SNT 2710-2010 山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 !" ! #!"#$ " !$#$ 山羊传染性胸膜肺炎检疫技术 $ %&'&()*(+ , '-)-.-/0-'.-()& 1 *-%2.& , '*(+ , /+%'- , (+%3-(*& !$#$4##4$# 发布 !$##4$%4$# 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前 !! 言 !! 本标准按照 !" ! #$%$ " &''( 给出的规则起草# 本标准修改采用$陆生动物诊断试验与疫苗%& &''( 版'第 &%)%* 章# 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口# 本标准起草单位(中华人民共和国山东出入境检验检疫局# 本标准主要起草人(郑小龙)梁成珠)朱来华)孙敏)徐彪)邓明俊)岳志芹)肖西志# ! !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范 # ! 范围 本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离与鉴定)微量间接血凝试验)补体结合试验和聚合酶 链式反应& +,- '技术# 本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断和检疫# ! ! 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件*仅注日期的版本适用于本文 件#凡是不注日期的引用文件*其最新版本&包括所有的修改单'适用于本文件# !" ! #.)/(%&/ " &''0 ! 食品微生物学检验 ! 染色法)培养基和试剂 % ! 临床诊断 %%# ! 临床症状 山羊传染性胸膜肺炎的典型特征是极度高热& .$1 " .01 '*发病率和死亡率很高*妊娠山羊易流 产#在高热约 &2 " 02 后*出现明显的呼吸症状(呼吸加速*状态痛苦*偶尔出现呼噜声*持续性地剧烈 咳嗽#在病程后期山羊失去运动能力"""前腿分开站立*颈项僵硬前伸*有时候嘴里不断地流出涎液# %%! ! 判定 根据临床症状可以作出初步判定#如要确诊需送实验室做进一步检查# & ! 病原分离鉴定 &%# ! 设备和器材 生化培养箱)显微镜)无菌棉拭子)载玻片)灭菌平皿)灭菌试管和试管架)酒精灯# &%! ! 培养基和试剂 $'3 马血清马丁肉汤) $'3 马血清马丁琼脂*见附录 4 # 生化用培养基(按 !" ! #.)/(%&/ " &''0 中第 0 章的规定# &%% ! 样品的采集与处理 &%%%# ! 用无菌棉拭子采集患病动物鼻腔分泌物*移入含抗生素&青霉素 $''5 ! 67 和链霉素 $'' # 8 ! 67 ' 的灭菌生理盐水中+或用注射器无菌穿刺采取胸腔液# &%%%! ! 无菌采集死亡动物的胸水和纵隔淋巴结*以及肺病变部的病料*特别是硬变部位和非硬变部位 交界处的样品# &%%%% ! 采集样品应尽快低温& '1 " .1 '运往实验室*如无法立即送往实验室*应将样品置于 9&'1 冷冻保存# $ !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 &%& ! 病原分离培养 在无菌条件下剪碎病料*用无菌接种环钩取样品接种于 $'3 马血清马丁肉汤内+鼻腔拭子浸出液 和胸腔液用灭菌吸管吸取 '%$67 " '%067 接种于 $'3 马血清马丁肉汤*接种后置 0)1 培养#同时 取上述病料在 $'3 马血清马丁琼脂平板上划线接种*平板用胶布封口*置 0)1:3 二氧化碳培养箱中 培养# 每天检查肉汤培养物生长情况即颜色变化和有无絮状物出现#肉眼观察出现混浊时*表示有细菌 污染*应将培养物经孔径 '%.: # 6 的滤膜过滤后再移植*用 $ ! $' 的量接种于肉汤培养基或用接种环钩 取培养物在琼脂平板上划线培养# 在平板上培养 $.2 *每 $2 " 02 用解剖镜&放大 : 倍 " :' 倍'配以透射和入射光源检查一次+继代 时切下带有孤立菌落的琼脂块*表面朝下*在新鲜琼脂平板表面上并稍推动*或将其投入新鲜肉汤培养 基内#也可用巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出*在新鲜肉汤培养基中培养# 作初次分离用的肉汤培养基接种后培养 )2 *如果仍不见生长迹象*要进行盲传#每份样品的培养 物*包括一次盲传继代至少检查 0 周后*方可废弃# &%' ! 