生物技术制药重点

1. 生物药物：泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次极代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品 2. 生物制品：用基因工程、细胞工程、发酵工程等生物学技术制成的免疫制剂或有生物活性的制剂。可用于疾病的预防、诊断和治疗 3. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品 4. 生物技术药物： 采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质（包括治疗性抗体等）或核酸类药物 5. 单克隆抗体：将抗体产生细胞（淋巴细胞）与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，所以称为单克隆抗体 6. 接触抑制：大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长繁殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时（即细胞与周围细胞接触时），细胞就停止增殖 7. 组织培养或细胞培养是将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长 8. 细胞工程:以细胞为单位，（按人们的意志）应用生物学、分子生物学等理论和技术，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品 9. 细胞特化:动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，为了适应各自的功能，细胞特化成不同的形态 10. 发酵工程又成为微生物工程，是利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术 11. 人工模拟酶:又称为人工酶或模拟酶，是根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物 12. 固定化酶：限制或固定于特定空间位置的酶，即经物理化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 13. 固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法 14. 植物组织和细胞培养：指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官的生长以及控制其生长发育的技术 15. 悬浮培养：在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体（细胞团）的培养（在此培养条件下，组织化水平较低） 16. 细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化（目的是为了得到单细胞无性繁殖系） 17. 分生组织培养：又称生长锥培养，在人工培养基上培养茎端分生组织细胞 18. 外植体： 用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养 19. 器官形成：是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根之后，再形成锥管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株 20. 无性繁殖：又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代 21. 突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞 22. 继代培养： 由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养 第一章 绪论 1.生物技术发展的三阶段的特点及代产物： 1） 传统生物技术阶段（酿造技术） 主要产品：乳酸、酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶 技术特点：过程简单，大多数属于兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构 简单，属于初级代谢产物 2） 近代生物技术阶段 主要产品：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、 啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染 特点：（1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体） （2）生物技术要求高，纯种、无菌、通气、产品质量要求也高 （3）生产设备规模大 （4）技术发展速度快 三）现代生物技术 （重组DNA技术，基因技术） 2.缩写形式：白细胞介素（IL）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、生长素（HGH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）/促红细胞生长素（EPO) 第2章 生 物 药 物 概 论 1. 生物药物的特性 1） 药理学特性 （1）治疗的针对性强（2)药理活性高（3）毒副作用小营养价值高（4）生理副作用时有发生 二）生产、制备中的特殊性 （1）原料中的有效物质含量低（2）稳定性差（3）易腐败（4）注射用药有特殊要求 三）检验上的特殊性 由于生物药物具有生理功能，因此生物药物不仅要做普通的理化检验，更要进行相应的生物活性检验 2.蛋白质类药物分离提取方法 ①沉淀法（盐析、有机溶剂、等电点） ②按分子大小分离（超滤、透析、层析、离心） ③按所带电荷不同分离（离子交换、层析、电泳、等电聚焦） ④亲和层析法（酶与底物、抗原与抗体、激素与受体） 3.人体来源的药物的特点 (1.)安全性好 不易产生副反应 (2.)效价高、疗效可靠 ；质量好、效价高 (3.)稳定性好 冻干制剂10度以下可保存2年以上。 4.动物来源药物的特点 (1).具有生物药物的共性(2).原料来源丰富3.)安全性和有效性还有待进一步研究 5.白细胞浓缩液生产干扰素的重要原料 第三章 基因工程制药 1.基因工程药物生产的主要程序 ①目的基因的分离与克隆（目的基因来源于人体或病原体） ②构建DNA重组体（通常将目的基因与质粒DNA整合，组建重组质粒） ③将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 ④工程菌的发酵（在工程菌的发酵培养过程中，目的基因同时表达） ⑤外源基因表达产物的分离纯化（用生物技术及化学、化学方法） ⑥成品的检验 及包装等 2. 