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A型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用

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A型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用 ·论 著· A 型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用 王 斌1,张忠兵1!,顾晓红2,陆月良 (1 . 第二军医大学长征医院消化内科,上海2 ;2 . 上海市杨浦区中心医院消化内科,上海2 9 ; . 第二军医大学基础 医学部细胞生物学教研室,上海2 4 ) [摘要] 目的:研究A 型肉毒毒素(BTA)对犬下食管括约肌(LES)的作用机制,为临床BTA 治疗贲门失弛缓症提供实验依 据。方法:在胃镜下对BTA 组(1 条犬)LES 分4 点注射BTA,对照组(1 条犬)注射生理盐水,分别于注射前、注射后1...
A型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用
·论 著· A 型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用 王 斌1,张忠兵1!,顾晓红2,陆月良 (1 . 第二军医大学长征医院消化内科,上海2 ;2 . 上海市杨浦区中心医院消化内科,上海2 9 ; . 第二军医大学基础 医学部细胞生物学教研室,上海2 4 ) [摘要] 目的:研究A 型肉毒毒素(BTA)对犬下食管括约肌(LES)的作用机制,为临床BTA 治疗贲门失弛缓症提供实验依 据。方法:在胃镜下对BTA 组(1 条犬)LES 分4 点注射BTA,对照组(1 条犬)注射生理盐水,分别于注射前、注射后1 周测 定LES 的压力,同时测定LES 中Ach 的含量和AchE 活性,并观察AchE 阳性神经末梢和Ach 囊泡的超微结构。结果:注射 BTA后1 周BTA 组LES 压力、Ach 含量和AchE 活性均显著低于对照组(!" . 1);在光镜下发现,运动终板色泽变淡,数目 减少;在电镜下发现,神经末梢内含Ach 的囊泡明显减少,末梢内AchE 阳性反应物也明显减少。结论:犬LES 局部注射 BTA 后,可引起LES 压力明显下降,这可能是由于BTA 破坏或抑制局部胆碱能神经末梢运动终板中的囊泡,导致局部Ach 含 量和AchE 活性明显降低而引起。 [关键词] A 型肉毒毒素;下食管括约肌;乙酰胆碱;乙酰胆碱酯酶;贲门失驰缓症 [中图分类号] R 57 .7 [文献标识码] A [文章编号] 258-879X(2 )12-1 25- Effect of botuli numtoxin- A on lower esophageal sphincter in dogs WANGBin1,ZHANG Zhong- Bi ng1!,Gu Xiao- Hong2,Lu Yue- Liang (1 . depart ment of Gastroenterology,ChangZheng Hospital , Second Military Medical university,Shanghai 2 ,China;2 . depart ment of Gastroenterology,Central Hospital of Yangpu dis- trict ,Shanghai 2 9 ; . depart ment of Cell Biology,College of Basic Medical Sciences,Second Military Medical university,Shang- hai 2 4 ) [ABSTRACT] Objective:To investi gate t he eff ect of botuli numtoxi n- A(BTA)on lower esophageal sphi nctor(LES)i n dogs,pro- vi di ng scientific base f or treati ng achalasia wit h BTA.Methods:BTA was endoscopically i nj ected i nto t he LESin 1 dogs,and sali ne i nj ection was taken as control group(1 dogs).LES pressure was measured before and after i nj ection .Contents of Ach and activity of AchE were deter mined i n LESsamples .By means of karnovsky- Roots techniCue,ultrastructure of nerve ter minal and vesicles contai n- i ng Ach were studied under li ght and transmission electronic microscopy .Results:LES pressure obviously decreased i n BTA-treated dogs after i nj ection(!" . 