结果判定 &%'%# ! 培养特征 在低次代中*固体培养基上可产生畸形菌落*小型)无芯)形状不规则#经过传代*形成圆形)露滴状 的小菌落*直径 $66 " 066 *大小不一+在 .' 倍显微镜下可看见典型的煎蛋样菌落*部分有脐眼#挑 取典型菌落或取肉汤培养物涂片*用瑞氏染色法进行染色*显微镜下可看到大小不一)形态多样的紫色 小点*有圆形)逗点形)棒形)环形和不规则形等*但以圆形居多# &%'%! ! 生化特征 分别接种各类生化反应培养基*具体的生化反应内容见表 $ # 表 # ! 生化反应特征 项 !! 目 生化特性 项 !! 目 生化特性 发酵葡萄糖 ; 膜斑形成 < 水解精氨酸 9 液化血清 ; 分解尿素 9 吸附鸡红细胞 9 还原美蓝 ; 溶血素测定 ; !! 注( ; (阳性 ! 9 (阴性# ' ! 微量间接血凝试验 '%# ! 仪器设备 分析天平)离心机) = 型血凝板)微量振荡器) :' # 7 可调移液器)恒温箱等# '%! ! 试剂和材料 标准抗原)标准阳性血清和标准阴性血清)磷酸盐缓冲液& +"> ? @)%& ')阿氏液&试剂配制见附 录 4 '* $3 致敏绵羊红细胞&见附录 " '# & !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 '%% ! 操作 '%%%# ! 微量间接血凝试验操作术式见表 & #在 = 型微量血凝板上*每孔加 +">&: # 7 # 表 ! ! 微量间接血凝试验操作术式 单位为微升 '%%%! ! 每排第 $ 孔加血清 &: # 7 *反复吹打充分混匀*移出 &: # 7 至第 & 孔+吹打混匀*移出 &: # 7 至第 0 孔*依次类推作等量倍比稀释至第 $$ 孔*第 $$ 孔弃去 &: # 7 #孔 $& 不加血清设立为红细胞对照*同 时设立阳性血清和阴性血清对照孔# '%%%% ! 每孔加入 $3 致敏绵羊红细胞悬浮液 &: # 7 *立即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈 混匀# '%%%& ! 置湿盒中 0)1 静置 $A 或室温&约 &'1 '下静置 &A 左右*判定结果# '%& ! 结果判定 '%&%# ! 阴性对照和红细胞对照应无凝集现象*红细胞沉积呈圆形*边缘整齐#阳性对照应出现全部红 细胞或 " :'3 红细胞凝集# '%&%! !! ( $''3 红细胞凝集*凝集颗粒均匀地分布在整个孔底*呈薄状+ ;;; ( ):3 红细胞凝集*孔底 红细胞呈滴状*凝集边缘不整齐+ ;; ( :'3 红细胞凝集*孔底形成环状*周围有凝集颗粒*但不成膜状+ ; ( &:3 红细胞凝集*孔底形成一个小团*但小团边缘不整齐*周围有少量凝集+ 9 (红细胞完全不凝集* 红细胞在孔底形成小团*小团边缘整齐*周围无凝集颗粒# 若各对照组成立*试验结果可信*以被检血清出现 :'3 红细胞凝集& ;; '的血清最高稀释度作为 其抗体效价# '%&%% ! 被检血清抗体效价 " $B/ 时判为阳性+被检血清抗体效价 # $B/ 时判为阴性# ( ! 补体结合试验 (%# ! 材料与仪器 (%#%# ! 被检血清(见附录 " # (%#%! ! 绵羊红细胞(见附录 " # (%#%% ! 补体# (%#%& ! 山羊传染性胸膜肺炎阴性血清)阳性血清# (%#%' ! 山羊传染性胸膜肺炎补体结合抗原# (%#%( ! 溶血素# (%#%" ! 稀释液(巴比妥缓冲液&见附录 4 '# (%#%) ! (* 孔 5 型微量滴定板)酶标仪# 0 !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 (%! ! 预备试验&溶血素)补体)抗原等效价测定' (%!%# ! 溶血素效价测定&通常一个月左右测定一次' (%!%#%# ! 