SNT 2774-2011 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２７７４—２０１１ 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片 检测 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犫狔狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋 ２０１１０２２５发布 ２０１１０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：王静、孙肖红、杨宇、杨永莉、胡孔新、文海燕。 Ⅰ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片 检测方法 １　范围 本标准规定了国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片检测方法，包括样品 处理、检测方法、结果判定及报告。 本标准适用于国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的实验室检验。 ２　性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部，２００６年） ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 鼠疫耶尔森菌　犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊 鼠疫菌为耶尔森菌属由假结核菌进化而来的新生病原体，革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的 球杆菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。 ３．２ 鼠疫耶尔森菌犉１抗原　犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犉１犪狀狋犻犵犲狀 Ｆ１抗原是鼠疫菌的荚膜抗原，是鼠疫菌于３７℃条件下在细胞壁外形成的一层厚凝胶状荚膜，是鼠 疫菌主要的保护性抗原。人或动物感染鼠疫菌后，Ｆ１抗原在体内高度表达，具有明显抗吞噬和活化补 体的作用。鼠疫菌Ｆ１抗原具有抗原性强、特异性高等特点，检测Ｆ１抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要 依据，也是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一。 ３．３ 蛋白悬浮芯片　狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔 利用带编码的包覆荧光发色剂的微球为载体标定目标抗原或抗体，以报告分子（如：荧光染料）标记 目标抗原或抗体，流式细胞仪作为检测平台，可以对抗原或抗体等生物分子进行大规模检测的一种生物 芯片技术。 ４　仪器设备 悬浮芯片系统１）、微孔滤板抽滤器、真空气泵、恒温振荡器、生物安全柜、离心机、荧光显微镜、超声 波清洗器、恒温培养箱、纯水机、漩涡混合仪、血球计数板。 １）　Ｌｕｍｉｎｅｘ１００／２００或等效设备。 １ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５　主要试剂与耗材 ５．１　试剂 生物素标记试剂盒：ＢｉｏｔｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＳＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）２）或等效试剂盒，微球交联试剂盒：ＡｍｉｎｅＣｏｕ ｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）３）或等效试剂盒，悬浮芯片仪校准试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）４）或等 效试剂盒，悬浮芯片仪校验试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＶａｌｉｄａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）５）或等效试剂盒６），兔抗鼠疫菌Ｆ１ 抗原抗体（或等效抗体），鼠疫Ｆ１抗原单抗２Ｆ６（或等效抗体），藻红蛋白标记链霉亲和素（ＳＡＰＥ），１（３ 二甲氨基丙基）３乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ），牛血清白蛋白（ＢＳＡ），犖羟基硫代琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ），鸡ＩｇＧ，兔抗鸡ＩｇＧ，羊抗兔ＩｇＧ，吐温２０。 