SNT 2767-2011 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒反转录聚合酶链式反应检测方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２７６７—２０１１ 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链式反应检测方法 犚犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀 犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋 ２０１１０２２５发布 ２０１１０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、上海之江生物科技有限公司。 本标准主要起草人：关淳、郑夔、孙哲平、张霞、高旗利、宋锋林、刘培、贺艳、张海滨、邵俊斌。 Ⅰ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链式反应检测方法 １　范围 本标准了国境口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测对象、生物安全、检测方法、结果报告 及处置。 本标准适用于对口岸蚊类携带的乙型脑炎病毒的检测及报告。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 乙型脑炎病毒　犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊 乙型脑类的病原体，为黄病毒属，具有包膜的单正链ＲＮＡ病毒。乙型脑炎病毒颗粒呈球形，壳体 为２０面对称体，内为含ＲＮＡ的核心，包以含脂蛋白的封套，外面还有含糖蛋白的表面突出物，其表面 突出物具有血凝活性。 ４　检测对象 国境口岸蚊类中能携带乙型脑炎病毒的成蚊及其幼蚊，如：白纹伊蚊、日本伊蚊及东方伊蚊等伊蚊， 三带喙库蚊、二带喙库蚊、魏仙库蚊、伪杂鳞库蚊、困扰库蚊、致倦库蚊、淡色库蚊及白雪库蚊等库蚊，中 华按蚊等按蚊。 ５　实验室生物安全要求 ５．１　实验室生物安全要求见ＧＢ１９４８９。 ５．２　下列操作应在生物安全２级（ＢＳＬ２）实验室中进行： ———可能产生含病毒气溶胶的样品处理； ———收集或浓缩病毒； ———病毒ＲＮＡ提取和扩增； ———离心管和离心机转头的封闭和开启。 １ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６　反转录聚合酶链反应检测 ６．１　主要器材和设备 ６．１．１　ＰＣＲ仪。 ６．１．２　电泳仪。 ６．１．３　紫外凝胶成像仪。 ６．１．４　台式低温离心机：１００００犵。 ６．１．５　组织研磨机或电动匀浆机。 ６．１．６　低温冰箱：－８０℃。 ６．２　试剂 ６．２．１　样品制备及ＲＮＡ提取试剂：青霉素、链霉素、Ｈａｎｋ’ｓ液、裂解液、三氯甲烷、无ＲＮａｓｅ超纯水、 ７５％乙醇、异丙醇（未开封新品）、ＤＥＰＣ。 ６．２．２　ＲＴＰＣＲ反应试剂：上游引物Ｐ１（５’ＣＡＴＴＣＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＣＣ３’），下游引 物Ｐ２（５’ＧＡＣＧＴＣＣＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＧ３’），逆转录酶ＡＭＶ（１０Ｕ／μＬ），犜犪狇ＤＮＡ聚合酶 （５Ｕ／μＬ），ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），氯化镁溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），ＲＮａｓｅ抑制剂，１０×ＰＣＲ缓冲液，阳性对照 （乙型脑炎病毒弱毒疫苗，病毒效价不低于１０６ＰＦＵ，用 Ｈａｎｋ’ｓ液复溶成２．０ｍＬ液体，取２０μＬ加入 １８０μＬＨａｎｋ’ｓ液混匀制成取阳性对照），阴性对照，琼脂糖（纯），溴化乙锭或其他有效染料，分子 量标记，５×ＴＢＥ电泳缓冲液，６×加样缓冲液。 ６．３　操作方法 ６．３．１　样品采集 将采集的蚊虫标本冷冻致死，分类、分组（标本数量较多时可以３０只～５０只为一组），置－８０℃低 温冰箱或液氮中保存。 ６．３．２　样品制备 将待检蚊虫标本每组分别用含青霉素（１０００Ｕ／ｍＬ）、链霉素（１０００Ｕ／ｍＬ）的无菌生理盐水清洗三 次，每组蚊样加入２．０ｍＬＨａｎｋ’ｓ液，在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆２０ｓ～３０ｓ，使样品匀 浆成糊状，１０００犵离心３ｍｉｎ，取上清液作为样品。 ６．３．３　犚犖犃抽提 ６．３．３．１　为防止ＲＮＡ降解，所用实验用具及溶液应无ＲＮＡ酶，操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡 胶或乳胶手套，并经常更换，以避免皮肤表面的ＲＮＡ酶污染用具或带入溶液。 ６．３．３．２　取６．３．２中样品上清液２００μＬ加入１．５ｍＬ无ＲＮａｓｅ离心管中，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ或其他等 效裂解液，剧烈振荡３０ｓ，室温放置５ｍｉｎ。同时将阳性对照、阴性对照同步进行ＲＮＡ提取。 ６．３．３．３　加入０．２ｍＬ三氯甲烷，用力振荡至乳剂状，室温静置５ｍｉｎ，使水相和有机相分开，水相无色 在上，有机相红色在下。４℃１００００犵离心１５ｍｉｎ，使水相和有机相彻底分开，吸出水相至新的１．５ｍＬ 无ＲＮａｓｅ离心管中，计量大致体积，注意不要吸到有机相。 ６．３．３．４　加入与吸出水相等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置５ｍｉｎ。４℃１００００犵离心１０ｍｉｎ，使 ２ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ＲＮＡ沉淀。 ６．３．３．５　弃去上清液，加入１ｍＬ４℃预冷７５％乙醇洗涤沉淀，４℃１００００犵离心５ｍｉｎ，去尽乙醇。 ６．３．３．６　室温干燥５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，将ＲＮＡ溶解于１０μＬ无ＲＮａｓｅ超纯水中，立即用于ＲＴＰＣＲ检 测，或置于－８０℃低温冰箱保存。 ６．３．３．７　可使用商品化ＲＮＡ提取试剂盒按照操作说明书操作。 ６．３．４　犚犜犘犆犚检测 ６．３．４．１　ＲＴＰＣＲ反应液组成（总体积２５μＬ）：无ＲＮａｓｅ超纯水１３．８μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２．