null医学分子生物学医学分子生物学葛 盛 芳null基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy主讲人:葛盛芳第十九章
基因诊断
Genetic Diagnosis 第十九章
基因诊断
Genetic Diagnosis null课程内容
一、基因诊断的基本概念
1.分子诊断与基因诊断(DNA诊断)
2.基因诊断的基本
二、基因诊断的基本方式和方法
1.对疾病相关遗传标志的连锁分析
2.对疾病致病基因结构异常的直接诊断
三、基因诊断的应用
1.辅助遗传病的临床诊断
2.疾病易感性及患病风险预测
3.疗效
及用药指导
4.其他应用:法医个体认定、病原体诊断 null 特点
针对性强
特异性强
灵敏度高
适应性强一、基因诊断的概念和特点定义
利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法(基因探针、PCR等方法),直接检测基因结构及其
达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法,称为分子诊断。针对DNA的分子诊断称为DNA诊断或基因诊断。null基因变异致病类型内源基因的变异
基因结构突变
基因表达异常外源基因的入侵null基因突变的类型突变(mutation)是遗传物质中任何可检测的能遗传的改变,但不包括遗传重组。突变是可以传递给子细胞,甚至延续给后代,从而导致产生了突变细胞或个体。对于一个多细胞生物来说,如果突变仅发生在体细胞中,那么这种突变是不会传递给后代的。这种类型的突变称为体细胞突变(somatic mutation)。但若突变发生在的生殖细胞中,那么这种突变就能通过配子传递给下一代,在后代个体的体细胞和生殖细胞中产生同样的突变,这种突变就叫做种系突变(germ-lime mutations)。由于遗传物质一般是DNA,突变会影响到DNA的化学或物理的构成,它的复制,表型功能或者一个或多个碱基对序列会发生改变,例如增加、减少或置换碱基,颠倒顺序或转移到新的位置上。
null突变可以是自发的,但也可被某些诱变剂(mutagen)诱发。一些物理因素或化学试剂都能增加这种自发突变的频率。而诱变剂处理所诱发的突变称为诱发突变(induced mutation),自然发生的突变是自发突变(spontaneous mutatiow)。
本书列出以下几种基因突变类型:
(1)大片段DNA的缺失、插入或重排
(2)移码突变
(3)点突变
(4)三核苷酸重复单位膨胀基因突变的类型nullDNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。错配null镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基正常成人Hb (HbA)β亚基null 缺失、插入和框移缺失:一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入:原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 缺失或插入都可导致框移(移码)突变 。null缺失引起框移突变null大片段DNA的缺失、插入或重排DNA分子内较大片段的交换,称为重组或重排。例如philadelphia染色体(9号染色体的末端和22号染色体相连接)。
缺失:例如ą-地中海贫血和杜氏肌营养不良症等患者的相关基因均发生较大片断的缺失。
插入:某些甲型血友病患者的凝血因子VIII的基因中插入的DNA长2-4kb。
nullDMD基因外显子缺失的检测DMD基因外显子缺失的检测杜氏肌营养不良症null由基因重排引起的两种地中海贫血基因型目 录null0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析null三核苷酸重复单位膨胀在亨廷顿舞蹈病、强直性肌萎缩症等患者的相关基因非表达区或外显子中,某种三核苷酸重复单位的重复次数增加了几倍或几十倍。二、基因诊断的基本流程二、基因诊断的基本流程1.待测样品的获得
2.基因及其表达产物结构或含量的特异性分析
3.基因诊断的基本技术流程。 二、基因诊断的基本流程二、基因诊断的基本流程1.待测样品的获得
获得样品的方式随着分析技术的不同而变化
原位杂交:需要组织或细胞样品。
Southern:DNA样品。
Northern:RNA样品。
PCR:DNA样品。
RtPCR: RNA样品。二、基因诊断的基本流程二、基因诊断的基本流程2.基因及其表达产物结构或含量的特异性分析