其他所需缓冲溶液配制及要求参见附录Ａ。 ２）、３）、４）、５）、６）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其 他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ５．２　耗材 羧基化编码微球、９６孔滤板、消毒液：１０％的次氯酸钠溶液（含有效氯＞１０％）、悬浮芯片仪样品流 路鞘液。 ６　抗体包被编码微球和生物素标记抗体 ６．１　活化编码微球 ６．１．１　取１００μＬ编码微球到１．５ｍＬ离心管中，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。 ６．１．２　加入１００μＬ的微球清洗缓冲液悬浮，振荡３０ｓ，超声３０ｓ，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液 并弃去。 ６．１．３　加入１００μＬ的微球活化缓冲液，然后先加入１０μＬ新鲜配制的ＥＤＣ工作液，再加入１０μＬ新鲜 配制的ＳｕｌｆｏＮＨＳ工作液，高速振荡３０ｓ后用铝箔包裹，在室温１８℃～２５℃振摇２０ｍｉｎ。 ６．１．４　加入１５０μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），振荡１０ｓ后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。 ６．１．５　重复６．１．４步骤一次。 ６．１．６　加入１００μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４）悬浮编码微球，中速振荡３０ｓ后，超声１５ｓ。 ６．２　抗体包被编码微球 ６．２．１　取溶于０．０３ｍｏｌ／ＬＰＢ缓冲液（ｐＨ７．２）兔抗Ｆ１抗体１２μｇ加入到活化后的编码微球中，用 ＰＢＳ（ｐＨ７．４）定容至５００μＬ，铝箔包裹在室温１８℃～２５℃振摇２ｈ。然后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸 出上清液并弃去。 ６．２．２　加入５００μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），振荡混匀，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。 ６．２．３　加入２５０μＬ微球封闭缓冲液悬浮编码微球，中速振荡１５ｓ，用铝箔包裹，在室温１８℃～２５℃振 摇３０ｍｉｎ，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。 ６．２．４　加入５００μＬ微球保存液洗涤编码微球，１６０００犵离心６ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。 ６．２．５　用１５０μＬ的微球保存液悬浮编码微球，于０℃～４℃避光保存备用，有效期１年。 ６．３　包被微球的计数 吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（０．１０ｍｍ；１／４００ｍｍ２）在显微镜下计数，计算见式（１）： ２ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 微球数量＝４个大格平均数×１０４×稀释倍数×体积（ｍＬ） ………………（１） 　　微球数量。包被微球是否成功见Ｂ．１。 ６．４　生物素标记抗体 ６．４．１　将生物素从冰箱取出，平衡至室温１８℃～２５℃。 ６．４．２　分别配制浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ生物素溶液（超纯水配制）和２ｍｇ／ｍＬ单抗２Ｆ６溶液（ＰＢＳ配制）。 ６．４．３　按照每１ｍＬ单抗２Ｆ６溶液加入２７μＬ生物素进行标记，室温１８℃～２５℃振摇３０ｍｉｎ（或冰上 ２ｈ），经 ＨｉＴｒａｐｄｅｓａｌｔｉｎｇ脱盐柱，－２０℃冻存备用有效期１年。 ６．４．４　生物素标记抗体是否成功参见Ｂ．２。 ７　样品的悬浮芯片检测 ７．１　样品处理 将可疑样品按照０．１ｇ／ｍＬ加入样品稀释液中，在漩涡振荡器上振荡溶解后，将样品悬液１０００犵低 速离心４ｍｉｎ（或滤纸过滤），所得上清液（或滤液）可直接进行悬浮芯片分析检测。 ７．２　检测方法 ７．２．１　总则：采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在９６孔滤板上进行。 ７．２．２　用微球稀释液将包被好的微球（６．３）稀释至每微升７０个～１００个微球。 ７．２．３　以１００μＬ检测缓冲液润湿滤板，将滤板置于微孔滤板吸滤器，打开真空气泵气抽去所有液体进 行抽滤，再将滤板放在干净的纸巾上，完全吸去所有液体。 ７．２．４　每孔加入７．２．２的微球稀释液５０μＬ（含微球３５００个～５０００个），真空泵抽滤后，加入１００μＬ 微球清洗缓冲液洗涤并用真空泵抽滤，洗涤进行２次。 ７．２．