SNT 1698-2010 伪狂犬病检疫技术规范

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 !" ! #!"#$ " %&!& 代替 !" ! #$%&' " ())% 伪狂犬病检疫规范 $ %&'&()*(+ , '-)-.-/0-'1% 2 +345 6 # 37*3+&3+ %&!&8!!8&! 发布 %&!!8&'8&! 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前 !! 言 !! 本标准按照 !" ! #$%$ " &''( 给出的规则起草# 本标准代替了 )* ! #$+(, " &''+ $猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程%# 本标准与 )* ! #$+(, " &''+ 相比&主要技术变化如下' """本标准中第 - 章引用了 !" ! #$,+-$ " &''& $伪狂犬病诊断技术%中第 . 章的内容( """修改采用了 !" ! #$,+-$ " &''& $伪狂犬病诊断技术%中第 & ) - ) / 章的内容( """本标准中第 / 章代替了$猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程%* )* ! #$+(, " &''+ +# 本标准修改采用 012 $陆生动物诊断试验与疫苗%* &'', +中第 &%$%& 章制定&修改了病毒分离) 345 )血清中和试验的操作规程&增加了兔体接种试验)鉴别诊断 261)7 )乳胶凝集试验)免疫荧光 试验的操作规程# 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口# 本标准起草单位'中华人民共和国深圳出入境检验检疫局)中华人民共和国广东出入境检验检疫 局)中华人民共和国江苏出入境检验检疫局# 本标准主要起草人'吕建强)卢体康)花群义)林志雄)张常印)姜焱)秦智锋)曹琛福)张彩虹)陶虹) 阮周曦)田纯见# 本标准所代替标准的历次版本发布情况为' """ )* ! #$+(, " &''+ # ! !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 伪狂犬病检疫规范 ! ! 范围 本标准规定了伪狂犬病的病毒分离鉴定)聚合酶链式反应)兔体接种试验)血清中和试验)酶联免疫 吸附试验)乳胶凝集试验及免疫荧光试验的检疫技术规范# 本标准适用于进出境猪)羊)牛)犬)猫及其他易感动物伪狂犬病的检疫和诊断# % ! 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文 件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本*包括所有的修改单+适用于本文件# !" ! #$,+-$ " &''& ! 伪狂犬病诊断技术 ' ! 病毒分离鉴定 '%! ! 试验材料及设备 8929 培养液)细胞生长液)细胞维持液配方见附录 7 &猪肾细胞系细胞* 3:;$< +或仓鼠肾细胞 * "=:&$ +)新生犊牛血清)青霉素)链霉素) '%&& " > 微孔滤膜)细胞培养瓶) ./? 恒温培养箱等# '%% ! 操作方法 '%%%! ! 样品采集 用于病毒分离的样品可以是活猪的口咽液)鼻液*拭子+或扁桃体活组织&或来源于死亡猪或现临 床症状猪的样本&其中脑和扁桃体样本是首选#对于潜伏感染的猪&三叉神经节是分离病毒最合适的 部位# 牛感染该病的特征通常是搔痒&可以采集脊索的相应部位作为样本# '%%%% ! 样品处理 在含抗生素*例如 &''1@ ! >6 青霉素和 $'' " A ! >6 链霉素+的细胞培养液或常规缓冲液中对以上 样品进行匀浆处理&样品与液体的比例为 $B< &反复冻融 . 次后 .'''C ! >DE 低速离心 $'>DE 获得上 清液&经 '%&& " > 微孔滤膜过滤&然后利用其接种任何对伪狂犬病毒敏感的细胞培养系统#如果不立 即接种细胞分离病毒&可以将其置于 F/'? 保存作为接种材料# '%%%' ! 接种细胞 分离该病毒常使用猪肾细胞系* 3:;$< +&接种前采用细胞生长液培养细胞&接种后使用的细胞维持 液应该含有抗生素&例如 &''1@ ! >6 青霉素和 $'' " A ! >6 链霉素# 将样品滤液接种到已长成单层的 3:;$< 细胞上&接种量为最终培养维持液的 $'G & ./? 