分子诊断中,确定DNA中是否存在某一特定序
列的最基本的方法,就是核酸分子杂交:
Southern杂交、Northern杂交、点杂交、等位
基因特异性寡聚核苷酸分子杂交、原位杂交和
DNA芯片技术等。
PCR技术、DNA测序
其他DNA结构分析方法。二、基因诊断的基本流程二、基因诊断的基本流程3.基因诊断的基本技术流程。
样品收集
DNA RNA cDNA
PCR扩增 引物
分子杂交 探针
杂交信号检测 三、基因诊断常用技术方法三、基因诊断常用技术方法 基因诊断可通过Southern印迹或者聚合酶链反应(PCR)方法等直接检测基因突变。如果某些疾病的相关基因还不清楚或尚未克隆,难于进行直接检测,可利用基因多肽性连锁分析(RFLP)间接检测。1.对疾病相关遗传标志的连锁分析1.对疾病相关遗传标志的连锁分析连锁是指同一条染色体上位置相邻的基因,常
被一起遗传而没有发生重组。
连锁分析:利用与致病基因相连的某些基因,
作为遗传标志,通过鉴定遗传标志的存在而判
断个体是非带有致病基因的方法。
连锁分析没有直接检测致病基因的突变,是间
接诊断方法。nullDNA多态性的标记经历3代第一代多态性标记是RFLP(限制性内切酶片断长度多态性),即DNA多态性涉及某些限制性内切酶的识别位点是否存在,以至产生不同长度的DNA片断,可利用Southern印迹法或PCR产物酶切的方法检测。
第二代多态性标记是STR(short tandem repeart,短串联重复),即短重复序列多态性,是目前最有价值的遗传标记,可通过PCR检测。
第三代多态性标记是SNP(单核苷酸多态性),是指DNA序列中单一核苷酸(碱基)改变而产生的多态性,可通过测定PCR产物序列来检测。nullDNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 DNA多态性:是指在同种生物不同个体的基因组中经常存在的某些DNA序列变异,这些并不影响基因功能。人基因组中大约每100-200bp范围内就有一个多态位点,这些位点按照共显性方式遗传,特别是单一碱基改变产生的多态性位点的遗传非常稳定,可以用于连锁分析。
连锁是指一个基因(或一段DNA序列)与另一个基因在同一条染色体上相互靠近,两者同时遗传,因此前者可以作为后者的遗传标志。DNA多态性是连锁分析中使用最多的遗传标志,常用于基因诊断、疾病相关基因的定位、亲子鉴定等。null现代福尔摩斯——DNA指纹技术 现代福尔摩斯——DNA指纹技术 通过分子化学的方式将生物的遗传物质DNA(脱氧核糖核酸)形成图谱,就是该生物的DNA指纹。之所以称为“指纹”,是由于不同个体的图谱各不相同,具有排他性,就像人的指纹一样。
而人的一滴血、一根毛发、几个皮肤细胞等小样品,甚至是鼻黏膜,或者唾液,都可以用来进行DNA指纹分析。 法医学个体认定P309null×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析null0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析nullRLFP分析法nullPCR/单链构象多态性分析
(single strand conformation polymorphism, SSCP)
PCR产物变性后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,正常基因和变异基因的迁移位置不同,借此可分析确定致病基因的存在。 null正常人纯合突变杂合突变Leber 病患者 PCR/SSCP分析+﹣null 2.聚合酶链反应 (PCR)
3.基因测序
4.基因芯片 1.核酸分子杂交技术限制性内切酶谱分析法
DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析
等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO)对疾病致病基因结构异常的直接诊断null核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 分子杂交与印迹技术的原理null复性RNADNAnull(一)印迹技术
(二)探针技术 探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸,与固定在NC膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。