1). Contents of LES Ach and AchE activity i n BTA-treated dogs remarkably decreased compared wit h t hose of control group(!" . 1).The colour of motor end plate f ai nted away and their number decreased;t he vesicles contai ni ng Ach and AchE-positi ve reactant were reduced disti nctly i n t he nerve ter minal .Conclusion:BTAsignificantly decreases LESpressure,possi- bly by distroyi ng or i nhibiti ng the vesicles of t he choli nergic nerve ter minal ,leadi ng to the decrease of Ach and AchE activity . [KEY WORDS] botuli numtoxi n- A;lower esophageal sphi ncter ;acetylcholi ne;acetylcholi nesterase;achalasia [Acad J Sec Mil Med univ,2 ,24(12):1 25-1 27] # 贲门失弛缓症是一种食管运动障碍性疾病,以 食管缺乏蠕动和下食管括约肌(lower esophageal sphi ncter ,LES)松弛不良为特征。关于贲门失弛缓 症的治疗方法,目前国外已采用A 型肉毒毒素(bo- t uli numtoxi n- A,BTA)局部注射 LES,它能明显缓 解症状,改善生活质量,且没有明显不良反应。BT 是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,能与神经肌肉接头 处胆碱能神经末梢快速而强烈的结合,阻断神经冲 动的传导而使骨骼肌麻痹。本实验拟研究BTA 对 LES 的作用机制,为临床BTA 治疗贲门失弛缓症提 供实验依据。 1 材料和方法 1 .1 材料 杂种家犬2 条(体质量8!1 kg,雌雄 均可,第二军医大学实验动物中心提供);CF-97 型 多功能胃肠动力测压系统(第二军医大学长征医院 消化内科- 复旦大学生物医学工程研究所研制); BTA(兰州生物制品研究所生产,1 u/瓶);AchE ·52 1· 第 二 军 医 大 学 学 报 Acad J Sec Mil Med univ 2 dec ;24(12) #[基金项目] 上海市科学技术发展基金资助项目 (994119 52). [作者简介] 王 斌(197 - ),男(汉族),硕士,主治医师. 现 在上海市杨浦区中心医院消化科,上海2 9 . E- mail :woaiZhongguotudi "sina .com !Corresponding author .E- mail :ZhongbinZ"yahoo .com 试剂盒(美国Sigma 公司)。 1 .2 BTA 注射 健康杂种犬随机分成BTA 组和 对照组,每组各10 条。用3 %戊巴比妥钠30 mg/kg 肌内注射麻醉,左侧卧位,置口垫并固定头部,插入 胃镜,认准LES 部位,BTA 组采用BTA(用龙胆紫 混合,以注明注射部位)垂直黏膜面4 点(3、6、9、12 点位)注射,每点注射1 ml(12 .5 U/ml ),对照组注 射相同容量的生理盐水。术后进食洁净半流食物。 1 .3 LES 压力测定 注射前及注射后1 周分别测 定LES 压力。测压前禁食12!16 h,按1 .2 方法进 行麻醉后,从口腔插入测压管,在胃镜下观察确保其 进入胃内,再逐步调整测压管,使其测孔位于LES 压力最高处。测压管与CF-97 型多功能胃肠动力 测压系统相连,压力曲线在计算机上,由计算机 分析。 