恒温培养 箱中吸附 $H &然后加入 8929 培养维持液&置于 ./? 恒温培养箱中培养&逐日观察# $ !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 '%' ! 观察结果 通常伪狂犬病毒诱导产生的细胞病变效应* 432 +出现在接种后的 &-H # /&H 内&因此用于接种的 细胞培养物应维持 DE 离心 $'>DE &取上清液加入青霉素和 链霉素溶液&最终浓度分别为 &''1@ ! >6 和 $'' " A ! >6 &置 -? 冰箱中作用 $&H &作为待检样品# )%' ! 接种试验动物 将待检样品经颈部皮下注射接种&每只家兔接种 $>6 # &>6 # )%( ! 结果观察及判定 )%(%! ! 伪狂犬病毒感染阳性 被接种动物在接种后 &-H # -,H 注射部位出现奇痒&家兔啃咬注射局部&导致皮肤溃烂&家兔尖 叫)口吐白沫&最终死亡# )%(%% ! 伪狂犬病毒感染阴性 观察 DE &破坏血清中的补体# "%'%!%% ! 将未稀释的血清加入到 (+ 孔细胞培养板中&每份 . 孔&每孔 <' " 6 # "%'%!%' ! 每孔加入 <' " 6 含有 $''#418 <' ! <' " 6 *或 &'''#418 <' ! >6 +的伪狂犬病毒液&振荡后置于 ./? 二氧化碳培养箱中 $H # "%'%!%( ! 每孔加入 $<' " 6 细胞悬液&细胞浓度约为 $%6 &轻微振荡使细胞均匀分布在 孔的底部&然后置于 ./? 二氧化碳培养箱中*或密封细胞板后置于 ./? 恒温培养箱中+# "%'%!%) ! 每次检测应设置如下对照' W + ! 病毒对照'将 $''#418 <' ! <' " 6 的病毒液作 $B$ ) $B$' ) $B$'' ) $B$''' 的稀释&每个稀释 度的病毒液设 , 孔重复&每孔加 <' " 6 &在加入 <' " 6 培养液后置于 ./? 二氧化碳培养箱中 $H &以 +%.%$%- 的方式加入细胞悬液后培养( O + 细胞对照'至少作 & 孔重复&每孔加 $'' " 6 培养液及 $<' " 6 浓度约为 $<'''' 细胞! >6 的细 胞悬液( M + 阳性血清对照'使用已知伪狂犬病毒中和抗体滴度* # +的血清&作 -# ) &# ) # ) # ! & ) # ! - 五个稀 释度&每个稀释度至少作 & 孔重复&每孔 <' " 6 &以 +%.%$%. ) +%.%$%- 的方式分别加入病毒悬 液)细胞悬液后培养( I + 阴性血清对照'以 +%.%$%& ) +%.%$%. ) +%.%$%- 的方式操作( J + 被检血清对照'为了验证待检血清是否有细胞毒性作用而设立此对照&每份待检血清 <' " 6 & 加入 <' " 6 培养液后置于 ./? 二氧化碳培养箱中 $H &然后以 +%.%$%- 的方式加入细胞悬液 后培养# "%'%!%" ! 在试验后 -,H 和 /&H &分别利用倒置显微镜* $''V +观察 (+ 孔细胞培养板&检查细胞孔中是 否有毒性反应和 432 &只有如下对照结果成立才能判定待检样品的试验结果' W + 病毒对照'病毒悬液的滴度应该在 .'#418 <' ! <' " 6 # .''#418 <' ! <' " 6 之间( O + 细胞对照'细胞对照孔的细胞正常)无变化( M + 阳性血清对照'测得的血清抗体滴度应与预期滴度相当*波动在 $ 个滴度范围之内+( I + 阴性血清对照'没有 432 出现( J + 被检血清对照'被检血清的 432 检查应考虑其对细胞毒性作用的可能# "%'%!%* ! 待检血清的检测会出现如下结果' W + 在 .I 内& . 孔均出现 432 的&判为阴性( O + 在第 . 天& . 孔均未出现 432 的&判为阳性( M + 在第 . 天& . 孔中只有 $ 孔出现 432 的&判为可疑&需要重新检测( . !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 I + 在第 . 天&出现 432 的小斑时&判为可疑&需要重新检测( J + 在待检血清对照孔及测试孔有细胞毒性效应的&判为可疑&需要重新检测# 注'在试验后 $+H 替换新鲜培养液将降低细胞毒性效应&同时不影响特异性抗体的滴度# "%'%% ! 