稀释溶血素(先将溶血素稀释成 $B$'' 的基础液&如(溶血素以石炭酸防腐时*取 '%$67 加 (%(67 稀释液*如以甘油为保存液*则取 '%&67 加 (%/67 稀释液*混合均匀'*再按表 0 进一步稀释# 表 % ! 溶血素稀释法 要 !! 素 稀释倍数& $BC ' :'' $''' $:'' &''' &:'' 0''' 0:'' .''' :''' $B$'' 溶血素! 67 '%& '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ '%$ 稀释液! 67 '%/ '%( $%. $%( &%. &%( 0%. 0%( .%( 全量! 67 $%' $%' $%: &%' &%: 0%' 0%: .%' :%' (%!%#%! ! 溶血素效价测定的方法*按表 . # 表 & ! 溶血素效价测定法&总体积 #!' ! $ ' 要 !! 素 稀释倍数& $BC ' 对照 :'' $''' $:'' &''' &:'' 0''' 0:'' .''' :''' $B:'' 溶血素 补体 红细胞 稀释的溶血素! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: " " 稀释液! # 7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' ): ): $'' $B&' 补体! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: " &: " &%:3 红细胞悬液! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: 温育 0)1 水浴 &'6DE !! 按表 . 操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微震动混匀后* :.'E6 读取 FG 值*与标准比色孔&见附录 , '比较*观察溶血度*记录结果# (%!%#%% ! 溶血素效价确定(能使 &: # 7 的 &%:3 红细胞悬液在 0)1 水浴箱内 &'6DE 出现完全溶血 & $''3 '的最小溶血素量*称为一个溶血素单位*或溶血素效价#测定补体)抗原和做正式试验时*溶血 素的用量为 & 个溶血素单位或称工作量# (%!%#%& ! 制备致敏红细胞悬液(按测定的溶血素效价稀释溶血素至 & 个标准单位*缓慢加入到等量的 &%:3 绵羊红细胞悬浮液中*混合均匀*置 0)1 水浴箱中温育 &'6DE *即制备成致敏红细胞悬液# (%!%! ! 补体效价测定 每次进行补体结合反应试验*应于当日测定补体效价#先用稀释液*将补体做 $B&' 稀释*然后按 表 : 进行操作# 表 ' ! 补体效价测定&总体积 #!' ! $ ' 要 !! 素 孔 !! 号 对照 $ & 0 . : * ) / ( $' $$ $B&' 补体! # 7 : $' $: &' &: 0' 0: .' .: :' " . !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 表 ' &续' 要 !! 素 孔 !! 号 对照 $ & 0 . : * ) / ( $' $$ 稀释液! # 7 .: .' 0: 0' &: &' $: $' : ' :' 补加稀释液! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: 温育 0)1 水浴 &'6DE 致敏红细胞! # 7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' 温育 0)1 水浴 &'6DE !! 按表 : 操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后* :.'E6 读取 FG 值*与标准比色孔&见附录 , '比较*确定出现 :'3 溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价* 即该浓度为此反应体系下 $ 个补体溶血单位& ,@ :' '#正式试验补体工作浓度为 : 个 ,@ :' # (%!%% ! 抗原效价的测定 按表 * 进行抗原效价的测定# 表 ( ! 