SNT 2777-2011 输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式RT-PCR检测方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２７７７—２０１１ 输入性啮齿动物携带流行性出血热 病毒的巢式犚犜犘犆犚检测方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊（犈犎犉犞） 犻狀犻犿狆狅狉狋犲犱狉狅犱犲狀狋狊—犕犲狋犺狅犱狅犳狀犲狊狋犲犱犚犜犘犆犚 ２０１１０２２５发布 ２０１１０７０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、胡群、吴薇、黄彤文、杨苹、王燕。 Ⅰ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 输入性啮齿动物携带流行性出血热 病毒的巢式犚犜犘犆犚检测方法 １　范围 本标准规定了国境口岸输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的生物安全要求、检测方法、结果的 报告、阳性结果处置。 本标准适用于出入境检验检疫机构对输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的检测，对口岸发现 的啮齿动物及食虫目动物中的普通鼩?、大麝鼩、臭鼩等检测流行性出血热病毒也可参照执行。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 　　啮齿动物　狉狅犱犲狀狋狊 哺乳纲中种类最多，分布最广的一类动物，包括啮齿目和兔形目。一般体型较小，数量多，繁殖快， 适应力强，其中多数可携带流行性出血热病毒。 ３．２ 　　输入性啮齿动物　犻犿狆狅狉狋犲犱狉狅犱犲狀狋狊 通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包携带入境的啮齿动物。 ３．３ 　　流行性出血热　犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉；犈犎犉 由啮齿动物携带的汉坦病毒引起的伴有肾综合征的一类出血热的综合名称，主要包括姬鼠型及家 鼠型流行性出血热及流行性肾病。 ３．４ 　　流行性出血热病毒　犲狆犻犱犲犿犻犮犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊；犈犎犉犞 属布尼亚病毒科，汉坦病毒属，是一组单股负链ＲＮＡ病毒，由大（Ｌ）、中（Ｍ）、小（Ｓ）３个片段组成， 分别编码病毒的ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ多聚酶（Ｌ）、外膜蛋白Ｇ１、Ｇ２和核衣壳蛋白（Ｎ），为流行性出血热 的病原体，常见有汉滩病毒型和汉城病毒型。 ４　生物安全要求 实验室操作应在生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ２或ＡＢＳＬ２）实验室中进行，实验完毕后对实验中所用物品 及实验台进行灭菌消毒，以保证实验室工作人员及实验室安全。 １ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５　巢式犚犜犘犆犚 ５．１　器材与试剂 ５．１．１　器材 ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、电子分析天平、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、超低温 冰箱（－８０℃）、组织研磨器、外排式生物安全柜、液氮罐、离心机和离心管、常温摇床、ＰＣＲ管、剪刀、镊子。 ５．１．２　试剂 ５．１．２．１　水 应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。用于ＰＣＲ（包括核酸抽提）时所用的水应是无ＲＮＡ酶的水。 ５．１．２．２　犜犪狇犇犖犃聚合酶 浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存。 ５．１．２．３　犃犕犞逆转录酶 浓度为１０Ｕ／μＬ，－２０℃保存。 ５．１．２．４　犚犖犪狊犲抑制剂（犚犖犪狊犻狀） －２０℃保存。 ５．１．２．５　犱犖犜犘 含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ和ｄＴＴＰ，浓度均为１０ｍｍｏｌ／Ｌ。 ５．１．２．６　２０μ犿狅犾／犔引物 ５．１．２．６．１　逆转录引物序列 ５’ＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣ３’ ５．１．２．６．２　通用外引物序列 ５’ＡＡＡＧＴＡＧＧＴＧＩＴＡＹＡＴＣＹＴＩＡＣＡＡＴＧＴＧＧ３’ ５’ＧＴＡＣＡＩＣＣＴＧＴＲＣＣＩＡＣＣＣＣ３’ ５．１．２．６．３　汉滩病毒引物序列 ５’ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＧＣ３’ ５’ＧＧＡＴＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣ３’ ５．１．２．６．４　汉城病毒引物序列 ５’ＧＴＧＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴ３’ ５’ＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＴＧＣＡＴＧ３’ ５．１．２．７　无水乙醇 分析纯，无ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶，使用前预冷到－２０℃。 ２ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．１．２．８　病毒标准株 流行性出血热病毒标准株（由浙江省疾病预防控制中心提供）１）。 ５．１．３　试剂配制 ５．１．３．１　变性液 双蒸水５８．６ｍＬ、异硫氰酸胍５０．０ｇ、０．７５ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠（ｐＨ７．０）１７．６ｍＬ、１０％Ｓａｒｃｏｓｙｌ ２６．４ｍＬ。　 ５．１．３．２　犇犈犘犆水 双蒸水加入焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）至终浓度０．０１％（体积分数），室温放置过夜后在１２０℃下高压 灭菌３０ｍｉｎ。 ５．１．３．