 是连续传代仍然保持. Teling 等人实验证明在 F F I 中特异的抗蛋白酶 K 水解片段去糖基 后分子量为 19 ku ,而在 CJ D 中相应的片段为 21 ku. 利用 F F I 和 CJ D 病人脑中的提取物分别 Sc Sc感染含嵌合人鼠基因的转基因鼠 ,特异地产生出 19 和 21 ku 的 Pr P. 这些结果表明 Pr P的 Sc 构象是指导新生 Pr P合成的模板. 也就是说朊病毒繁殖的信息是贮存在致病蛋白的构象中 , 不同的株系代表不同的蛋白构象. 7 Pr P 的功能ScC 朊病毒疾病的发生表现在 Pr P的积累 ,但是致病的根本原因是由于 Pr P的缺乏 ,还是由 ScC 41 于 Pr P的积累 ,以及 Pr P的生理功能是什么 ? 这些还不清楚. To bler 等人证实缺失 Pr P 的小鼠在昼夜节律和睡眠方式上发生了改变. 这使人们想到至少存在一种人类遗传性朊病毒 疾病 F F I 同 Pr P 的正常功能有关.F F I 病人中大多数丘脑核受到严重破坏 ,而丘脑回路的存 42 在是维持正常睡眠节奏所必须的. 还有实验报道缺失 Pr P 的小鼠海马组织中 GABA 介导 43 C 的神经传递抑制受到干扰 ,而且长期记忆能力也减弱. Nishida 等人进一步证实 Pr P蛋白对潜伏期学习和长期记忆的保持是必需的. CJ D 和 GSS 中痴呆的发生 ,可能是这些功能缺失 C Sc 的反应. 上述结果意味着朊病毒病的发生可能是正常 Pr P的缺失 ,而不是 Pr P的积累所引 起的. C 曾发现 Pr P蛋白不仅限于中枢神经系统中 ,在鼠和羊的淋巴细胞中也表达 ,而且在患病 Sc44 C 羊的淋巴组织也发现 Pr P的积累. Pr P是细胞膜蛋白 ,实验证明它参与 T 淋巴细胞的激 活 . 研究还发现 Pr P 八肽区与哺乳动物的 RN P A1 的核酸结合和链退火的八肽区有同源性 , 45 因此有可能同 RN P 一样具有 NAD H 依赖的氧化还原酶活性. 有实验发现 ,在 Pr P 缺失的 46 鼠中 Cu/ Zn 超氧化物歧化酶活性降低 ,因此对细胞内氧化压力更敏感导致细胞更快死亡. 2 + 还有实验表明朊病毒片段 106,126 能够调节小胶质细胞内的 Ca浓度 ,从而激活小胶质细47C 胞. 这些实验是否意味着 Pr P存在功能的多样性. 参 考 文 献 田 波. 亚病毒 ———病毒学的一个新分支. 病毒学报 , 1985 , 1 : 190,1601 () 2 Alper T , Cramp W A , Haig D A , et al . Does t he agent of scrapie replicate wit ho ut nucleic acid ? Nat ure Lo ndo n, 1967 , 214 : 764,766 Griffit h J S. Self- replicatio n and scrapie . Nat ure , 1967 , 215 : 1 043,1 044 3 Prusiner S B. Novel p roteinaceo us infectio us partides cause scrapie . Science , 1982 , 216 : 136,144 4 Prusiner S B , Bolto n D C , Grot h D G , et al . Furt her p urificatio n and characterizatio n of scrapie p rio ns. Biochemist ry , 1982 , 5 21 : 6 942,6 950 Basler K , Oesch B , Scoff M . Scrapie and Cellular Pr P isofo r ms are enco ded by t he same chro mo so mal gene . Cell , 1986 , 46 : 6 417,428 Stahl N , Baldwin M A , Hecker R , et al . Glyco sylino sitol p ho sp holipid ancho rs ot t he scrapie and cellular p rio n p rotein . Bio2 chemist ry , 1992 , 31 : 5 043,5 053 7 Vey M , Pilkuhn S , Wille H , et al . Subcellular colocalizatio n of t he cellular and scrapie p rio n p roteins in caveolae- like membra2 no us do mains. Proc Natl Acad Sci U SA , 1991 , 93 : 14 945,14 949 8 Meyer R K , Mc Kinley M P , Bowman K A , et al . Separatio n and p roperties of cellular and scrapie p rio n p roteins. Proc Natl Acad Sci U SA , 1986 , 83 : 2 310,2 314 9 Oesch B , Westaway D , Prusiner S B. A cellular gene enco des scrapie Pr P 27,30 . Cell , 1985 , 40 : 735,746 Tarabo ulo s A , Serban D , Prusiner S B. Scrapie p rio n p rotein accumulate in t he cytoplasm of persistently infected cult ured cel2 10 lls. The Jo urnal of Cell Biology , 1990 , 110 : 2 117,2 132 11 Ko rt h C , Stierli B , Mo ser M , et al . Prio n- specific epitope defined by a mo noclo nal antibo dy. Nat ure , 1997 , 390 : 74,77 12 13 Prusiner S B. Molecular biology of p rio n diseases. Science , 1991 , 252 : 1 515,1 522Prusiner S B. Prio n diseases and t he BSE crisis. Science , 1997 , 278 : 245,251 14 Li G , Bolten D C. A novel hamster p rio n p rotein mRNA co ntains an ext ra exo n : increased exp ressio n in scrapie . Brain Re2 15 search , 1997 , 751 : 265,274 Saeki K , Mat sumoto Y , Hirota Y , et al . Three- exo n st ruct ure of t he gene enco ding t he rat p rio n p rotien and it s exp ressio n in 16 tissues. Virus Genes , 1996 , 12 : 15,20 Tanji K , Saeki K , Mat sumoto Y , et al . Analysis of Pr P mRNA by in sit u hybridazatio n in brain , placenta , uterus and testis 17 of rat s. Intervirology , 1996 , 38 : 309,315 ( ) Hope J , Mo rto n L J O , Farquhar C F , et al . The majo r poly-peptide of scrapie- associated fibrils SA Fhas t he same size , 18 ( ) charge dist ributio n and N- ter minal p rocein sequence as p redicted fo r t he no r mal brain p rotein Pr P. EMBO J , 1986 , 5 : 2 591,2 597 Stahl N , Baldwin M A , Teplow D B , et al . St ruct ural st udies of t he scrapie p rio n p rotein using mass spect ro met ry and amino 19 acid sequencing. Biochemist ry , 1993 , 32 : 1 991,2 002 αβPan K M , Baldwin M , Nguyen J , et al . Co nversio n of- helix into- sheet s feat ures in t he fo r matio n of t he scrapie p rio n p ro2teins. Proc Natl Acad Sci U SA , 1993 , 90 : 10 962,10 966 20 Aguzzi A , Weissmann C. Prio n research : t he next f ro ntiers. Nat ure , 1997 , 389 : 795,798 Huang Z , Gabriel J M , Baldwin M A , et al . Propo sed t hree- dimensio nal st ruct ure fo r t he cellular p rio n p rotein . Proc Natl 21 Acad Sci U SA , 1994 , 91 : 7 139,7 143 22 Smit h C J , Drake A F , Baufield B A , et al . Co nfo r matio nal p roperties of t he p rio n octa- repeat and hydrop ho bic sequences. F EBS let t , 1997 , 405 : 378,384 23 αZhang H , Kaneko K , Nguyen J T , et al . Co nfo r matio nal t ransitio ns in peptides co ntaining t wo p utative- helices of t he p rio n p rotein . J Mol Biol , 1995 , 250 : 514,526 24 ( ) Reik R , Ho rnemann S , Wilder G , et al . NMR st ruct ure of t he mo use p rio n p rotein do main Pr P 121,231. Nat ure , 1996 ,382 : 180,182 25 J ames T L , Liu H , Ulyanov N B , et al . Solutio n st ruct ure of a 142- residue reco mbment p rio n p rotein co rrespo nding to infec2 tio us f ragment of t he scrapie isofo r m. Proc Natl Acad Sci U SA , 1997 , 94 : 10 086,10 091 26 Rick R , Ho rnemann S , Wilder G , et al . NMR charecterizatio n of t he f ull- lengt h reco mbinant murine p rio n p rotein . F EBS let t , 1997 , 413 : 282,288 Do nne D G , Viles J H , Grot h D , et al . St ruct ure of t he reco mbinant f ull- lengt h hamster p rio n p rotein Pr P 29,231 : The N 27 ter minas is highly flexible . Proc Natl Acad Sci U SA , 1997 , 94 : 13 452,13 457 Ho rwich A L , Weissman J S. Deadly co nfo r matio ns- Protein mistolding in p rio n disease . Cell , 1997 , 89 : 499,510 28 Kocisko D A , Co me J H , Priola S A , et al . Cell-f ree fo r matio n of p rotease- resistant p rio n p rotein . Nat ure , 1994 , 370 : 471,474 29 Caughey B , Kocisko D A , Raymo nd G J , et al . Aggregates of scrapie- associated p rio n p rotein induce t he cell-f ree co nversio n 30 of p rotease- sensitive p rio n p rotein to t he p rotease- resistant state . Chem Biol , 1995 , 2 : 807,817 Yo koyama T , Ito hara S , Yuasa N . Detectio n of species specific epitopes of mo use and hamster Pr Ps by anti- peptide antibo d2 31 ies. Arch Virol , 1996 , 141 : 763,769 Kaneko K , Vey M , Scot t M , et al . COO H- ter minal sequence of t he cellular Pr P direct s subcellular t rafficking and co nt rols co nversio n into t he scrapie isofo r m. Proc Natl Acad Sci U SA , 1997 , 94 : 2 333,2 338 32 Telling G C , Scot t M , Mast rianni J , et al . Prio n p ropagatio n in mice exp ressing