抗原效价测定&总体积 #!' ! $ ' 要 !! 素 抗原稀释倍数 对照 $B$' $B:' $B): $B$'' $B$:' $B&'' $B0'' $B.'' $B:'' $B$' 稀释的抗原! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: 稀释的阳性血清! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: " 0)1 水浴 &'6DE :,@ :' 补体! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: &: 稀释液! # 7 " " " " " " " " " &: 温育 0)1 水浴 &'6DE 致敏红细胞! # 7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' 温育 0)1 水浴 &'6DE !! 注(每一血清稀释度& $B: * $B$' * $B&: * $B:' * $B): * $B$'' '各做一行*共计 * 行# !! 按表 * 操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后* :.'E6 读取 FG 值*与标准比色孔&见附录 , '比较*观察溶血度*记录结果# 抗原效价的确定(在对照成立时*与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原 效价*即为 $ 个单位抗原*正式试验抗原使用 & 个单位*即为该抗原的工作浓度# (%% ! 正式试验 (%%%# ! 要素准备 按 *%& 的测定结果对各要素作稀释# 被检血清&见附录 " '# 工作抗原(按测定的效价稀释成工作浓度& & 单位抗原'*用 &: # 7 # : !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 工作补体(按测定的效价稀释后工作浓度& :,@ :' '*用 &: # 7 # 致敏红细胞悬液&见 *%&%$%. '(用 :' # 7 # 阳性血清(灭活后* $B: 稀释*用 &: # 7 # 阴性血清(灭活后* $B: 稀释*用 &: # 7 # (%%%! ! 血清效价测定 按表 ) 的程序实施# 表 " ! 血清效价测定&总体积 #!' ! $ ' 要 !! 素 血清试验孔 血清抗 补体对照 $BC : $' &' .' /' $*' 0&' : 抗原对照 补体对照 抑制 溶血 溶血 对照 &,@ :' $,@ :' 红细胞 对照 血清! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: " " " " " & 单位抗原! # 7 &: &: &: &: &: &: &: " &: &: " " " 稀释液! # 7 " " " " " " " &: &: &: :' *&%: ): 0)1 水浴 &'6DE :,@ :' 补体! # 7 &: &: &: &: &: &: &: &: &: " &: $&%: " 温育 0)1 水浴 &'6DE 致敏红细胞! # 7 :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' :' 温育 0)1 水浴 &'6DE (%%%% ! 结果判定 (%%%%%# ! 试验成立条件 按表 ) 操作结束后*取出微量反应板*轻微振动混匀后* :.'E6 读取 FG 值*比照标准比色孔&附 录 , '判读*各对照的结果如下时*可判定被检血清孔+否则*补体的效价应重新测定*并重做 *%0 的正式 试验# & 个单位补体对照( $''3 溶血# $ 个单位补体对照( :'3 溶血# ' 个单位补体对照(不溶血# 抗原对照(抑制溶血对照 $''3 溶血+溶血对照不溶血# 红细胞对照(不溶血# 阴性血清对照*完全溶血# 阳性血清对照*完全不溶血# 血清抗补体对照(抗补体对照孔应为 $''3 溶血#如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相 同该血清为抗补体*血清抗补体可重新采样或用其他方法检测# (%%%%%! ! 