来源:通常是已经克隆在适当载体(如质粒)中的基因片断,或cDNA、人工合成的寡聚核苷酸 null 印迹技术的类别及应用(一)DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。(二)RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。(三)蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 null 其他
斑点印迹 (dot blotting)
原位杂交 (in situ hybridization)
DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)null三种印迹技术的比较nullSouthern印迹(杂交)法1975年英国人E. Southern建立,基本步骤为:
(1)DNA提取、经限制性内切酶酶切成若干片断
(2)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断
(3)DNA片断从凝胶转移并固定到硝酸纤维素膜(或者尼龙膜)上
(4)利用探针进行杂交
(5)反射自显影。null目 录null放射自显影照片目 录nullDNA点阵目 录聚 合 酶 链 反 应
Polymerase Chain Reaction聚 合 酶 链 反 应
Polymerase Chain ReactionPCR方法通过一对寡聚核苷酸引物,在嗜热的DNA聚合酶作用下扩增特定的DNA序列。
PCR通常可以扩增长度几百bp到2kb的DNA片断。
经过约30个循环以后,靶DNA的拷贝数一般可以扩增百万倍( 106倍、理论上108倍)null5Primer 15Primer 2 5 5Template DNA基本工作原理目 录null目 录null
DNA
特异性引物
耐热DNA聚合酶(Taq酶)
dNTPs(底物)
Mg2+
缓冲液 PCR体系基本组成成分引物是根据需要扩增的DNA序列(靶DNA)相对应的序列(3‘端)设计并合成的,两个引物(20bp左右)分别互补于模板DNA的两条链,方向相对。nullPCR的基本反应步骤变性
95˚C延伸
72˚C退火
Tm-5˚C30高温破坏DNA双螺旋结构,解离成单链。两个引物分别和
模板互补以模板链为模板,根据碱基配对原则,TaqDNA聚合酶从每个引物的3‘端开始合成一条新链。null(一)目的基因的克隆
(二)基因的体外突变
(三)DNA和RNA的微量分析
(四)DNA序列测定
(五)基因突变分析PCR的主要用途四、基因诊断的应用四、基因诊断的应用遗传疾病
肿瘤
感染性疾病,传染性流行病
判断个体疾病易感性
器官移植组织配型
法医学中个体识别、亲子鉴定第二十一章
基 因 治 疗
Gene Therapy第二十一章
基 因 治 疗
Gene Therapynull课程内容
一、基因治疗的策略和基本程序
1.基因治疗的策略
2.基因治疗的一般程序
3.基因治疗中基因导入的方法
二、基因治疗中的病毒载体
1.逆转录病毒载体
2.腺病毒载体
3.腺相关病毒载体
三、基因治疗的临床应用
1.恶性肿瘤
2.心血管性疾病
3.遗传性疾病
4.艾滋病 世界上第一个获准上市的肿瘤基因治疗产品世界上第一个获准上市的肿瘤基因治疗产品 2003年10月,深圳赛百诺公司自主研制开发的基因治疗产品“重组人p53腺病毒注射液”(今又生,Gendicine)成功地取得了国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的新药证书、生产批文和药品GMP证书,成为世界上第一个获准上市的基因治疗产品。上海三维生物技术有限公司 上海三维生物技术有限公司 公司主要发展H100系列生物基因工程腺病毒用于肿瘤治疗,已成功开发三个具有自主知识产权的基因工程腺病毒治疗肿瘤的药物:H101、H102、和H103。H101(基因工程腺病毒注射液)是具有中国专利的国家创新药物,目前已完成III期临床试验,获得新药证书。H103(溶瘤性重组腺病毒注射液)是具有国际专利和中国专利的国家创新药物,已进入I期临床试验阶段。H102具有国际专利和中国专利的国家创新药物,正处在临床前研究阶段。 一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念
1、基因治疗的定义:
从基因角度:
对缺陷的基因进行修复
将正常有功能的基因置换(针对遗传病)
增补缺陷基因null从治疗角度
导入基因以改变患者细胞的基因表达
导入基因:
缺陷基因相对应的有功能的同源基因
缺陷基因无关的治疗基因