定量试验 "%'%%%! ! 将样品血清置于 <+? 水浴 .'>DE &破坏血清中的补体# "%'%%%% ! 在 (+ 孔细胞培养板上待检血清区域&每孔加入 <' " 6 培养液&然后加入 <' " 6 待检血清进行 系列倍比稀释&每个稀释度作 . 孔重复&在最后一个稀释孔中混匀后弃去 <' " 6 # "%'%%%' ! 除病毒对照及每份样品的待检血清对照之外&其余孔中加入 <' " 6 含有 $''#418 <' ! <' " 6 *或 &'''#418 <' ! >6 +的伪狂犬病毒液#随后的操作参照 +%.%$%. ) +%.%$%- # "%'%%%( ! 检测对照设置同 +%.%$%< # "%'%%%) ! 结果判读是在试验后 -,H 和 /&H &分别利用倒置显微镜* $''V +观察 (+ 孔细胞培养板&检查 细胞孔中是否有毒性反应和 432 &计算血清抗体效价# 血清抗体效价 " $B& &判为伪狂犬病中和抗体阳性# 血清抗体效价大于 $B$ 而小于 $B& &判为可疑&应采用 261)7 或乳胶凝集试验验证结果&或者重 新采样检测&间隔期至少 ,I # 血清抗体效价小于 $B$ &判为阴性# * ! 酶联免疫吸附试验* '()!* + *%! ! 检测全病毒抗体 '()!* *%!%! ! 试验材料及设备 完整伪狂犬病毒抗原)酶标抗体)伪狂犬病阳性血清)阴性血清(抗原稀释液)洗涤液)样品稀释液) 酶标结合物稀释液)底物液)终止液配制方法参见附录 " (酶标反应板) ./? 恒温培养箱)酶标仪# *%!%% ! 操作方法 *%!%%%! ! 包被抗原 以完整伪狂犬病毒抗原作为包被酶标反应板的抗原# *%!%%%% ! 包被酶标反应板 用抗原稀释液稀释抗原&通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度作为工作浓度#将工作浓度的抗 原加到 (+ 孔酶标反应板上&每孔 &'' " 6 &于 -? 包被 $,H &然后用洗涤液洗板 . 次&包被好的酶标反应 板置于 F&'? 或 F/'? 保存备用# *%!%%%' ! 检测程序 利用样品稀释液按 $B.' 稀释待检样品)阳性血清)阴性血清&加入到包被好的酶标反应板上&每孔 $'' " 6 &阳性对照和阴性对照分别作 . 孔重复&于 ./? 放置 .'>DE #弃去板中溶液&用洗涤液洗板 . 次#每孔加入 $'' " 6 用酶标结合物稀释液稀释到工作浓度的酶标结合物&于 ./? 放置 .'>DE #弃 去板中溶液&用洗涤液洗板 . 次&最后一次洗完后应用吸水纸拍干#加入 $'' " 6 合适的底物溶液*如邻 苯二胺 ; 过氧化氢+&室温避光显色 &<>DE 后&每孔加入 <' " 6 终止液终止显色#在酶标仪上测定 -('E> 波长的光吸收值* 08 -(' +# - !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 *%!%' ! 结果判定 可采用 ! ! " 值作为临界值进行结果判定&先计算阴性对照 08 -(' 平均值* *4 +和阳性对照 08 -(' 平 均值* 34 +& ! ! " *样品检测 08 -(' 值与阳性对照 08 -(' 平均值之比+ X *样品 08 -(' 值 F*4 +!* 34F*4 +# 当 ! ! " " '%< &判为抗体阳性(当 ! ! " # '%< &判为抗体阴性# *%% ! 鉴别检测 '()!* *%%%! ! 试验材料及设备 伪狂犬病毒 A 2 蛋白)酶标抗体)抗伪狂犬病 A 2 蛋白阳性血清)抗伪狂犬病 A 2 蛋白阴性血清(抗原 包被液)洗涤液)样品稀释液)酶标结合物稀释液)底物液)终止液配制方法参见附录 " (酶标反应板) ./? 恒温培养箱)酶标仪# *%%%% ! 简要操作流程 *%%%%%! ! 包被抗原 以伪狂犬病毒 A 2 蛋白作为包被酶标反应板的抗原# *%%%%%% ! 包被酶标反应板 用包被液稀释抗原&通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度作为工作浓度#将工作浓度的抗原加 到 (+ 孔酶标反应板上&每孔 &'' " 6 &于 -? 包被 $,H &然后用洗涤液洗板 . 次&包被好的酶标反应板置 于 F&'? 或 F/'? 保存备用# *%%%%%' ! 