1 .4 Ach 含量和AchE 活性的测定 注射后1 周 将两组犬处死,取注射部位LES 组织1 .5 cm> 1 .5 cm,立即投入液氮中保存。部分组织以0 .2 mol/L pBS 液(pH8 .0)作匀浆介质,按30 mg/100 ml ,用 匀浆器研磨成匀浆,放置4 C 30 mi n,4 000 r/min 离心10 mi n,取上清液,采用碱性羟胺比色法测定 Ach 含量;部分组织按10 % 浓度,用匀浆器研磨成 匀浆,4 C 5 000 r/min 离心30 mi n,取上清液,按试 剂盒说明书要求测定AchE 活性。 1 .5 光、电镜标本制作及观察 取LES 组织,成束 状切开,用1 .5 %戊二醛固定1 h,放置4 C,加微波 固定5 s 后,在解剖显微镜下分离肌纤维。分离后 的肌纤维按Karnovsky- Roots 法[1]配制孵育液,为排 除非特异性着色,将BTA 组和对照组的标本分别分 为A、B 两组:A 组为实验组,用加底物(碘化乙酰硫 代胆碱)的孵育液在4 C冰箱孵育1 h;B 组为对照 组,用未加底物的孵育液。标本漂洗后在相差显微 镜下观察,A 组肌纤维中能找到AchE 阳性的运动 终板,为淡黄色。再将A 组中找到的运动终板切割 下来,在光镜下观察神经末梢运动终板的变化。上 述标本漂洗后用锇酸后固定2 h,经乙醇逐级脱水, 用环氧树脂包埋。定位后做超薄切片,厚度约60 nm,用铀铅双重染色后在日立 H-800 电镜下观察 AchE 阳性神经末梢和含Ach 的囊泡的超微结构。 上述观察结果摄片保存。 1 .6 统计学处理 所有计量资料以!! "示。 进行方差分析和#检验。 ! 结 果 2 .1 BTA 对犬LES 压力的影响 实验前BTA 组 LES 压力为(3 .75 0 .47)kpa,对照组为(3 .80 0 . 37)kpa,无明显差异;注射BTA 后,BTA 组LES 压 力为(1 . 32 0 . 14 )kpa,与实验前及对照组的 (3 .58 0 .27)kpa 相比差异非常显著($"0 .01 ), 而对照组实验前后无统计学差异。 2 .2 BTA 对LES 中Ach 含量和AchE 活性的影响 BTA 组Ach 含量为(75 .48 4 .67)"g/mg,与对 照组的(93 .03 4 .65)"g/mg 相比有非常显著差异 ($"0 . 01 );BTA 组 AchE 活性为(38 . 20 2 .17)U/mg,与对照组的(69 .88 6 .73)U/mg 相 比有非常显著差异($"0 .01) 2 .3 光镜及电镜观察结果 光镜下,对照组在每个 肌细胞间见到大量稍有隆起的椭圆形、呈深褐色的 神经末端运动终板;BTA 组在大片肌纤维中只能找 到少数几只颜色很淡的运动终板,数量明显减少。 电镜下,对照组神经末梢突触胞质内容丰富,突触小 泡清晰。AchE 阳性反应产物沉积在突触前后膜,均 无扩散现象,在突触后膜呈连线分布,并延伸至后膜 折叠处。突触前膜及神经膜细胞的胞膜呈粗颗粒状 致密分布,突触小泡内含大量基质较深的线粒体和 微泡结构(图1A)。另外,在肌纤维间隙神经纤维的 胞膜也见反应物,呈线状分布(图1B)。BTA 组神 经末梢突触胞质内容空虚,突触小泡明显减少。囊 泡内线粒体肿胀,严重者呈空泡状,甚至崩解。突触 前膜及后膜折叠间隙稍见增宽,后膜下偶见同心样 板层小体形成。BTA 组突触前后膜未见线状反应 物而呈弥散现象(图1C)。肌纤维间隙神经纤维的 胞膜反应物也呈弥散现象(图1D)。 " 讨 论 贲门失驰缓症病因不明,目前多认为其属于神 经源性疾病。由于调节LES 的抑制性神经,尤其是 含NOS 的神经元受损,使抑制性神经递质 NO 减 少,造成持续性Ach 释放,引起LES 的兴奋性占优 势,导致LES 的痉挛、压力增高,出现一系列临床表 现,如吞咽困难、返食、夜间呛咳、胸痛、体质量下降 等。pasricha 等[2]用BTA 局部注射治疗贲门失迟 缓症患者,取得满意疗效。以后在国外的临床研究 中证明,在贲门失迟缓症患者LES 内注射BTA 可 明显降低LES 压力,83 .7 %的患者临床症状得到缓 解,50 岁以上者对BT 治疗反应较好,疗效维持时间 平均15 .6 个月[3]。我科从1998 年3 月至1999 年 2 月对24 例贲门失迟缓症患者LES 内注射BTA 治 疗,取得满意疗效[4]。 