对于癌症(多因素疾病),可导入抑制或杀伤肿瘤细胞(或激活肿瘤免疫反应)的外源基因。null定义
早期是指用正常的基因整合入细胞基因组,以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病目的的方法。总结:基因治疗的概念对于疾病进行基因治疗,需要在分子水平对发病机制有所了解,掌握有效的基因转移技术,导入的基因能够在靶细胞中稳定存在和适当表达,并且所使用的方法无害无毒。null1990年9月14日,美国国立卫生研究院进行了第一例人类基因治疗的临床实验。患者患有重度联合免疫缺陷症(SCID,单基因病)的4岁女孩。他们将正常的腺苷脱氨酶(ADA)基因利用反转录病毒载体导入患者淋巴细胞,体外扩增后回输病人体内。此次实验结果令人满意,大大推动了临床基因治疗的发展。null联合免疫缺陷症的病因null腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的
严重联合免疫缺陷(SCID)腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的
严重联合免疫缺陷(SCID)病因:
淋巴细胞缺乏ADA酶
腺苷、dATP堆积
破坏免疫功能
患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的
(1990.9.14,NIH)治疗策略:
淋巴细胞ADA酶
恢复至正常水平的
5%-10%
维持免疫系统功能
改善病人症状遗传性单基因疾病治疗基本步骤:治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体
导入患者淋巴细胞
体外扩增
回输病人体内
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%
维持免疫系统功能,改善病人症状
null基因治疗的基本方法(策略)
基因矫正、基因置换、基因增补、
基因失活 、其他(“自杀基因”、基因疫苗、溶瘤性病毒等) 反义核酸技术
核酶技术
三链技术
干扰RNA技术几种常见的基因失活技术null(1)替换性基因治疗:导入正常基因,通过同源重组在原位替换有缺陷的基因(理想但难实现)
(2)补偿性基因治疗:导入正常基因并表达,以补赏体内有缺陷基因表达不足。目前已用于腺苷脱氧酶(ADA)缺陷症、乙型血友病等体细胞基因治疗。
(3)调控性基因治疗:导入外源基因,目的是抑制或者激活体内基因表达,例如导入p53治疗肺癌、白血病等癌症。
(4)导入人工合成的寡聚核苷酸,作为反义核酸抑制转录模板DNA(或翻译模板mRNA),或作为核酶降解mRNA,或作为siRNA引发RNA干扰(RNAi)使靶mRNA降解。几种常见的基因策略null基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因回输体内病毒载体
非病毒载体体细胞
生殖细胞间接体内疗法
直接体内疗法 基因治疗的两种形式 基因治疗的两种形式体细胞基因治疗
将外源基因导入患者的体细胞,以达到治疗的目的。
种系基因治疗
将外源基因导入患者的生殖细胞(精子、卵、受精卵)并整合在受体细胞的基因组中,以校正遗传缺陷。只限于某一体细胞的基因的改变
只限于某个体的当代
对缺陷的生殖细胞进行矫正
当代及子代伦理道德上的原因,生殖细胞基因治疗在全世界是受到严格禁止的。体细胞基因转移的途径体细胞基因转移的途径体外导入(ex vivo)又称回体基因转移
体外将基因导入体细胞内
再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内
使这种带外源基因的细胞在体内表达
达到治疗或预防的目的null回体基因转移的主要步骤:
(1)采集并培养体细胞
(2)将目的基因转移到体细胞
(3)筛选和增值转基因的体细胞
(4)将这些体细胞回输到自体靶器官
已用于体细胞基因转移进行基因治疗的组织细胞有:骨髓细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、上皮细胞等。但有的组织的细胞很难在体外培养并进行有效的基因转移。null体内导入(in vivo)又称体内基因转移
外源基因直接导入体内有关的组织细胞
使其进入相应的细胞
并表达
皮肤、肌肉、肝脏、血液、肺等均可作为靶组织。null体内基因转移导入目的基因表达载体的方式主要有:
(1)裸DNA溶解后直接注射
(2)脂质体或基因枪法
(3)利用包装细胞产生复制缺陷型的重组病毒颗粒。基因转移的方法