５　每孔加入５０μＬ检测样品，并设空白对照３孔，混匀后２５℃避光振摇３０ｍｉｎ，真空泵抽滤后，加 入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并抽滤，洗涤进行３次。 ７．２．６　每孔加入５０μＬ生物素化单抗２Ｆ６溶液，混匀后２５℃避光振摇３０ｍｉｎ，真空泵抽滤后，加入 １００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。 ７．２．７　每孔加入５０μＬ检测缓冲液稀释的ＳＡＰＥ（含ＳＡＰＥ４ｎｇ），混匀后２５℃避光振摇１０ｍｉｎ，真空 泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。 ７．２．８　每孔加入１２５μＬ检测缓冲液，经振荡使微球重悬。 ７．２．９　用悬浮芯片系统读取 ＭＦＩ数值并分析数据。 注：每次用真空泵抽滤完后，用不同干净纸巾完全吸去液体，以避免交叉污染。 ８　结果判断 ８．１　犆狌狋狅犳犳值 ３个空白对照的检测均值与３倍标准差之和。其中，标准差由３个空白对照检测值计算得出。 ８．２　质量控制 反应结果应同时符合以下４个条件，否则实验结果无效： ａ）　ＢＳＡ包被微球作为阴性质控，检测荧光值低于Ｃｕｔｏｆｆ值； ｂ）　ＳＡＰＥ包被微球作为荧光质控，检测荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值（大于１００倍）； ３ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ｃ）　生物素化的ＢＳＡ包被微球作为偶联质控，检测荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值； ｄ）　鸡ＩｇＧ包被微球和生物素化兔抗鸡ＩｇＧ的组合作为抗体质控（反应过程质控），检测荧光值远 大于Ｃｕｔｏｆｆ值。 ８．３　结果分析及报告 ８．３．１　阳性 检测样品荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值（２倍以上），报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阳性。若检 测结果处于灰度区间（Ｃｕｔｏｆｆ值的１倍～２倍），应重做，若重做结果远大于Ｃｕｔｏｆｆ值，则报告为鼠疫 耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阳性；若检测结果仍处于灰度区间则报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检 测弱阳性，应使用其他方法进行验证。 ８．３．２　阴性 检测样品荧光值小于Ｃｕｔｏｆｆ值，报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阴性。 ９　生物安全防护 ９．１　根据《人间传染的病原微生物名录》的要求，本实验应在生物安全２级实验室中进行。 ９．２　做好个人防护。实验操作时穿戴防护设备，如手套、实验服、口罩。 ９．３　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。 ４ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （资料性附录） 试剂的配制 犃．１　０．０３犿狅犾／犔犘犅缓冲液（狆犎７．２） 用８００ｍＬ纯水溶解２．８３ｇ磷酸氢二钠，１．３６ｇ磷酸二氢钾，用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．２，加纯 水至１Ｌ。 犃．２　样品稀释液 ０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢ，ｐＨ７．２，用０．０３ｍｏｌ／ＬＰＢ缓冲液稀释而成。 犃．３　犘犅犛（狆犎７．４）缓冲液 氯化钠１３７ｍｍｏｌ／Ｌ；氯化钾２．７ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸氢二钠１０ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸二氢钾２ｍｍｏｌ／Ｌ。用 ８００ｍＬ纯水溶解８ｇ氯化钠，０．２ｇ氯化钾，１．４４ｇ磷酸氢二钠和０．２４ｇ磷酸二氢钾。用盐酸调节溶液 的ｐＨ值至７．４，加纯水至１Ｌ。分装后在１２１℃高压蒸汽２０ｍｉｎ，或过滤除菌，保存于室温。 犃．４　微球清洗缓冲液 ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．０５％吐温２０。 犃．５　微球活化缓冲液１００犿犿狅犾／犔磷酸二氢钠 ３ｇ磷酸二氢钠，５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠１．５ｍＬ，定容于２５０ｍＬ，ｐＨ６．２。 犃．６　微球保存液 ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ，０．