human and chimeric Pr P t ransgenes implicates t he interactio n of cellular Pr P wit h anot her p rotein . Cell , 1995 , 83 : 79,90 33 Kanek K , Zulianello L , Scot t M , et al . Evidence fo r p rotein X binding to a disco ntinuo us epitope o n t he cellular Pr P during scrapie p rio n p ropagatio n . Proc Natl Acad Sci U SA , 1997 , 94 : 10 069,10 074 34 C Edenhofer F , Rieger R , Famulo k M , et al . Prio n p rotein Pr Pinteract s wit h molecular chapero nes of t he Hsp60 family. J Vi2 rol , 1996 , 70 : 4 724,4 728 35 36 生物途径控制虫害 李向辉朱 祯 ( ) 中国科学院遗传研究所 ,北京 100101 摘要 在植物生物技术迅速发展中 ,最先走向市场的是抗病虫害的工程作物品种 . 在综合分析了抗虫遗传工程研究的进展 ,转基因作物研究中有关外源基因的转移和表达 ,后代的遗传稳 定性以及其潜在的安全性等问题后 ,并针对这些问题提出了重视开发生物防御机制的生物技 术 ,如昆虫病毒载体 ,昆虫性信息素 ,以及害虫自然天敌的修饰和利用 ,以期形成一个可持续利 用和发展的控制虫害的完整策略. 关键词 植物抗虫 基因工程 生物防治 生物安全性 随着农业集约化耕作的推广 ,化学杀虫农药的大量使用 ,在控制虫害发生的同时 ,也 杀伤了大量有益的生物 ,包括害虫的天敌 ,反而引起害虫更加猖獗 ,虫害发生频率更加频繁. ( ) 稻飞虱 N i l a r p a rv at a l u gens stal在 60 年代前每 5,10 年发生 1 次 ,1980,1995 年间平均每 1 3 年就有 2 年猖獗暴发虫害. 害虫对各类化学农药产生耐药性问题日趋严重 ,目前已发现 2 ( 有 504 种昆虫与螨类对多种农药产生了抗药性. 仅在 1980 , 1990 年间棉铃虫 Hel iot his 37 L ehmann S , Harris D A. Blockade of glyco sylatio n p ro motes acqusitio n of t he scrapie- like p roperties by t he p rio n p rotein in cult ured cells. The J Biol Chem , 1997 , 272 : 21 479,21 487 Kocisko D A , Priola S A , Raymo nd G J , et al . Species specificit y in t he cell-f ree co nversio n of p rio n p rotein to p rotease- resis2 38 tant fo r ms : a mo del fo r t he scrapie species barrier . Proc Natl Acad Sci U SA , 1995 , 92 : 3 923,3 927 Carp R I , Meeker H , Sersen E. Scrapie st rains retain t heir distinctive characteristics following passages of ho mogenates f ro m 39 diffirent brains regio ns and spleen . J Gen Virol , 1997 , 78 : 283,290 Telling G C , Parchi P , DeAr mo nd S J , et al . Evidence fo r t he co nfo r matio n of t he pat hologic isofo r m of t he p rio n p rotein en2 40 cip hering and p ropatating p rio n diversit y. Science , 1996 , 274 : 2 079,2 082 To bler I , Gause S E , Deboer T , et al . Altered circadian activit y r hyt hms and sleep in mice devoid of p rio n p rotein . Nat ure , 41 1996 , 380 : 639,642 Maschi G , Ro ssi G , Abbamo ndi A , et al . Diff use t halamic degeneratio n in fatal familial inso mnia , a mo rp ho met ric st udy. Brain Research , 1997 , 771 : 154,158 42 Nishida N , Katamine S , Shigemat su K , et al . Prio n p rotein is necessary fo r latent learning and lo ng- ter m memo ry retentio n . Cellular and Molecular Neuro biology , 1997 , 17 : 537,545 43 Kaulen V , Schrender L J M , Meloen R H , et al . Immuno histochemical detectio n of p rio n p rotein in lymp hoid tissues of sheep wit h nat ural scrapie . J Clin Micro , 1996 , 34 : 1 228,1 231 44 Radulescu R T , Ko rt h C. Prio n f unctio n and dysf unctio n : a st ruct ure- based seenario . Medical hypot hesis , 1996 , 46 : 225, 228 45 Brown D R , Schulz- Schaelfer W J , Schmidt B , et al . Prio n p rotein- deficient cells showed altered respo nse to o xidative st ress due to decreased SOD- 1 activit y. Experimental Neurology , 1997 , 46 : 104,112 46 2 + Her ms J W , Madlung A , Browm D R , et al . Increase of int racellular f ree Cain microglia actived by p rio n p rotein f ragment . Glia , 1997 , 21 : 253,257 47 ( )1998203204 收稿 ,1998205207 收修改稿