结果判定 被检血清 $B: 稀释*抑制溶血 " :'3 判为阳性+抑制溶血在 &:3 " :'3 之间判为可疑+溶血程度 在 ):3 " $''3 溶血判为阴性# 可疑样品应重检一次*按上述标准进行判定*若仍为可疑则判为阳性# * !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 达到 :'3 抑制溶血或以上时血清的最高稀释度为该血清的效价# " ! 聚合酶链式反应& %&' 方法' "%# ! 仪器设备 +,- 仪)高速台式冷冻离心机)台式离心机)混匀器)冰箱)微量可调移液器& $' # 7 ) $'' # 7 ) $''' # 7 '及配套吸头)离心管# "%! ! 试剂与材料 裂解液)苯酚)三氯甲烷)异丙醇& 9&'1 预冷')无水乙醇) ):3 乙醇)蒸馏水) 2H#+ ) GH4 聚合酶) 氯化镁)蛋白酶 I )琼脂糖)电泳缓冲液等&试剂配制见附录 4 '# 引物( +$ ( : , J4#,4#####44#,,,##,44!J0 , +& ( : , J#4,#4#!4!#44##4#44#4#4#!,44J0 , 引物在使用时用双蒸水稀释为 $' # 6KL ! 7 # "%% ! 样品的制备 "%%%# ! 培养物的处理 取 067 培养物 .1$&'''M ! 6DE 离心 &'6DE #将沉淀用 +"> 洗涤一次*加入 $67 灭菌蒸馏水 重悬沉淀*置于 $''1 裂解 $'6DE *作为模板保存于 9&'1 备用# "%%%! ! 组织样品 (") 的提取 将组织样品放入培养液中无菌研磨*取 $67 上清液用 +"> 清洗* $&'''M ! 6DE 离心 $'6DE #沉淀 用裂解液悬浮*加入 >G> 至终浓度为 $3 *蛋白酶 I 至终浓度为 &''6 8 ! 67 #将该混合反应液置于 :'1 孵育 $A *然后加入等量的苯酚 B 三氯甲烷 B 异戊醇& &:B&.B$ '*颠倒 & 次 " 0 次*混匀* .1 下 $&'''M ! 6DE 离心 $'6DE #转移上清液于另一离心管中*加入 &%: 倍体积的预冷无水乙醇* 9&'1 沉 淀 0'6DE * $&'''M ! 6DE 离心 $'6DE *弃去所有液相#用 $67)'3 乙醇漂洗* $&'''M ! 6DE 离心 &6DE * 重复 & 次 " 0 次#真空或室温干燥* GH4 沉淀物用 &: # 7 无菌双蒸水溶解作为模板*保存在 9&'1 备用# "%& ! %&' 反应 "%&%# ! 反应体系 $'N!" # 缓冲液( : # 7 # 2H#+ & $'66KL ! 7 '( '%: # 7 # 引物 +$ 和 +& (各 $ # 7 # !" # GH4 聚合酶( '%: # 7 & $OEDP '# Q 8 ,L & & $%:66KL ! 7 '( 0 # 7 # 被检样品( : # 7 # 灭菌双蒸水( 0. # 7 # 样品检测时*同时要设阳性对照和空白对照# "%&%! ! 反应程序 第一阶段( (.1 ! &6DE + ) !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 第二阶段( (.1 ! 0'R * .)1 ! $:R * )&1 ! $:R * 0: 个循环+ 第三阶段( )&1 ! :6DE # "%' ! 电泳 制备 $3 琼脂糖凝胶板*加样 * # 7 " / # 7 *电压 /'= " $''= *电流 .'64 " :'64 *电泳 0'6DE " .'6DE #判定# "%( ! 凝胶成像仪观察 扩增产物电泳结束后*用凝胶成像仪观察检测结果)拍照*记录试验结果# "%" ! 结果判定 在同一块凝胶板上电泳后*当阳性对照泳道出现一条 0$*S ? 清晰条带*空白对照泳道不出现任何 条带* GH4 分子质量标准成立时( """被检样品泳道出现一条 0$*S ? 的条带*判为阳性& ; '+ """被检样品泳道没有出现大小为 0$*S ? 的条带*判为阴性&一'# 必要时对扩增产物进行序列测定# +,- 扩增序列参见附录 G # / !