３　５×犃犕犞逆转录缓冲液 ２５０×１０－３ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３），２５０×１０－３ｍｏｌ／Ｌ氯化钾，５０×１０－３ｍｏｌ／Ｌ氯化镁，２．５× １０－３ｍｏｌ／Ｌ亚精胺，５０×１０－３ｍｏｌ／ＬＤＴＴ。 ５．１．３．４　１０×犘犆犘扩增缓冲液 ＴｒｉｓＨＣｌ１０×１０－３ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．４）、氯化钾５０×１０－３ｍｏｌ／Ｌ、明胶１０μｇ。 ５．１．３．５　犜犅犈电泳缓冲液（５倍浓缩液） Ｔｒｉｓ５４．０ｇ、硼酸２７．５ｇ、ＥＤＴＡ２．９ｇ，加水至１０００ｍＬ，用５ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调到ｐＨ８．０。 ５．１．３．６　样品缓冲液 每１００ｍＬ溶液中含溴酚蓝０．２５ｇ，蔗糖４０ｇ。 ５．２　操作方法 ５．２．１　样品制备 在无菌操作下剖取新鲜肺组织，超低温－７０℃以下保存。 ５．２．２　犚犖犃抽提 取０．５ｇ肺片用液氮或在干冰上研磨，再加入１ｍＬ变性液，摇匀后无菌研磨，在０℃下放置 ３０ｍｉｎ。加入０．２ｍＬ三氯甲烷，振荡、摇匀１５ｓ，室温静置１０ｍｉｎ，４℃１６０００犵离心１５ｍｉｎ。吸上层 水相，加入到１．５ｍＬ的塑料离心管中，并加等体积的异丙醇混匀，－２０℃沉淀３０ｍｉｎ，４℃２００００犵离 心１０ｍｉｎ。弃上清液，取沉淀。用１ｍＬ７０％乙醇漂洗一次后，４℃２００００犵离心５ｍｉｎ，彻底弃上清 液，室温干燥１０ｍｉｎ，用３０μＬＤＥＰＣ水溶解，置－７０℃保存。也可用美国Ｑｉａｇｅｎ公司提供的Ｒｎｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ提取病毒核酸２）。 　　１）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ２）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ３ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．２．３　犮犇犖犃合成 ＰＣＲ反应管中顺序加入ＲＮＡ模板１０μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ的逆转录引物２μＬ，５×ＡＭＶ逆转录缓冲液 ４μＬ，１０Ｕ／μＬＡＭＶ 逆转录酶１μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ１μＬ，ＲＮａｓｅ抑制剂０．５μＬ，ＤＥＰＣ水 １．５μＬ，并轻轻混匀。４２℃逆转录１ｈ，７２℃加热１０ｍｉｎ，４℃保存备用。 ５．２．４　犘犆犚扩增犇犖犃 ５．２．４．１　第一步犘犆犚 ＰＣＲ反应管中顺序加入１０×ＰＣＲ扩增缓冲液５μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化镁３μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ｄＮＴＰ１μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ的通用外引物各１μＬ，５Ｕ／μＬ犜犪狇聚合酶０．５μＬ，ｃＤＮＡ模板５μＬ，无菌双蒸 水３３．５μＬ，用２０μＬ矿物油覆盖后置ＰＣＲ扩增仪进行扩增。 扩增条件为：９５℃预变性１０ｍｉｎ，９５℃１ｍｉｎ、５５℃１ｍｉｎ、７２℃４５ｓ扩增３０个循环，７２℃延 伸１０ｍｉｎ。 ５．２．４．２　第二步犘犆犚 ＰＣＲ反应管中顺序加入１０×ＰＣＲ扩增缓冲液５μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化镁３μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ｄＮＴＰ１μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ的汉滩病毒或汉城病毒引物各１μＬ，５Ｕ／μＬ、犜犪狇聚合酶０．５μＬ，第一步ＰＣＲ 扩增产物５μＬ，无菌双蒸水３３．５μＬ，用２０μＬ矿物油覆盖后置ＰＣＲ扩增仪进行扩增。扩增条件同第 一步ＰＣＲ反应。 ５．２．５　设立对照 在下列操作中应设立对照： ａ）　在样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照； ｂ）　流行性出血热病毒核酸或根据病毒核苷酸序列体外合成的ＲＮＡ片段均可作为阳性对照； ｃ）　取未染毒的实验室小白鼠鼠肺作为阴性对照； ｄ）　取等体积的水代替模板作为空白对照。 ５．２．６　琼脂糖凝胶电泳 扩增结束后，在１０μＬ样品中加入２μＬ样品缓冲液混匀，用含０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭的１．５％琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。 ５．２．７　结果判定 ５．２．７．１　阳性对照会出现一条ＤＮＡ片段带，阴性对照和空白对照没有该核酸带。ＤＮＡ片段带的位 置如下： ａ）　汉滩病毒核酸带在３８３ｂｐ位置； ｂ）　汉城病毒核酸带在２８７ｂｐ位置。 ５．２．７．２　对阳性检测结果，应重复试验，如仍为阳性则判为阳性。出现阳性结果的相应标本应送指定 的实验室做复检或鉴定。 ６　检测结果报告 ６．１　检测到汉滩病毒或汉城病毒特异性基因，分别报告为“检出流行性出血热病毒（汉滩病毒或汉城病 ４ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 毒）特异性基因（巢式ＲＴＰＣＲ法）”。 ６．２　未检测到汉滩病毒或汉城病毒特异性基因，报告为“未检出流行性出血热病毒特异性基因（巢式 ＲＴＰＣＲ法）”。 ７　阳性结果处置 阳性结果应通知送检部门，并立即向主管领导报告。阳性样本按ＧＢ１９４８９规定的生物安全要求 处置。 ５ 犛犖／犜２７７７—２０１１ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 １１０２ — ７７７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 输入性啮齿动物携带流行性出血热 病毒的巢式犚犜犘犆犚检测方法 ＳＮ／Ｔ２７７７—２０１１  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １１ 千字 ２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２００８　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售