蛋白质折叠

《分子生物物理学》研究生评述 2003 蛋白质折叠 徐晓风 北京大学基础医学院 生物物理学系 摘要 蛋白质折叠一直以来是研究者们研究的重点，受到极大重视，本文主要讲述了蛋白质 折叠的热力学控制学说和动力学控制学说，并详细阐述了大分子拥挤与蛋白质折叠以及小 分子折叠中的隐藏中间体理论。从总体上讲，蛋白质的折叠是遵循“热力学假说”的，但 在折叠过程中还会受到动力学上的控制。热力学控制与动力学控制在蛋白多肽链的折叠反 应中是统一的。大分子拥挤是普遍存在的，各种类型的细胞中都有的，多肽链是在高度拥 挤的环境中正确折叠的。人们认为部分折叠中间体的存在对于蛋白质在生物意义的折叠是 关键的，尽管部分折叠蛋白质在大蛋白中是普遍存在的，而在小分子蛋白（小于 100个氨 基酸）的动力学折叠中还未见到，近来自然状态的氢键交换研究明部分折叠中间体可能 存在于小蛋白分子速率限制转换状态之后。 关键词 蛋白质折叠 控制 大分子拥挤 隐藏中间体 levinthal假说 蛋白质折叠的热力学与动力学控制 一条伸展的多肽链为什麽能折叠成具 有特定空间构象的蛋白质？这是一直以来 困扰科学家的问。由 Anfinsen [1]等根据对 RNase 复性研究的经典实验提出来的经典 的“热力学假说”认为天然蛋白质多肽链采 取的构象是在一定环境条件下热力学上最 稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所 处的一定环境条件（如溶液组分、PH、温 度、离子强度等）整个系统的总自由能最低， 所以处于变性状态的多肽链在一定的环境 条件下能够自发折叠成天然构象。许多蛋白 （特别是一些小蛋白）在体外可以可逆的进 行变性、复性，使“热力学假说”得到了广 泛的支持。 但是随着研究的深入，人们发现许多 多肽链的体外复性效率较低，而且其复性速 度大大低于其在体内的折叠速度。有人提出 若某一多肽链具有两种低能量状态：一种是 天然构象，一种是非天然构象，而且处于这 两种低能量状态的多肽链的相互转变由于 要克服较高的能垒而难以实现，那麽在蛋白 质折叠过程中会有两种途径相互竞争，一种 是正确折叠成天然构象的途径，另一种是错 误折叠成稳定的非天然构象的途径。研究证 实 I 型人类胰岛素生长因子存在两种稳定 的构象，一种是天然构象，另一种是具有错 配二硫键的非天然构象，处于这两种构象状 态的多肽链具有相似的自由能，但二级结构 的成份不同。这说明多肽链在折叠过程中实 际上受到许多因素的限制作用，可见蛋白质 多肽链的正确折叠是由于一些因素在蛋白 质折叠的动力学过程中起到控制作用。 人们现在已分离到一些能在动力学上 促进多肽链正确折叠的辅助因子。如，分子 伴侣可通过与伸展多肽链结合而帮助多肽 链进行正确的非共价组装。蛋白质二硫键异 构酶及脯氨酸顺反异构酶可促进具有错配 二硫键的多肽链进行二硫键重排，脯氨酸顺 反异构酶还可促进多肽链走入正确的折叠 途径。这些事实有力的说明了动力学控制在 多肽链正确折叠过程中所起的重要作用及 真实性。 对不同的蛋白质它们的折叠并不是千 篇一律，而是各有特点。从总体上讲，蛋白 质的折叠是遵循“热力学假说”的，从高能 态向低能态转变，但在这个过程中会受到动 力学上的控制。热力学控制与动力学控制在 蛋白多肽链的折叠反应中是统一的，不同的 蛋白质的折叠过程中所体现出来的二者所 起作用大小可能有所不同。对一些小分子单 结构域的蛋白质来说，折叠过程简单，在热 力学控制下较易完成；而一些结构较复杂的 蛋白质特别是一些在折叠时需要二硫键重 排，脯氨酰顺反异构化的蛋白质在折叠过程 中从总体上是受热力学控制，但折叠途径受 动力学控制就更重要了。 大分子拥挤对蛋白质折叠的影响 1 《分子生物物理学》研究生评述 2003 1 大分子拥挤现象 长期以来，体外蛋白质折叠试验是在稀 溶液中进行的，以避免在再折叠过程中发生 蛋白质自身聚集现象。