(1)转染:转染在广义上的定义是指将动物的DNA或RNA,蛋白质以及大分子转送进入活体细胞中。 包括:磷酸钙、电穿孔、基因枪、脂质体法、受体介导的细胞内吞等等。
(2)微注射:利用显微注射法将DNA导入细胞,适合于生殖细胞基因治疗。
(3)病毒载体:利用经过改造的逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒载体等作为外源基因的载体。治疗的基因的选择治疗的基因的选择目前临床试验的治疗基因:
合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA
目的基因的cDNA的获得
cDNA文库中目的基因的克隆
人工合成基因片段
PCR法筛选扩增目的基因
载体系统--运送基因的工具 载体系统--运送基因的工具病毒载体
非病毒载体逆转录病毒载体
腺病毒
腺相关病毒
其他
脂质体
裸DNA
null基因治疗中的病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体是在Moloney鼠白血病病毒(M-MuLV)的原病毒DNA基础上加以改造并插入质粒后构建的,删除了病毒复制所必需的基因(病毒逆转录酶、被膜蛋白、核心蛋白的基因),保留病毒LTR和病毒包装必须的序列,以便插入外源基因和药物筛选基因。这种载体在普通细胞中不能产生病毒颗粒,只能转染特殊的包装细胞才能产生重组病毒颗粒,因为包装细胞的基因组中包含逆转录病毒的基因(删除了病毒包装必需的序列)。利用包装细胞产生重组病毒颗粒,再感染靶细胞或组织,可以达到基因转移的目的。
逆转录病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体的优点:基因转移的效率高,靶细胞范围广,DNA整合率高
逆转录病毒载体的缺点:容量小(8kb以下),只能感染处于分裂状态的细胞,目的基因在未分化细胞中容易丢失,并且随机整合,有激活癌基因或者导致基因突变的危险。
null逆转录病毒的生活周期
进入宿主细胞 双链RNA
逆转录酶
双链DNA前病毒
整合到宿主细胞基因组DNA中
宿主细胞RNA聚合酶II
mRNA
病毒RNA基因组 作为合成相应
病毒蛋白质的模板
包装成新的病毒颗粒,离开宿主
逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体LTRgagpolenvφLTR长末端
重复序列调节和
启动转录包装信号目的基因标记基因nullLTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系LTRLTR靶细胞目的基因标记基因LTRφLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒
(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒腺病毒腺病毒腺病毒腺病毒13% DNA 87% Protein NO LIPIDX优点: 靶细胞范围广(细胞不需要处于分裂状态) 易获得高滴度重组体 表达效率高 不整合入宿主基因组,比较安全 缺点:
免疫原性强 ,容易被体内免疫系统中和而失活 目的基因表达时间短(不能整合)
外源基因容量较小(7kb以下)null腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(野生型):通常特异地整合在人染色体单一位点(19q13.4-ter),插入的外源基因可以持续表达,重组后随机整合的危险比逆转录病毒载体小。这种病毒的基因组长度只有4.7kb,仅仅能够插入3.5kb以下的基因。
单纯疱疹病毒载体和痘病毒载体可以携带长达20-30kb的外源基因,两者均没有整合能力。null三、基因治疗的应用与展望应用展望20多个国家开展,主要涉及:遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因
精密调控外源基因在人体内的表达
体细胞移植和重建的生物学研究
减少外源基因对机体的不利影响总体效果不理想,受试者极少治愈null癌症不但可防而且可治,一度被人们视为‘绝症’的癌症,目前已成为可被控制的慢性病,医学界已研制出不少治疗癌症的创新靶向药物和治疗方案。实对于普通人而言,未来会有越来越多的癌症也许就像糖尿病一样,肿瘤减缓增长速度或缩小体积,使患者的病情在较长一段时间内保持稳定,仅仅是一种普通的慢性病而已。只要加强预防,及早发现,及早治疗,再加上越‘瞄’越准的新药,癌症并没有那么可怕。预防、早诊、早治,使癌症已不再是“绝症”! 癌症是慢性病