检测程序 检测操作见 /%$%&%. &结果判定见 /%$%. # $ ! 乳胶凝集试验 $%! ! 试验材料及设备 伪狂犬病乳胶凝集试验抗原'由灭活伪狂犬病毒致敏乳胶颗粒的悬液&呈白色均匀的乳状# 伪狂犬病标准阳性血清)伪狂犬病标准阴性血清&稀释液配制方法参见附录 " # 载玻片)微量移液器及吸头# $%% ! 操作方法 $%%%! ! 对照试验 取 $< " 6 # &' " 6 伪狂犬病乳胶凝集试验抗原&分别与等量阴性血清)阳性血清在洁净的玻片上混 匀&如在 <>DE 内分别出现如下判定标准中的不凝集和等于!高于 <'G 凝集&则对照组成立&可进行待 检血清的检测# $%%%% ! 待检血清的检测 不需对待检血清热灭活或其他方式的灭活处理即可进行定性检测#取 $< " 6 待检血清&与等量伪 狂犬病乳胶凝集试验抗原在洁净干燥的载玻片上用竹签搅拌充分混合&在 .>DE # <>DE 内观察结果# < !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 $%' ! 判定标准 反应后应出现以下几种凝集结果&以 <'G 以上凝集判为阳性结果' W + ! $''G 凝集'混合液变清亮&凝集颗粒聚集在液滴的边缘( O + /DE &自然干燥后冷藏备用# #%%%% ! 免疫荧光检测 将上述处理的标本在 3") 液中浸润&然后用吸水纸去除周边多余液体&放入湿盒#滴加工作浓度 的伪狂犬病荧光抗体到待检标本上& ./? 恒温箱中作用 .'>DE #随后用 3") 液漂洗待检标本 . 次&每 次 .>DE &用吸水纸去除周边多余液体&自然干燥后于荧光显微镜下检查# #%' ! 结果判定 在将待检冰冻切片)压片或组织培养玻片置于荧光显微镜下镜检判定结果时&应该注意出现荧光的 颜色和在细胞中的分布部位#用异硫氰酸荧光黄* Y1#4 +标记的荧光抗体&在荧光显微镜下应发出亮绿 色荧光&凡是呈现暗绿色或黄色的荧光&则为非特异性荧光#阳性特异性荧光应该出现在细胞浆中&如 果在细胞浆外或细胞核内出现荧光&则不能判为阳性#判定结果标准如下' + !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 W + ! 在细胞浆中出现亮绿或黄绿荧光者&判为阳性( O + 在细胞浆中未出现亮绿或黄绿荧光者&判为阴性( M + 在细胞浆中出现微弱亮绿或黄绿荧光者&判为可疑&需要进行重复试验#如果重复试验中&在 细胞浆中依然出现微弱亮绿或黄绿荧光者&判为阳性# / !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! * *规范性附录+ 病毒分离鉴定溶液的配制 *%! ! +,', 培养液 取 8929 培养基粉末 $.%< A 溶于 (<'%'>6 去离子水中&轻轻搅拌至完全溶解后&加入 .%/ A 碳 酸氢钠* *W=40 . +&用 $%'>UR ! 6 盐酸* =4R +调 Z = 值至 +%, # /%' &加去离子水定容至 $'''>6 &立即 用孔径为 '%&& " > 的微孔滤膜正压过滤除菌后&置 -? 保存备用# *%% ! +,', 生长液 在 8929 培养液中加入 $'G 的新生犊牛血清*经 <+? 水浴 .'>DE 灭能+) &''1@ ! >6 的青霉素& $'' " A ! >6 的链霉素& -? 保存备用# *%' ! +,', 维持液 在 8929 培养液中加入 .G 的新生犊牛血清*经 <+? 水浴 .'>DE 灭能+) &''1@ ! >6 的青霉素& $'' " A ! >6 的链霉素& -? 保存备用# , !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! - *资料性附录+ 病毒 #%)+ )& 计算公式及酶联免疫吸附试验溶液的配制 -%! ! 病毒 #%)+ )& 的计算 按照表 "%$ *举例说明+进行细胞病变孔数等统计&计算出各个稀释度的细胞病变百分比# 表 -%! 病毒稀释度 细胞病变情况 累计孔数 病变孔数 未病变孔数 病变孔数 未病变孔数 细胞总孔数 出现细胞病变 百分比! G $' F$ , ' <$ ' <$ * <$ ! <$ + $'' $' F& , ' -. ' -. * -. ! -. + $'' $' F. , ' .< ' .< * .< ! .