原核、真核表达宿主各自的特点 原核细胞 1）大肠杆菌特点：①产物多为胞内产物（因为大肠杆菌的表达产物不存在信号肽） ②真核蛋白质常以不溶性包含体的形式存在（故下游处理过程必须经过复 杂的变性和复性等工艺才能恢复其生理活性） ③蛋白质产物不能糖基化（因为大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用） ④目的蛋白的N-端常带有一个多余的Met残基，易引起免疫反应 ⑤有时会产生很难除去的内毒素（阴性杆菌的细胞壁成分） ⑥有时会产生蛋白酶破坏目的蛋白 2） 枯草芽孢杆菌特点：①分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中 ②不形成包含体 ③不能使蛋白质产物糖基化 ④有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解 3） 链霉菌特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具 有糖基化能力 真核细胞 1） 酵母特点 ①繁殖迅速②基因工程操作简单（可以廉价地大规模培养，没有毒性） ③能将表达产物直接分泌到胞外④表达产物能糖基化 2） 丝状真菌（如霉菌）特点 ①有很强的蛋白质分泌功能 ②能正确进行翻译后加工（包括肽剪切和糖基化等） ③糖基化方式与高等真核生物相似 ④为无毒安全菌株 哺乳动物细胞特点： ①产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易 ②表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物 ③动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀 3. 目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母的原因 （1）对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式（2）许多外源基因在这两种宿主菌中得到表达成功 4表达型载体：在cDNA插入位置的上游具有启动子序列，重组后插入的cDNA能够表达，并经转录和翻译合成相应蛋白质的载体 非表达型载体：在cDNA插入位置的上游无启动子序列，重组后插入的cDNA不能表达，不能经转录和翻译合成相应蛋白质的载体 严紧反应：在高拷贝质粒工程菌中，由于质粒复制和外源基因的转录、翻译消耗了大量前体物和催化结构，造成蛋白质合成过程中，因前体物和氨基酰-tRNA的不足使核糖体在密码子上停留，并合成“魔点”ppGpp现象 5. 基因工程菌不稳定性有分裂不稳定和结构不稳定 ①分裂不稳定：是指工程菌分裂增殖时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象 ②质粒结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失或突变，或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 质粒的不稳定通常表现为分裂不稳定，主要与两个因素有关①含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；②这两种菌的比生长速率差异的大小 引起质粒不稳定的原因 （1）对于含低拷贝质粒的工程菌，若工程菌的比生长速率较快，则容易产生不含质粒的子代菌（此时可通过降低工程菌的生长速率或增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性） （2）含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质 粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌（因而对这类工程菌而言，进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，对质粒的稳定性不利） 6.提高质粒稳定性的方法 1.两阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达 2.选择性压力（如抗生素等）：通过向培养基中加入“压力”，抑制质粒丢失菌的生长 3.间歇供氧法 4.改变稀释速率法 7.两阶段培养法与两步培养法 两阶段连续培养法：Ⅰ阶段：阻遏外源基因的表达，增加工程菌的生物量 Ⅱ阶段：消除阻遏子的阻遏作用，诱导外源基因高效表达. 两步培养法：第一步使用适合细胞生长的培养基，营养丰富 第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源 8.磷低浓度时影响菌体生长，高浓度时外源基因不表达 温度T=30℃时，目的物表达量最高；T较低时，影响菌体生长，不利于目的产物的表达；T较高（37℃）时，由于细菌的热休克系统被激活，大量蛋白酶被诱导，易使表达产物降解 细胞生长的最佳pH6.8-7.4，而外源基因表达时的最佳pH6.0-6.5 9..分离纯化技术应满足的要求：①技术条件要温和 ②选择性好 ③收率要高 ④各种技术能直接衔接 ⑤整个分离纯化过程要快 第四章 抗 体 制 药 1.抗体产生机制： 抗原物质-- -刺激---机体免疫系统---激活---B淋巴细胞---分化增值---浆细胞---分泌---球蛋白 2.单克隆抗体改造的必要性和方向 必要性：①单克隆抗体均是鼠源性抗体，直接应用于人体易产生人抗鼠免疫反应 ②完整抗体分子的相对分子量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效的 治 疗浓度 方向：①降低单克隆抗体的免疫原性 ②降低单克隆抗体的相对分子量 3.杂交瘤细胞的选择必要性与培养原理 必要性：经细胞融合后，得到脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞，这些细胞的增殖速度比杂交瘤细胞更快，并很快将其淘汰，故必须选择性培养，筛选出杂交瘤细胞 原理：为获得目的细胞，需将融合后的细胞立即转入选择 性培养基中，常用HAT培养基,是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶（T）配成。氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞由于“功能互补”则可以存活 4. McAb的制备过程 5.鼠源性鼠源性单克隆抗体的改造的必要性和目的 必要性：用于人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用 目的：①降低免疫原性②降低相对分子量，增加组织穿透能力 6.