SNT 2772-2011 国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法
书书书
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
犛犖/犜2772—2011
国境口岸蚊媒中日本脑炎
病毒快速检测方法
犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犳狉狅犿
犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋
20110225发布 20110701实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管...
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
犛犖/犜2772—2011
国境口岸蚊媒中日本脑炎
病毒快速检测方法
犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犳狉狅犿
犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋
20110225发布 20110701实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
书书书
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:胡孔新、王汉华、杨鹏飞、平芮巾、孙肖红、杨宇、王静、张乐。
Ⅰ
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国境口岸蚊媒中日本脑炎
病毒快速检测方法
1 范围
本标准
了国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法,包括样本抗原和核酸快速检验鉴定方
法及检测结果的分析与判读。
本标准适用于对国境口岸蚊类携带的日本脑炎病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T1552 国境口岸生物因子恐怖事件监测规程
SN/T2300—2009 国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
WS214 流行性乙型脑炎诊断标准及处理原则
WS233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(卫生部,2006年1月11日)
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
日本脑炎 犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊
由日本脑炎病毒引起、由蚊传播的中枢神经系统急性传染病,也称流行性乙型脑炎。临床上以突然
起病,高热、头痛、呕吐、嗜睡或昏迷、惊厥为特征。
4 检测对象
入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等藏匿和捕获的及口岸区域捕获的蚊虫。
5 实验室生物安全要求
实验室生物安全要求按照GB19489、WS233和SN/T1552执行。
6 样本采集、处理与转运
样本采集、处理与转运参见 WS214、SN/T2300—2009中第7章和附录B以及可感染人类的高致
病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定执行。
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7 胶体金免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原
7.1 主要仪器
7.1.1 生物安全柜。
7.1.2 可调式微量加样器及塑料尖吸头。
7.1.3 液氮运输罐、液氮储存罐。
7.1.4 普通冰箱、超低温冰箱(-80℃)。
7.1.5 玻璃研磨器、研磨棒。
7.2 主要试剂及其制备
7.2.1 25狀犿胶体金的制备
取100mL双蒸水,加热至沸腾。加入1mL新鲜制备的1%的氯金酸溶液加速搅拌,同时加入新
配置的1%的柠檬酸钠溶液1.5mL,加热20min直到溶液变成酒红色后冷却,4℃避光保存。
7.2.2 免疫层析试纸制备
7.2.2.1 兔抗日本脑炎病毒NS1蛋白多克隆抗体标记结束的胶体金溶液以pH为8.2的0.01mol/L
Tris溶液(含1%BSA,5%蔗糖)重悬,浸湿结合垫后37℃干燥2h。
7.2.2.2 以浓度为2mg/mL的日本脑炎全病毒鼠免疫多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检
测带。
7.2.2.3 以浓度为1mg/mL的羊抗兔IgG在硝酸纤维素膜上划线作为质控线,参数0.1μL/mm划
线,检测线与质控线间距离约为7mm。
7.2.2.4 将吸收垫、样品垫及处理后的结合垫、硝酸纤维素膜叠加,组装成完整的层析条,然后切割层
析条,宽度每条4mm,干燥避光保存待用。
7.2.3 狆犎为8.2的0.01犿狅犾/犔犜狉犻狊溶液
50mL的0.1mol/LTris溶液与22.9mL的0.1mol/L盐酸混匀后,加双蒸水稀释至100mL,混
匀后将上述溶液与双蒸水按1∶4稀释即为pH8.2的0.01mol/L的Tris溶液。
7.2.4 狆犎为8.0的5犿犿狅犾/犔犘犅溶液
称取磷酸二氢钠27.8g加双蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液;称取磷酸
氢二钠(Na2HPO4·7H2O)53.6g加双蒸水至1000mL溶解即为0.2mol/L磷酸氢二钠溶液。取
0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL,取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液94.7mL混匀后加双蒸水按
1∶19稀释即可。
7.2.5 样本处理液
pH为8.0含1%NP40的5mmol/LPB溶液。
7.3 检测步骤
7.3.1 将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。
7.3.2 液氮研磨蚊媒组织成粉末状后加适量(50只批次可加入1mL)的pH为8.0的5mmol/LPB
液重悬,混匀后于4℃,8000犵离心5min,取上清液,即为蚊媒悬液。
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7.3.3 取蚊媒组织悬液400μL,用滴管或加样器滴加样本处理液400μL,混匀后从试管中取2滴~
3滴或80μL~100μL样品滴加于样品孔内。
7.3.4 结果应在15min内观察,阳性结果最早1min~2min即可显示出来,但阴性结果应在15min
后才可判定。
7.4 结果判断