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! ) &规范性附录' 试剂的配制 )%# ! #$* 马血清马丁肉汤& + ,"%) " )%$ ' 将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内*每管 .%:67 *添加无菌马血清 '%:67 # )%! ! #$* 马血清马丁琼脂 马丁肉汤中加入琼脂*使含量达 $%03 " $%:3 * $&$1 高压灭菌 $:6DE 即成马丁琼脂#在灭菌的 *T6 " /T6 直径培养皿内加无菌马血清 $67 *再添加煮沸融化降温至 ::1 " *'1 的马丁琼脂 (67 * 轻轻摇动混合均匀*静置凝固后即成马丁琼脂培养基# )%% ! 磷酸盐缓冲液& + ,"%! * $%#-./ ! $ ' 甲液(磷酸氢二钠& $&@ & F ' ! 0:%/& 8 *氯化钠 ! /%: 8 *加蒸馏水至 $'''67 # 乙液(磷酸二氢钠& &@ & F ' ! $:%*' 8 *氯化钠 ! /%: 8 *加蒸馏水至 $'''67 # 甲液 )&67 *乙液 &/67 *混匀# $&$1 高压蒸汽灭菌 $:6DE *置室温或 .1 保存# )%& ! 阿氏液的配制 葡萄糖 !!!!!!!! &%': 8 柠檬酸钠& &@ & F ' '%/' 8 氯化钠 '%.& 8 蒸馏水 加至 $''67 溶解后*以 $'3 柠檬酸调节 ? @ 至 *%$ *分装* $$)1 高压蒸汽灭菌 $:6DE * .1 保存# )%' ! $%)'* 生理盐水 氯化钠 '%/: 8 蒸馏水 加至 $''67 溶解后* $&$1 高压蒸汽灭菌 $:6DE *置室温或 .1 保存# )%( ! 巴比妥缓冲液& 01! '储存液& 'N '的制备 )%(%# ! 成分 : * : 二乙基巴比妥酸 :%): 8 : * : 二乙基巴比妥钠 0%): 8 氯化钠 /:%'' 8 ( !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 六水合氯化镁 $%*/ 8 氯化钙 '%&/ 8 蒸馏水加至 &'''67 )%(%! ! 方法 首先用 $'''67 蒸馏水将各种盐溶解*再用 :''67 热蒸馏水溶解巴比妥酸*待巴比妥酸冷却后 加入 $'''67 盐溶液中*最后用蒸馏水补至 &'''67 *混匀*分装后 $&$1 高压灭菌 &'6DE *储存于 .1 备用# )%(%% ! 用法 用前将所配 :N="> 储存液用蒸馏水作 $B: 稀释成 $N="> 使用液*调 ? @ 值至 )%. # )%" ! 裂解缓冲液 $'66KL ! 7#MDR J @,L & ? @)%. ' $'66KL ! 7HU,L $'66KL ! 7VG#4 )%) ! '$*#)2 电泳缓冲储存液 #MDR 碱 &.& 8 VG#4 0)%& 8 冰乙酸 :)%$67 加双蒸水至 $'''67 *应用前用双蒸水将 :'N#4V 电泳缓冲液 :' 倍稀释# '$ !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! 1 &规范性附录' 被检血清)绵羊红细胞的采取与处理 1%# ! 被检血清 在被检牲畜颈前三分之一处静脉沟部位剪毛消毒采血#采出的血液*冬季应放置室内防止血清冻 结*夏季应放置阴凉之处并迅速送往实验室#如在 )&A 内不能送到*应先将血清倒入另一灭菌试管内* 按比例每 $67 血清加入 $ 滴 " & 滴 :3 石炭酸生理盐水溶液*以防腐败#运送时使试管保持直立状 态*避免振动#血清在 :*1 水浴灭活 0'6DE # 1%! ! #* 致敏绵羊红细胞的制备&血凝试验' 采集绵羊血*放入等量阿氏液中摇匀*置 .1 冰箱中保存备用#临用前用 +"> 洗涤 0 次*每次以 &'''M ! 6DE 离心 :6DE *将血浆)白细胞充分洗去至上清液清亮*弃上清液*留存沉淀的红细胞# $3 致敏绵羊红细胞(将红细胞用 +"> 液配成 .3 的悬液*在冰浴的条件下加入 &%:3 的戊二醛*边 加边摇*使最终浓度为 '%.3 &即 $''67.3 的红细胞悬液内加入 $*67&%:3 的戊二醛'*在 .1 固定 $A *摇匀后用生理盐水洗涤 . 