５μＬ， １０μｍｏｌ／Ｌ上下游引物混合液１．５μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁溶液１．２μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ＡＭＶ 反转录酶０．２μＬ，ＲＮａｓｅ抑制剂０．３μＬ，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶１．０μＬ提取的ＲＮＡ２．０μＬ。 ６．３．４．２　ＲＴＰＣＲ反应程序：４２℃４５ｍｉｎ，９５℃３ｍｉｎ；扩增条件为９５℃３０ｓ，５０℃４０ｓ，７２℃４０ｓ， ３５个循环后，７２℃延伸１０ｍｉｎ。 ６．３．５　电泳 用０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液配制１．５％琼脂糖电泳凝胶并趁凝胶未凝固时加入溴化乙锭或其他有效 染料使其最终浓度达到１μｇ／ｍＬ，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将７．５μＬ扩 增产物和１．５μＬ６×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入分子量标记。５Ｖ／ｃｍ恒压，电泳３０ｍｉｎ～ ４０ｍｉｎ。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。 ６．３．６　结果判定 当阳性对照出现３７５ｂｐ目的条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果成立。被检样品未出现 预期大小的扩增条带时，可判定检测结果阴性；被检样品出现预期大小的扩增条带时，应对扩增产物作 测序分析，证实待测样品中病毒核酸序列与乙型脑炎病毒序列一致，则可判定检测结果阳性。 ７　实时荧光犚犜犘犆犚检测 ７．１　主要器材和设备 ７．１．１　荧光ＰＣＲ仪。 ７．１．２　台式低温离心机：１００００犵。 ７．１．３　组织研磨机或电动匀浆机。 ７．１．４　低温冰箱：－８０℃。 ７．２　试剂 ７．２．１　样品制备及ＲＮＡ提取试剂：见６．２．１。 ７．２．２　实时荧光ＲＴＰＣＲ反应试剂：一步法探针荧光ＲＴＰＣＲ试剂，阳性对照（乙型脑炎病毒弱毒疫 苗，病毒效价不低于１０６ＰＦＵ，用Ｈａｎｋ’ｓ液复溶成２．０ｍＬ液体，取２０μＬ加入１８０μＬＨａｎｋ’ｓ液混匀 制成取阳性对照），阴性对照，上游引物Ｐ１（５’ＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＡＣＣ３’），下游引物Ｐ２ （５’ＧＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＧＴＡＧＣ３’），探针（５’ＦＡＭＣＴＧ犆犜Ｃ犜Ａ犜Ｃ犜Ｃ犃Ａ犆ＡＴＣＢＨＱ１下划线 斜体字母表示ＬＮＡ修饰碱基３’）。 ３ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ７．３　操作方法 ７．３．１　样品采集 同６．３．１。 ７．３．２　样品制备 同６．３．２。 ７．３．３　犚犖犃抽提 同６．３．３。 ７．３．４　实时荧光犚犜犘犆犚检测 ７．３．４．１　实时荧光ＲＴＰＣＲ反应液组成（总体积２５μＬ）：一步法探针荧光ＲＴＰＣＲ试剂（根据浓度不 同，体积有所差异），每条引物终浓度为１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，探针终浓度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ，ＲＮＡ量为５μＬ，无 ＲＮａｓｅ超纯水补足至２５μＬ。 ７．３．４．２　实时荧光ＲＴＰＣＲ反应程序：４５℃１０ｍｉｎ；９５℃１５ｍｉｎ；再按９５℃１５ｓ、６０℃６０ｓ，循环 ４０次；单点荧光检测在６０℃，反应体系为２５μＬ。荧光通道检测选择：选用ＦＡＭ通道。 ７．３．５　结果判定 ７．３．５．１　基线的设置 实时荧光ＰＣＲ反应结束后进行结果分析时，应设置基线范围。基线范围选择一般在６个～１５个 循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以阈值线刚好超过正常阴性对 照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ｃｔ值不出现任何数值为准。 ７．３．５．２　质控标准 阴性对照检测结果应为无荧光增幅现象，阳性对照品检测结果ＦＡＭ通道Ｃｔ≤３５，且曲线具有明显 的荧光增幅现象。以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。若阴性对照出现荧光增幅现象，说明 在样品提取或反应体系中存在污染，可能出现检测结果假阳性；阳性对照结果无荧光增幅现象，说明反 应体系存在问题，检测可能出现假阴性结果。根据对照结果分析问题，重新检测样品。 ７．３．５．３　结果判定 待检样品无荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照结果正常者，可判定检测样品为阴性；待检样品 ＦＡＭ通道Ｃｔ≤３５，曲线有明显的荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照结果正常者，检测结果报告为 阳性；待检样品ＦＡＭ通道Ｃｔ值在３５～４０之间，重复检测一次，如果重复检测Ｃｔ值仍在３５～４０之间， 则判为阳性。 ８　结果报告 根据检测结果，报告乙型脑炎病毒核酸检测阳性或阴性。 ４ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ９　阳性结果处置 出现阳性结果的相应标本应送有资质的实验室做复检或鉴定。确定阳性结果后应立即向上级主管 部门报告。 ５ 犛犖／犜２７６７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 １１０２— ７６７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 国境口岸蚊类携带乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链式反应检测方法 ＳＮ／Ｔ２７６７—２０１１  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １１ 千字 ２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２０５０　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售