基因工程抗体类型及基本结构和特点 （1）人-鼠嵌合抗体：保持了McAb与抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降 （2）改形抗体（又称CDR移植抗体）：具有鼠源性单克隆抗体与抗原结合的特异性；但抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性 （3）Fab片段与FV抗体：Fab片段由完整的轻链和重链的可变区加部分恒定区； Fv抗体：由重链和轻链的可变区组成 (4)单链抗体：由VH链和VL链的CDR通过一段连接肽连接而成的重组蛋白 (5)单域抗体与最小识别单位（MRU）：单链抗体由H链或L链的单个CDR区组成；分子量只有原抗体；表面疏水性强，与抗原的非特异性结合能力较强 最小识别单位：由互补决定区构成；也具有与抗原结合的能力，但亲和力极低 7. 靶向药物（或药物导弹）的作用机理： 把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内；不影响正常细胞、组织或器官的功能,而提高疗效、减少毒副作用；其特异性好，稳定性强，渗透性好，免疫原性低，可大量制备 肿瘤靶向治疗：利用具有一定特异性的载体,药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位 举例：抗癌药物偶联的抗体药物单独使用，肿瘤组织的药物浓度不能保证，且对正常体细胞有杀伤作用；以人血清白蛋白为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞毒性提高2倍肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR），这种耐药性是受基因调控的，其编码的P糖蛋白可将进入肿瘤细胞的抗癌药物 泵出细胞外，使肿瘤细胞内的药物浓度降低而产生耐药性 将P糖蛋白抗体与抗肿瘤药物偶联制成抗体药物， P糖蛋白抗体虽无杀伤肿瘤的作用，但可与P糖蛋白结合，调节抗癌药物的运转系统，增加细胞内药物浓度，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用 第5章 动物细胞制药 1.动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小 2.离体细胞的类型及代表细胞 （1）.贴壁细胞：如心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、皮肤细胞、肠管上 皮细胞 （2）.悬浮细胞：如淋巴细胞等。 （3）.兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞 .3.动物细胞作为宿主生产药物的优、缺点 优点：产物多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰 后与天然产物更一致，适合于临床应用 缺点：培养周期长、条件要求高、成本高、产量低 第六章 植物细胞制药 1.磷：低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低 铜作为邻及对-二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次级代谢产物累计的必要元素，还可作为非生物诱导子 .2.毛状根和冠瘿瘤培养 （1）毛状根培养：利用发根农杆菌的转化作用进行次级代谢产物的生产，极具发展前途，其生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。 特点：①激素自养；②次级代谢产物含量高且稳定；③增殖速度快 （2）冠瘿组织培养：有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎轴中合成，利用冠瘿组织培养易于得到这些物质，冠瘿组织的获得，是由根瘤农杆菌感染植物组织，质粒转化后获得冠瘿瘤，经过除菌后，从冠瘿瘤培养获得的 特点：激素自养、增殖速度快 第七章 酶工程制药 1.固定化酶的特点： ①可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高 ②反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品 质量高 ③反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制 ④酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少 ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应 2.固定化细胞的特点： （1）无需进行酶的分离纯化（2）细胞保持酶的原始状态，固定化工程中酶的回收率高 （3）固定化酶比细胞内酶稳定性高（4）细胞内酶的辅因子可自动再生 （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应（6）抗污染能力强 3.采用固定化培养的先决条件：细胞的代谢产物必须分泌到细胞外。但大多数植物的次级代谢产物是存在于胞内或胞液中，故在固定化培养中，可通过加入表面活性剂或其他改变细胞通透性的方法，使代谢产物分泌到培养基中 4.人工模拟酶:又称为人工酶或模拟酶，是根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物 人工模拟酶的特点: 结构简单，具有高效和高适应性的特点 如 丝氨酸蛋白水解酶的模拟酶能同时结合两分子底物分子在合成的聚乙烯亚胺上引入十二烷基和咪唑基，形成的芳香硫酸酯酶比天然酶活力高100倍 5.利用现代生物技术改造传统制药工业 ①抗生素：可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌 的生物量，或得到新的杂合抗生素 ②氨基酸：利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨 基酸产量 ③维生素：构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如Vit C） ④疫苗：利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生产 疫苗，产量高、工艺简单、操作安全 6.提高抗生素产量 ( 1)将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株 （2）增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数 （3）通过调节基因的作用（增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法） （4）增加抗性基因（抗性基因经常与生物合成基因连锁，是激活生物合成基因进行转录的必需成分） 7.若在菌体内导入血红蛋白基因，提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力，从而提高细胞对溶氧的利用率 � EMBED \* MERGEFORMAT ��� _1234567890.unknown