而在生命有机体中， 目的反应并不是在无任何约束的的稀溶液 中进行的，生理媒介大多数是大分子，远比 通常体外研究拥挤，因此研究者们提出了 “大分子拥挤”的概念[2]：任何细胞其内部 都是一种高度拥挤的状态，生物大分子聚集 在一起使得细胞内的总浓度达到了一种相 当高的水平，致使细胞总体积有很大一部分 被这些大分子占据，因而这些被占据的体积 则不能被其他分子利用。如，细胞内蛋白质 的总浓度达到 200－300g/l，RNA的总浓度 达到 75－150g/l。一些研究者将大分子拥挤 定性为“已占体积效应”[2]，即由于空间排 斥而引起的纯物理性质的非特异效应，它是 不可避免的。据此，研究者们建立了一种模 型用以阐明“已占体积效应”。在这个模型 中，用一种悬浮液表示细胞内拥挤的大分子 溶液，一种或几种致密的粒子悬浮其中以代 表相对应的细胞中的大分子，它们具有较为 接近的体积和形状。 2 大分子拥挤与蛋白质折叠 Zimmerman和Minton建立了不同的反 应模型系统[2]，从而测定大分子拥挤环境对 反应速率和反应平衡的影响。结果表明，加 入大分子拥挤试剂后，不仅加快了反应速 率，而且使平衡向着结合的方向移动。根据 已占体积理论，高浓度的惰性大分子可以巩 固稳定致密的蛋白质的天然状态，提高惰性 大分子的浓度，可以降低解折叠多肽链的含 量并最终导致平衡向着形成蛋白质天然结 构的方向移动。当溶液中的蛋白质浓度增 加，拥挤效应对活性系数的影响远比对浓度 的影响要大的多，拥挤效应对活性系数的影 响还和参与的蛋白质的构型熵有关，拥挤环 境限制了蛋白质相互反应过程中的构象变 化。 然而，拥挤也会引起部分折叠蛋白质 之间的相互聚合从而降低了部分折叠蛋白 质转变为天然功能蛋白质的数量。Van denBerg等人认为，拥挤体系加强了非天然 蛋白质之间的聚合程度，在大分子拥挤环境 中，和已占体积效应对非天然蛋白质命运的 决定影响力相比，蛋白质与拥挤试剂之间的 异源聚合反应在蛋白质的再折叠过程中发 挥了重要作用。 小蛋白折叠中的隐藏中间体和 levinthal 假 说 1 levinthal假说 自从 anfinsen 和他的同事提出了热力 学假说：自然状态有最低的自由能。而描述 一个未折叠的蛋白质怎样找到它的自然状 态的简单和一般的模型还不太可能。在 1968 年 levinthal 提出了 levinthal 假说：一 个未折叠的蛋白质分子，没有时间寻找所有 可能的构象，然而它很快就能到达唯一的自 然状态。关于这一假说怎样解释有两个不同 的关点。一种传统的观点认为，部分未折叠 中间体的存在对于解释假说是关键的，因为 它们允许折叠逐步发生并有效减少构象搜 索的范围。近来的观点认为如果未折叠的分 子是在漏斗样能量地形中寻找自然状态的， 这就能解释假说[3]。在这一观点中，中间体 的存在对未折叠分子到达自然状态不是必 需的，相反，这些中间体的聚集是由于能量 地形险峻的结果。在早期实验研究中，中间 体很容易检测，支持了传统观点。然而，在 这些研究中的蛋白质都相对较大（大于 120 个氨基酸）。而近来的研究都是针对小的单 结构域蛋白，它们都小于 100个氨基酸，在 它们的动力折叠实验中一般不能检测到中 间体，这样传统观点就失去了支持[4]。 单单在动力学实验中没观察到中间体 还不能表明折叠中间体是不存在的，因为在 传统的动力学研究中某些原则阻止了中间 体被检测到[5]。中间体若要被检测到，它必 须占有一个自由能井，而这一自由能井比以 前折叠过程中所经过的能量都低，而且它要 遇到一个能量最高的能垒。如果后来的能垒 比折叠过程中所遇的能垒小，或者中间体不 如未折叠状态稳定，则在传统动力学折叠实 验中，中间体就不能被检测到。 2 隐藏中间体的检测 在 1995年，bai等[6]用自然状态的氢键 交换 (HX)检测到部分未折叠形式 （PUFs）的存在，在自然平衡条件下它们 2 《分子生物物理学》研究生评述 2003 比未折叠的状态更稳定。这样，这种方法就 提供了检测一型隐藏中间体存在的方法。应 用这种方法，检测到了细胞色素 c(cyt c,104 个氨基酸)中三个 PUFs的存在。