7.4.1 当层析观测窗“C”(对照)处未出现条状红色沉淀线,则无论层析观测窗“T”(检测)处是否有显
示均为无效,应重新检测。
7.4.2 当层析观测窗只有“C”(对照)处出现1条红色沉淀线,而“T”(检测)处无红色沉淀线,报告为
检测结果阴性,即没有检出日本脑炎病毒抗原。
7.4.3 当层析观测窗“C”(对照)处和“T”(检测)处出现2条红色沉淀线,报告为检测结果阳性,即检出
日本脑炎病毒抗原。
7.4.4 结果示意见图1。
犪) 阳性 犫) 阴性
犮) 无效 犱) 无效
图1 免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原的结果示意图
8 日本脑炎病毒核酸反转录聚合酶链反应(犚犜犘犆犚)检测
8.1 主要仪器
8.1.1 PCR扩增仪。
8.1.2 低温高速台式离心机。
8.1.3 电泳仪及电泳槽等。
8.1.4 凝胶成像分析系统仪或紫外投射仪。
8.1.5 微型混合器、涡旋振荡器。
8.1.6 可调式微量加样器及塑料尖吸头。
8.1.7 恒温水浴箱。
8.1.8 生物安全柜。
8.1.9 超净工作台。
8.1.10 高压灭菌锅。
8.2 主要试剂
除另有规定外,所有试剂均采用分析纯。
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8.2.1 核酸提取试剂:用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸1)。
8.2.2 反转录试剂:用美国promega公司的A3500反转录试剂盒SuperScriptTM Ⅱ ReverseTran
scriptaseSystems2)。
8.2.3 PCR扩增试剂:用美国promega公司的 M5661核酸扩增试剂盒GoTaq? HotStartCoLorLess
MasterMix3)。
1)、2)、3) 为美国公司提供产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。
如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。
8.2.4 DNALadder(100bp~2000bp)或类似范围的商品化DNAmarker。
8.2.5 RTPCR检测的引物见表1。
表1 日本脑炎病毒检测的犘犆犚引物
引物 序列(5’~3’) 位置 片段
随机六聚休
JS31F
JS31R
NNNNNN
AGAGCGGGGAAAAAGGTCAT
TTTCACGCTCTTTCTACAGT
—
57395758
59005881
162bp
8.3 检测步骤
8.3.1 核酸提取
8.3.1.1 吸取140μL样本处理液加入溶解的裂解液AVL。
8.3.1.2 脉冲混匀15s,置于室温10min。
8.3.1.3 短暂离心,加入560μL无水乙醇(96%~100%)脉冲混匀15s。
8.3.1.4 短暂离心。
8.3.1.5 将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。从步骤8.3.1.3中吸取630μL溶液转移至旋转柱
上,6000犵离心1min,将旋转柱放至干净的收集管上,丢弃包含过滤液的收集管。
8.3.1.6 打开旋转柱盖,重复步骤8.3.1.5。
8.3.1.7 打开旋转柱盖,加入500μL洗液AW1,盖紧盖子,6000犵离心1min。将旋转柱放至干净的
收集管上,丢弃包含过滤液的收集管。
8.3.1.8 打开旋转柱盖,加入500μL洗液AW2,盖紧盖子,20000犵离心3min。将旋转柱放至干净
的收集管上,20000犵再离心1min。将旋转柱放至干净的1.5mL离心管上,丢弃包含过滤液的收
集管。
8.3.1.9 打开旋转柱盖,加入60μL室温平衡的缓冲液AVE。
8.3.1.10 盖紧盖子,室温放置1min。
8.3.1.11 6000犵离心1min。
8.3.1.12 收集滤出液,用于RTPCR扩增。-70℃储存RNA。
8.3.2 犚犜犘犆犚检测
8.3.2.1 反转录:取上述总RNA5μL放入PCR管中,加入2μL随机六聚体引物(10pmol/μL),
70℃变性5min后迅速放入冰浴中退火杂交,然后依次加入2μL4×dNTPs、4μL的10mmol/L
AMV逆转录酶缓冲液、0.5μLRNasin、1μLMgCl2(25mmol/L)、1μLAMV逆转录酶,无RNA酶的
DEPC水补足20μL。将以上混合体系混合,42℃作用45min,72℃10min灭活。
8.3.2.2 扩增反应体系:取5μL上述合成的cDNA为
,依次加入25μLMasterMix、上游和下游
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引物(见表1)各2μL、0.5μL犜犪狇DNA聚合酶,以无RNA酶的DEPC水补足50μL的反应体系,稍加
离心后,放入PCR扩增仪。
8.3.2.3 扩增反应条件:94℃预变性1min然后进入循环94℃30s;50℃30s;72℃2min,共30个
循环,最后72℃,延伸10min。
8.3.3 凝胶电泳
PCR扩增产物,经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,用凝胶成像系统照相记录结果。
8.4 结果判定
8.4.1 质量控制
反应结果同时符合以下两个条件,否则实验结果无效:
———阴性对照未出现特异性条带;
———阳性对照出现预期162bp大小的扩增条带。
8.4.2 结果分析
在实验结果有效情况下,如待测样本出现预期162bp大小的扩增条带,则可初步判断待测样本为
日本脑炎病毒NS3基因阳性;如待检样本扩增产物在162bp处没有出现条带,则可初步判断待测样本
为日本脑炎病毒NS3基因阴性。
8.4.3 测序(可选择)
切下目的条带,用凝胶回收试剂盒回收(按其说明书进行),自动测序仪测序,确认病毒基因,也可进
一步分析病毒基因的变异情况。
9 阳性结果的处理
对阳性结果的相应标本应送相关的实验室进行进一步复检和鉴定。阳性结果应按规定向上级主管
部门报告。
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1102—
2772
犜/
犖犛
中华人民共和国出入境检验检疫
行 业 标 准
国境口岸蚊媒中日本脑炎
病毒快速检测方法
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中 国 标 准 出 版 社 出 版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码:100045
网址 www.spc.net.cn
电话:68523946 68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
开本 880×1230 1/16 印张 0.75 字数 11 千字
2011年6月第一版 2011年6月第一次印刷
印数1—1600
书号:155066·222054 定价 16.00 元
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