< + $'' $' F- , ' &/ ' &/ * &/ ! &/ + $'' $' F< , ' $( ' $( * $( ! $( + $'' $' F+ + & $$ & $. * $$ ! $. + ,-%+ $' F/ - - < + $$ * < ! $$ + -<%- $' F, $ / $ $. $- * $ ! $- + /%$ $' F( ' , ' &$ &$ * ' ! &$ + '%' !! 按式* "%$ +)式* "%& +计算该病毒的 #418 <' ' 距离比 # 高于 <'G 病变百分数 $ <' 高于 <'G 病变百分数 $ 低于 <'G 病变百分数 ,,,,,* "%$ + $ R A #418 <' X 高于 <'G 稀释度对数 % 距离比 & 稀释度对数 ,,,,,* "%& + !! 从此例表中可见该病毒的 #418 <' 在 $' F+ * ,-%+G +和 $' F/ * -<%-G +之间&按上述公式计算' 代入公式'距离比 X ,-%+F<' ,-%+F-<%- X'%,, FR A #418 <' XF+['%,,V * F$ + XF+%,, 所以' #418 <' X$' F+%,, ! '%$>6 注'由于稀释病毒时采用 $' 倍系列稀释* $' F$ +&其稀释度的对数是 F$ (试验中&每孔加入的病毒液使用量是 '\$>6 # -%% ! 抗原稀释液 分别称取三羟甲基氨基甲烷* #CDQ + $&%$$- A )乙二胺四乙酸* 28#7 + '%<,< A )氯化钠* *W4R + '%''( A & 用 (''>6 双蒸水充分溶解&调节 Z = 值至 (%+ &最终定容至 $'''>6 # -%' ! 洗涤液 在 (''>6 双蒸水中加入&混匀后定容至 $'''>6 # ( !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 -%( ! 样品稀释液* $-! ! #.//0 + 首先称取磷酸二氢钠* *W= & 30 - - = & 0 + $., A 溶解于双蒸水中&并定容至 $'''>6 &配制 $>UR ! 6 的磷酸二氢钠* *W= & 30 - - = & 0 +贮液(称取磷酸氢二钠* *W & =30 - + $-& A 溶解于双蒸水中&并定容至 $'''>6 &配制 $>UR ! 6 磷酸氢二钠* *W & =30 - +贮液# 取 &,' >6$ >UR ! 6 磷酸二氢钠 * *W= & 30 - - = & 0 +贮液) /&' >6$ >UR ! 6 磷酸氢二钠 * *W & =30 - +贮液) '%<>6 吐温 ;&' &混匀即为 Z =/%& 的样品稀释液* 3") ! #]JJE +# -%) ! 酶标结合物稀释液 在 $'''>6 样品稀释液* 3") ! #]JJE +中加入 $' A 牛血清白蛋白* ")7 +# -%" ! 底物液* 1$+ ! 2 % 1 % + 首先配制 '%$>UR ! 6 Z =<%' 磷酸盐 ; 柠檬酸盐缓冲液&称取磷酸氢二钠* *W & =30 - + /$%+ A )柠檬酸 $(%& A &充分溶解于 (''>6 双蒸水中&并定容至 $'''>6 # 取邻苯二胺* 038 + '%'- A ) .'G 过氧化氢* = & 0 & + '%$<>6 &溶解于 '%$>UR ! 6 Z =<%' 磷酸盐 ; 柠檬 酸盐缓冲液中&定容至 $''>6 #底物溶液对光敏感&应避免强光直射&且现配现用# -%* ! 终止液* %345 ! ( 硫酸+ 将 &&%&>6 硫酸* = & )0 - +缓慢加入到 $//%,>6 双蒸水中混匀# '$ !" ! #!"#$ " %&!& 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ８９６１ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 伪狂犬病检疫规范 ＳＮ／Ｔ１６９８—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １　字数 １９ 千字 ２０１１年３月第一版　２０１１年３月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１５９３　定价 １８．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售