这些 PUFs 的结构包含象螺旋、欧米加环这样的相互协 作的结构单元的连续性构象，这些 PUFs正 是所期望的蛋白质折叠步骤中的存在方式， 而且还能解释 levinthal假说。然而，令人奇 怪的是在 PH值 4.9的条件下在传统的折叠 实验中不能检测到任何中间体。这就引出了 最初的推断，即在细胞色素 c的折叠通路中 PUFs可能以有序的一型隐藏中间体形式存 在[7]。关于细胞色素 c折叠的可能实验数据 与推断的折叠通路是一致的。在 PH 值 6.2 时当组氨酸残基和血红素中 Fe3+的非离子 连接产生了折叠过程中的非内在错误折叠 识别能垒，带有 C和 N末端螺旋折叠的中 间体可检测到，用峰标记方法突出了氨基的 H/D 交换。天然构象中的中间体是动力性 的，而不是非天然构象中的中间体。近来， Hoang 等提出了更有力的证据对推断的折 叠通路在高 PH值条件下，应用动力学自然 状态 HX 方法直接观察到了连续的非折叠 过程。 Sanchez 和 Kiefhaber[8]分析了从 23 种 小蛋白得到的实验数据，这些小蛋白在激活 自由能和变性剂浓度之间显示了非线性关 系，但却没有中间体可直接被检测到。他们 把这些数据应用到具有较大能垒的二态模 型和具有隐藏中间体的三态模型，结果证 实，这些数据支持了中间体的存在。 近来计算机的仿真研究也为隐藏中间 体 的 存 在 提 供 了 证 据 ， Berriz 和 Shakhnovich[9]仿真了小的三螺旋束蛋白的 折叠：在蛋白 AB结构域发现了一种中间体 存在于限速转变状态之后。 3 中间体，限速步骤和 Levinthal假说 由于部分未折叠中间体存在于折叠通 路中，限速步骤可发生在折叠过程中的任何 能量转变状态，中间体在解释 Levinthal 假 说和决定折叠速率中的作用是很重要的。折 叠通路的中间体能减少构象寻找过程的时 间，而不用考虑它存在于限速步骤之前还是 之后。然而，观察到的折叠速率反映了限速 事件发生在小的时间范围，在这一时间范围 折叠中间体可以起或不起重要作用。解释这 一观点的最好例子是细胞色素 C 的折叠行 为，在 PH值为 4.9时，细胞色素 C在毫秒 的时间范围折叠，而没有检测到动力学折叠 中间体[10]，限速步骤是带有 N和 C末端螺 旋折叠的中间体的形成的内在的成核过程， 在 PH值 6.2时，cyt c在秒的时间范围折叠 [11]，限速步骤是组氨酸残基和血红素 Fe3+ 在从第一中间体到自然状态的折叠过程中 的已形成的非自然化学键的断裂。虽然限速 步骤和折叠速率的物理本质是不同的，但在 两个事件中由于相同系列的折叠中间体的 存在而解释了 Levinthal假说。 结论 综上所述，蛋白质折叠是快速又极其复 杂的过程，从总体上讲，蛋白质的折叠是遵 循“热力学假说”的，但在这个过程中会受 到动力学上的控制。热力学控制与动力学控 制在蛋白多肽链的折叠反应中是统一的，不 同的蛋白质的折叠过程中所体现出来的二 者所起作用大小可能有所不同。大分子拥挤 是普遍存在的，各种类型的细胞中都的，所 以机体通过进化保证正确蛋白质折叠。一方 面，分子伴侣和折叠酶可以帮助多肽链在高 度拥挤的环境中正确折叠；另一方面，大分 子本身具有折叠信息以应对大分子拥挤。不 同的蛋白质多肽链获得不同的应对高度拥 挤环境的能力。可以设想，模拟细胞内环境 加入拥挤物质也会逐渐成为一种研究大分 子的途径，从而加深对分子间相互作用的了 解。无论现有的实验方法能否检测到中间体 的存在，可以肯定中间体是实际存在的，因 此，很好的解释了 Levinthal假说。 参考文献 1 唐兵 蛋白质的折叠，氨基酸和生物资 源，1997，19（3）：51－54 2 闫菡 郭占云 冯佑民 大分子拥挤及 其对蛋白质折叠的影响，2003，32（3）： 246－247 3 K.A. 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