BT 是梭状芽胞杆菌属肉毒杆菌在厌氧环境中 产生的一种大分子蛋白神经毒素,目前已将BT分 ·6231· 第二军医大学学报 2003 年12 月,第24 卷 图1 电镜下神经末梢纤维 Fig 1 Nerve ter minal and nerve fiber under electron microscope in control and BTA-treated group A:Nerve ter minal of control group . AchE-positi ve reactants deposit i n t he membrane of presynapse and postsynapse,Which have no diff usi ng phe- nomenon and have li near distri bution .Synaptic cytoplast is ample and synaptic vesicles is clear(> 10 000);B:Nerve ter minal of BTA-treated group . Linear reactant does not exist i n t he membrane of synapse,Which have diff usi ng phenomenon .Synaptic cytoplast is sli mand synaptic vesicles reduce dis- ti nctly(> 10 000);C:Nerve fi ber of control group . AchE-positi ve reactant deposits i n t he membrane of nerve fi ber ,Which have li near distri bution(> 5 000);D:Nerve fi ber of BTA-treated group . AchE-positi ve reactants have diff usi ng phenomenon(> 9 000) 为A、B、C1、C2、D、E、F 和G 8 个抗原型,各型具有 相似的结构和分子量,其中BTA 毒力强、稳定,易于 生产、提纯和精制,因而被应用于实验研究和临床。 BTA 选择性地作用于外周胆碱能神经末梢,抑制刺 激性及自发性Ach 的量子性释放。此外,局部注射 BTA能使之固定在动物体的神经末梢和其他组织 的结合点,仅少许毒素进入循环系统被清除,因此无 全身及中枢神经系统不良反应的可能。在本实验光 镜下发现,对照组肌纤维中有大量运动终板存在,而 BTA 组中运动终板明显减少,说明BTA 直接破坏 了运动终板。在电镜下也发现,BTA 组神经末梢内 突触胞质内容空虚,突触小泡明显减少,囊泡内线粒 体肿胀,严重者呈空泡状,甚至崩解。本研究结果表 明,BTA 通过破坏或抑制LES 神经末梢Ach 的释 放,诱导LES 松弛,从而减轻贲门失迟缓症的症状。 AchE 是Ach 的水解酶,两者常共存于神经末 梢中,互相依存,因此通过对AchE 显色,可以显示 Ach 的定位。另外,AchE 活性增强则代表Ach 释放 增加,胆碱能神经兴奋性增高。因此,AchE 的组织 化学特性可作为胆碱能运动神经元的代谢和形态变 化的相对特异性指标。Ellies 等[5,6]在大鼠下颌腺、 腮腺内注射BTA,然后取出注射的腺体,用免疫组 化染色方法测定AchE 浓度,结果发现注射BTA 的 局部AchE 浓度比空白组和注射生理盐水组明显降 低。在本实验中发现,AchE 活性降低至原来的 55 %;在光镜下发现,运动终板色泽和数量减少;在 电镜下,AchE 阳性反应物分布弥散,且分布数量也 明显减少。这可能是BTA 引起神经末梢释放Ach 的量减少,由于生理性内环境稳定机制的存在,局部 AchE 水平降低以减少Ach 的降解;也可能是BTA 不但抑制Ach 释放,也能抑制AchE 活性及功能,其 机制尚需进一步研究。 另外,在电镜下也发现,BTA 组神经细胞内存 在同心样板层小体结构。这种结构代表神经细胞发 生了髓样改变,神经元产生变性。但由于在本实验 中这种现象只发现1 例,难以判断是否系BTA 直接 损伤所致,这一点尚需进一步积累资料加以研究。 [参 考 文 献] [1] 宋可钦,王 彦.显示胆碱酯酶的Karnovsky- Roots 法的改进及 其结合染色[J].解剖学杂志,1985,(4):357-359 . [2] Pasricha PJ,Rai R,Ravich WJ,et al .Botuli numtoxin f or achalasi- a:long-ter moutcome and predictors of response[J].Gastroentero- logy ,1996,110(5):1410-1415 . [3] D’Onofrio V,Miletto P,Leandro G,et al .Long-ter mfolloW-up of achalasia patients treated Wit h botuli num toxin[J ]. Dig Lioer Dis ,2002,34(2):105-110 . [4] 张忠兵,朱 粱,张兴荣,等.肉毒杆菌毒素局部注射治疗贲门 失弛缓症24 例分析[J].