次 " : 次*最后用生理盐水配成 $'3 的红细胞悬液#取稀释的标准抗原 与等体积的己醛化的 &3 绵羊红细胞混合* 0)1 水浴 &A *每隔 $:6DE 振摇一次*取出后洗涤弃上清*稀 释成 $3 备用# 1%% ! 绵羊红细胞&补体结合试验' 绵羊颈静脉采血*置于装有玻璃珠的灭菌瓶内*振荡 $:6DE " &'6DE *脱去纤维蛋白*防止血液凝 固#将脱纤血移至离心管中*加入 & 倍 " 0 倍量的稀释液*混匀*以 $:''M ! 6DE " &'''M ! 6DE 离心 $:6DE *吸出上清液加入稀释液轻轻混合后做第二次离心*方法同前*离心 0 次*以清洗红细胞#直到上 清液透明为止*然后吸去上清液#使用前用 $N="> 使用液将洗涤后的细胞做成 &%:3 细胞液&即 $B .' 稀释'#稀释后的红细胞最多保存 $2 *但离心后的红细胞在冰箱中可保存 02 " .2 # $$ !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! & &规范性附录' 标准比色孔的制备 &%# ! !%'* 溶解红细胞液&血红素'的配制 取红细胞泥 &%:67 加于 ))%:67 蒸馏水内*使红细胞完全溶解后*再加 :N="> 储存液 &'67 混 匀*制成 &%:3 溶解红细胞&血红素'*供配制标准比色孔用# &%! ! !%'* 红细胞悬液配制 取红细胞泥 &%:67 加于 $N="> 使用液 ()%:67 混匀*即成 &%:3 红细胞悬液*供配制标准比色 孔用# &%% ! 标准比色孔的制备 标准比色孔的制备按表 ,%$ 进行# 表 &%# ! 标准比色孔制备 要 !! 素 反应孔溶血百分比 3 ' $' &' &: 0' .' :' *' )' ): /' (' $'' &%:3 溶解红细胞液! # 7 ' $' &' &: 0' .' :' *' )' ): /' (' $'' &%:3 红细胞悬液! # 7 $'' (' /' ): )' *' :' .' 0' &: &' $' ' 稀释液& $N="> '! # 7 .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' .'' &%& ! 标准比色孔的配制 取 '3 " $''3 溶血度溶液各 $&: # 7 *分注相应的微量孔内* :.'E6 读取 FG 值# &$ !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附 ! 录 ! ( &资料性附录' %&' 扩增片段序列 !! UPTUPPPPPUUPTTTPPTUU 8 PU 8 P 88 UUPPP 8 TU 88 P 8 TU 8 PUPPPTTUPPUPPUUPP 8 8 P 8 PP 8 PPPPUUUUTUUTUU 8 UP 8 PUPPU 8 TPPTU 88 UPTUUPPUTU 8 TUPPPPTUPPP 8 TUPTU 888 PPU 8 PPUUTPPUUPPUTPTTUUTUU 8 P 88 P 8 PP 8 PPUP 888 U 8 PPUPP 8 TUU PPUTUU 8 UUPT 8 UPPUP 88 UUUUPPP 8 PUUUU 88 PUPPU 8 PTTUPPP 8 PU 8 TU 8 PUPPUP TU 8 PUU 8 PPTUPPUUTTPPUPPUPP 8 UPU 88 P 88 U 8 TUUPP 88 P 88 UUTUUPP 8 TUPUPU PPUPUUPPUTPTUPU 8 PU 0$ !" ! #!"#$ " !$#$ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ０１７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范 ＳＮ／Ｔ２７１０—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．２５　字数 ２５ 千字 ２０１１年３月第一版　２０１１年３月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１６４８　定价 ２１．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售