SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

? ? ? w w w . eb i o e. co m SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋 白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统。 基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亚甲基双丙稀 酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺 （ammonium persulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体 开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺， 使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 SDS聚丙浠酰胺凝胶电泳原理 采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋 白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统。 基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亚甲基双丙稀 酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺 （ammonium persulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体 开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺， 使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 SDS聚丙浠酰胺凝胶电泳原理 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m(acrylamide) 丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯 酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品 在高温（ 120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺。 研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙 烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。 丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收 最快。进入人体内的丙烯酰胺约90％被代谢，仅少量以原形经尿液排出。 丙烯酰胺进入体内后，会在体内与DNA上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致 遗传物质损伤和基因突变。 对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明， 丙烯酰胺具有神经毒性作用，但目前还没有充足的证据表明通过食物摄入 丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显关系。 丙烯酰胺 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 丙烯酰胺简介 丙烯酰胺是一种有机化合物，别名AM；纯品为白色结晶固体，易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇， 稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解成丙烯酸。职业性接触主要见于丙烯 酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成，在地下建筑、改良土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也 有接触机会。日常生活中，丙烯酰胺可见于吸烟、经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中。 [毒性] 丙烯酰胺属中等毒类，对眼睛和皮肤有一定的刺激作用，可经皮肤、呼吸道和消化道吸收， 在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒， 中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起 慢性中毒，中毒者出现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、 脱屑，手掌、足心多汗，进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。 丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用，可引起哺乳动 物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器 官肿瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前 还没有充足的人群流行病学证据表明，食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性。 国际癌症研究机构（IARC）对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2类致癌物（2A），即人 类可能致癌物。其主要依据为，丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为致癌活性代谢产物环氧 丙酰胺。 [预防] ⒈职业性接触者要通过改革工艺、采取工程技术措施等手段，降低工作场所空气中丙烯酰胺的 浓度；同时通过加强个人防护，如戴口罩、手套，穿防护服和鞋等，以防止或减少丙烯酰胺进 入体内。 ⒉日常生活中尽量避免过度烹饪食品，如温度过高或加热时间太长。提倡平衡膳食，减少油炸 和高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜，不要吸烟。 ⒊由于煎炸食品是我国居民常吃的食物，国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国 人群丙烯酰胺的暴露评估，并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m（N,N’-methylene bis acrylamide） N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰 胺，N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强 光则自交联，微溶于水、乙醇。 丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。 N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色或浅黄色 粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙醇、丙酮等有机溶 剂。在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将 线性高分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发 生聚合反应 ,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。 N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉） ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co mTEMED (N,N,N',N'-四甲基二乙胺 ) 产品简介： Ø TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine，中文名为 N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2，分子量为 116.20。 Ø 进口分装，用于配制PAGE胶等。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基 而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 Ø 加入加速剂TEMED后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。 保存条件： 4℃保存。 注意事项： Ø易燃，有腐蚀性，请注意防护。 Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 过硫酸铵分子式: (NH4)2S2O8分子量: 228.20 性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发 剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外， 它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项： 过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下 储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不 利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分 解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和 轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。 过硫酸铵的应用：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须 新鲜配制。过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯等产品的引发 剂，同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的引发剂。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统：在Acr 和Bis的溶液中放入这个 催化系统后，过硫酸铵[（NH4）2S2O8]产生出游离氧原子使单体成为具有 游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方 根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH 8.8条件下7 ％的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕；在 pH 4.3时聚合很慢，要90分钟 才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升 高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近0℃的地方，就能延缓聚合。一 般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。 为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气， 然后再混合。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶（pH6.7，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提 高分离效果。分离胶（pH8.9，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中 的各组分按分子量和电荷的大小而分开。 如果要利用凝胶电泳测定某一蛋白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到 可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电 荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS是一种阴离子去污剂。 在电泳体系中加入一定浓度的SDS，SDS以一定的比例和蛋白质分子结合成复 合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷， 从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的差异。 十二烷基硫酸钠 SDS 是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， 再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。 在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS-PAGE只是按照 分子大小分离的，而不是根据分子所带的电荷和大小分离的。 SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原 有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均 带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组 分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形 成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的 两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白 质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶 泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀 的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 甘氨酸 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离 胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。 在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔 径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只 有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左 右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞ H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。电 泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间 形成—个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好 介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成— 条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m电荷效应：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动 速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一 的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种 蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。但在 SDS-PAGE电泳中， 由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使 蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差 别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的 蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、 疏水键等非共价键。与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液 中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动 率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合 物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m Acr-Bis 产品简介： Ø 40% Acr-Bis(39:1)即为含40％ acrylamide-bisacrylamide的水溶液，其中 acrylamide和bisacrylamide的比例为39:1。 Ø 40% Acr-Bis(39:1)常用于配制各种PAGE凝胶，例如EMSA凝胶、RPA凝胶等， 可以用于蛋白或核酸等的分离，是实验室的常用储备液。 保存条件： 4℃避光保存。 注意事项： Ø 40% Acr-Bis(39:1)有一定毒性，使用时请注意适当防护。 Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶 是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰 胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而 成的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时 应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的 方法有两种，即化学法和光化学法。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 电泳槽 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液 蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的 SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。 本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的 链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶 上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。 注意事项 分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇， 有轻微刺激性气味，较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套 操作。 使用说明 1. 按每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上 样缓冲液(5X)。 2. 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 3.冷却到室温后离心数秒钟，混均后再离30秒钟，取上清直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。 4.通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5-1cm)即可停止电泳。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的 甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔 中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。 SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定 液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效 果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配 制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均 可。 甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋 白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组 织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5%的 浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯 仿混合。 甲醇/冰醋酸固定液 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue） 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的 测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质 通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔 定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式， 最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与 其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光 吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白 质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高， 在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏 4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。 此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍 有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多 染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250） 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红 色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在 595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡， 完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建 立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍， 可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用 的微量蛋白质快速测定方法。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com ? ? ? w w w . eb i o e. co m Triton-100 Triton-100洗涤剂透压的裂解去垢剂（）通过形成微团能溶解细胞膜的疏水 结构。是温和的，非离子的去垢剂，不会使得蛋白质变性（相比较接下来即 将要 用到的SDS 来说）。 ???-?????！ www.bbioo.com ???-??????????? www.ebioe.com