第二军医大学学报,1999,20(3):175 . Zhang ZB,Zhu L,Zhang XR,et al .Treat ment of botuli n local i n- j ection in 24 patients Wit h achalasia[J]. Di-er Junyi Daoue xue- bao(Acad J sec mil med unio ),1999,20(3):175 . [5] Ellies M,LaskaWi R,Got W,et al . i mmunohistochemical and morphometric i nvestigations of t he influence of botuli numtoxin on the submandibular gland of t he rat[J ]. Eur Arch Otorhino- laryngol ,1999,256(3):148-152 . [6] Ellies M,LaskaWi R,Tor mahlen G,et al .The eff ect of local i nj ec- tion of botuli numtoxin Aon the paroti d gland of t he rat :An i m- munohistochemical and morphometric study[J ].J Oral maoillo- fac surg ,2000,58(11):1251-1256 . [收稿日期] 2003-04-07 [修回日期] 2003-09-20 [本文编辑] 曹 静 ·7231·第12 期. 王 斌,等.A 型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用 A型肉毒毒素对犬下食管括约肌的作用 作者: 王斌, 张忠兵, 顾晓红, 陆月良 作者单位: 王斌(上海市杨浦区中心医院消化科,上海,200093), 张忠兵(第二军医大学长征医院消化内 科,上海,200003), 顾晓红(上海市杨浦区中心医院消化内科,上海,200093), 陆月良(第二 军医大学基础医学部细胞生物学教研室,上海,200433) 刊名: 第二军医大学学报 英文刊名: ACADEMIC JOURNAL OF SECOND MILITARY MEDICAL UNIVERSITY 年,卷(期): 2003,24(12) 被引用次数: 3次 参考文献(6条) 1.Ellies M;Laskawi R;Tormahlen G The effect of local injection of botulinum toxin A on the parotid gland of the rat:An immunohistochemical and morphometric study[外文期刊] 2000(11) 2.Ellies M;Laskawi R;Gotz W Immunohistochemical and morphometric investigations of the influence of botulinum toxin on the submandibular gland of the rat[外文期刊] 1999(03) 3.张忠兵;朱粱;张兴荣 肉毒杆菌毒素局部注射治疗贲门失弛缓症24例分析[期刊论文]-第二军医大学学报 1999(03) 4.D'Onofrio V;Miletto P;Leandro G Long-term follow-up of achalasia patients treated with botulinum toxin[外文期刊] 2002(02) 5.Pasricha PJ;Rai R;Ravich WJ Botulinum toxin for achalasia:long-term outcome and predictors of response[外文期刊] 1996(05) 6.宋可钦;王彦 显示胆碱酯酶的Karnovsky-Roots法的改进及其结合染色 1985(04) 引证文献(3条) 1.刘文徽.刘庆森.韩辉.吴本俨 A型肉毒毒素对大鼠胃排空及血浆胃动素、血清瘦素的影响[期刊论文]-世界华人消 化杂志 2008(16) 2.王冬滨 贲门失弛缓症经胸手术治疗体会[期刊论文]-海南医学 2007(2) 3.韩辉 腹腔注射A型肉毒毒素对大鼠肠道功能及胃肠激素的影响[学位论文]硕士 2005 本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_dejydxxb200312015.aspx
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