０２％吐温２０，０．０５％ Ａｚｉｄｅ，ｐＨ７．４。 犃．７　微球封闭液 ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，０．０５％ Ａｚｉｄｅ，ｐＨ７．４。 犃．８　检测缓冲液 ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ７．４。 犃．９　微球稀释液 ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ７．４。 ５ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犃．１０　犈犇犆工作液 ５０ｍｇ／ｍＬ，纯水配制（现配现用）。 犃．１１　犛狌犾犳狅犖犎犛工作液 ５０ｍｇ／ｍＬ，纯水配制（现用现配）。 犃．１２　水 本标准所使用水均为纯水机过滤后的去离子水。 ６ 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犅 （规范性附录） 实验过程的质控 犅．１　包被微球的质控 犅．１．１　用旋涡混合仪充分振荡包被好的微球，使微球均匀分散开来（避光储存在４℃）。 犅．１．２　用微球稀释液将包被好的微球稀释至每微升７０个～１００个微球。 犅．１．３　按１∶２５０稀释生物素标记抗原或抗体（与微球上包被的特异性结合）。 犅．１．４　以１００μＬ检测缓冲液润湿滤板，将滤板置于微孔滤板吸滤器，打开真空气泵气抽去所有液体进 行抽滤，再将板放在干净的纸巾上，完全吸去所有液体。 犅．１．５　每孔加入Ｂ．１．２的微球稀释液５０μＬ（含３５００个～５０００个微球），加入裸珠（没有包被的微球） ５０μＬ（含３５００个～５０００个微球）作为空白对照，用真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并 用真空泵抽滤，洗涤进行２次。 犅．１．６　每孔加入５０μＬＢ．１．３，混匀后２５℃避光振摇３０ｍｉｎ，用真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗 缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。 犅．１．７　每孔加入５０μＬ用检测缓冲液稀释的ＳＡＰＥ（含ＳＡＰＥ４ｎｇ），混匀后２５℃避光振摇１０ｍｉｎ，真 空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。 犅．１．８　每孔加入１２５μＬ检测缓冲液，经振荡使微球重悬。 犅．１．９　用悬浮芯片系统读取荧光强度 ＭＦＩ数值并分析数据。 犅．１．１０　结果判定：空白对照ＭＦＩ低于１００，包被微球ＭＦＩ大于２０００的可使用；若包被微球ＭＦＩ小于 ２０００，则说明包被不成功，应重新包被。 注：每次用真空泵抽滤完后，用不同干净纸巾完全吸去液体，以避免交叉污染。 犅．２　生物素化抗体的质控 犅．２．１　用抗原包被ＥＬＩＳＡ９６孔板每孔加入５０μＬ，４℃静止过夜。 犅．２．２　加入封闭液（含５％ＢＳＡ的ＰＢＳ溶液）２００μＬ／孔在３７℃封闭１ｈ。 犅．２．３　洗液（含０．５％吐温２０的ＰＢＳ溶液）３００μＬ／孔洗３次，拍干。 犅．２．４　加入生物素化的抗体，５０μＬ／孔，室温放置３０ｍｉｎ。 犅．２．５　洗液３００μＬ／孔洗３次，拍干。 犅．２．６　加入适量辣根酶标记链霉亲和素（ＳＡ／ＨＲＰ），５０μＬ／孔，室温放置３０ｍｉｎ。 犅．２．７　洗液３００μＬ／孔洗３次，拍干。 犅．２．８　加入ＴＭＢ显色液（可溶型单组分ＴＭＢ底物溶液）显色，５０μＬ／孔，室温放置１０ｍｉｎ。 犅．２．９　最后用２ｍｏｌ／Ｌ硫酸５０μＬ／孔终止反应。 犅．２．１０　结果判定： 犅．２．１０．１　用目测法，若阴性对照孔出现很淡蓝色，阳性孔颜色很深，则生物素化抗体可使用；否则，需 重新进行新一轮抗体的生物素化标记。 犅．２．１０．２　应用酶标仪测读Ａ４５０数值，临界值＝２．１×空白对照Ａ值（当空白对照平均Ａ值小于０．０５ 时，按０．０５计算；当空白对照平均Ａ值大于或等于０．０５时按实际值计算），若检测孔颜色很深，且Ａ值 大于临界值则生物素化抗体可使用；否则，需重新进行抗体的生物素化标记。 犛犖／犜２７７４—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 １１０２— ４７７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片 检测方法 ＳＮ／Ｔ２７７４—２０１１  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １４ 千字 ２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２０５６　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售