利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

!! 卷 " 期 !##$年 %月 生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12 &’()!! *’)" !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! +,-.,/0,1 !##$ 2,3,45,6：78139 !:，!##$；;33,-.,6：78< =:，!##$> ?94@ A’1B A8@ @C--’1.,6 0< 8 D18E. F1’/ .9, *8.4’E8( G4D9 ?,39E’(’D< 2,@,8139 8E6 H,5,(’-/,E. I1’D18/ ’F J94E8（K$L -1’D18/）（*’) !##L;;!M===#）) " J’11,@-’E64ED 8C.9’1 ) ?,(：K$NM"=NK"%L"#$%；ON/84(：(4C/4ED#MP=!$> 3’/ 国家高技术研究与发展项目资助（*’) !##L;;!M===#）) 利用反向遗传学技术构建 !"亚型禽流感高产疫苗株 #$%$&’()*% !)+, -)$./ 0’11)%$ 2(&’)% 3,*..4 5$&)6$/ 7&*8 96)’% :%7.;$%<’ 0)&;=$= >4 ?$6$&=$ #$%$()1= 刘 明="，张 云=，刘春国=，潘蔚绮=，!，刘超男=，!，杨 涛= QRS 74ED="，TG;*U VCE=，QRS J9CENUC’=，I;* W,4NX4=，!，QRS J98’N*8E=，! 8E6 V;*U ?8’= = 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 ="###= ! 东北农业大学，生命技术学院，哈尔滨 ="##L# = 3+/#($+, 4%2 5+6(*+/(*2 (- 7%/%*#$+*2 .#(/%0"$(,(12，8+*6#$ 7%/%*#$+*2 9%&%+*0" :$&/#/)/% (- !;;<，8+*6#$ ="###=，!"#$+ ! !(,,%1% (- 5#-% <0#%$0% =%0"$(,(12，3(*/"%+&/ ;1*#0),/)*+, >$#?%*&#/2，8+*6#$ ="##L#，!"#$+ 摘 要 采用 2? Y IJ2技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的 $条内部基因片段，近期分离的 G"*=亚型禽流感病毒的血凝 素基因以及 *L亚型参考毒株的神经氨酸酶基因，分别构建了 K个基因的转录与表达载体，利用反向遗传学技术拯救出了全 部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株 1G"*L。通过对血凝素蛋白 G;=和 G;!连接肽处的 "个碱性氨基酸（2N2N2NZNZ）基 因缺失与修饰，从而消除了病毒基因的毒力相关序列，拯救的 1G"*L疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性，病毒在鸡胚尿囊液和细 胞培养上清的 G;效价得到极大提高，分别为 =：!#MK和 =："=!。制备的禽流感疫苗免疫动物后 M [ "周即可诱导产生高效价的 GR抗体，鸡免疫后 =K周依然保持高水平的 GR抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒 ;\U’’@,\UC8ED6’ED\=\%$ 还是近期分离的 ;\U’’@,\GQ]\X^V\#M都能够产生完全的免疫保护作用，免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有 *L鉴别 诊断标记禽流感疫苗株的研制为 G"*=高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。 关键词 禽流感病毒，反向遗传学，高产株，疫苗 中图分类号 X:K 文献标识码 ; 文章编号 =###NL#$=（!##$）#"N#:!#N#: 9>=(&’1( G4D9(< -8.9’D,E43 8548E 4EF(C,E_8 ;（GI;R）541C@,@ ’F .9, G"*= @C0.<-,@ 38C@,6 ,E’1/’C@ ,3’E’/438( (’@@ .’ -’C(.1< F81/@ 4E J94E8 8E6 +’C.9,8@.,1E ;@48E 3’CE.14,@ ) ?9, 58334E8.4’E -1’D18/ 4@ 8 1,(480(, @.18.,D< 4E 3’E.1’((4ED .9, -1,58(,E3, ’F .9,@, 64@8@.1’C@ 64@,8@,@ ) ?9, @4‘ 4E.,1E8( D,E,@ ’F .9, 94D9N<4,(6 4EF(C,E_8 541C@ ;\U’’@,\H8(48E\L\#=（G%*!）， .9, 9,/8DD(C.4E4E（G;）D,E, ’F ;\U’’@,\GQ]\X^V\#M（G"*=）@.184E，8E6 .9, E,C18/4E468@, D,E, F1’/ ;\HC3B\U,1/8E<\ =!="\:L（G!*L）1,F,1,E3, @.184E A,1, 8/-(4F4,6 0< 2?NIJ2 .,39E4aC,) ?9, G; D,E, A8@ /’64F4,6 0< .9, 6,(,.4’E ’F F’C1 08@43 8/4E’ 8346@ ’F .9, 3’EE,3.4ED -,-.46, 0,.A,,E G;= 8E6 G;!> O4D9. D,E, ,‘-1,@@4ED -(8@/46@ A,1, 3’E@.1C3.,6，8E6 .9, 1,3’/04E8E. 541C@ 1G"*L A8@ D,E,18.,6 0< 3,((@ .18E@F,3.4’E) ?9, 4EF,3.4’E ’F 3943B,E ,/01<’@ 8E6 .9, 398((,ED, .,@.@ 4E5’(54ED 3943B,E@ 6,/’E@.18.,6 .98. .9, 1,3’/04E8E. G"*L（1G"*L）4EF(C,E_8 541C@ 4@ 8541C(,E. ) ?9, 8((8E.’43 F(C46@ ’F 1G"*LN4EF,3.,6 ,DD@ 3’E.84E 94D9N.4.,1 4EF(C,E_8 541C@,@ A4.9 9,/8DD(C.4E8.4’E CE4. ’F =：!#MK，A9439 81, ,4D9. .4/,@ .9’@, ’F .9, -81,E.8( G"*= 541C@ ) ?9, 1G"*L ’4(N,/C(@4F4,6 58334E, 3’C(6 4E6C3, 9,/8DD(C.4E8.4’E 4E9404.4’E（GR）8E.40’64,@ 4E 3943B,E@ 4E ! A,,B@ -’@.N 58334E8.4’E，8E6 /8‘4/C/ D,’/,.143 /,8E GRN.4.,1 A,1, ’0@,15,6 M [ " A,,B@ -’@.N58334E8.4’E 8E6 A,1, B,-. CE6,1 ’0@,158.4’E !"# $% &’’()* +,’ #-./0123445637’8 4,54(’6) &’#’ !9::; <#"7’47’8 3=356)7 >"#?5857; 368 >"#73:57; "! 7,’ :’7,3: 4,3::’6=’ "! 7,’ -./$ -@AB 25#9)’)，ACD"")’CD936=8"6=C$CEF 368 ACD"")’C-GHCIJKCLM，&,54, ,38 % ;’3#) ’N<36)5"6 368 85!!’#’64’) 3>"6= >9:75<:’ 3>56" 3458) 56 -A <#"7’56* +,’ /0 6’9#3>56583)’ <#"7’56 >3#(’# >3(’) 57 <"))5?:’ 7" 85)756=95), ?’7&’’6 -./$ 1 56!’47’8 368 -./0 23445637’8 365>3:) * !"# $%&’( 32536 56!:9’6O3 25#9)，#’2’#)’ =’6’754)，,5=, ;5’:8 )7#356，234456’ ’23:9375"6 高致病性禽流感（-@AB）是由正黏病毒科 A型 流感病毒中的 -. 或 -P 亚型引起的一种禽类的急 性、高度接触性烈性传染病。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑 等家禽及野鸟、水禽、海鸟等野禽均可感染［$］。从 QLL0年末到 QLLM年初，亚洲 %个国家暴发了家禽感 染 -./$型禽流感疫情［Q］。在此期间，发生疫情的 国家中有 $亿多只家禽死于禽流感或被扑杀。QLLM 年 0月疫情得到初步控制。自 QLLM年 F月底以来， 柬埔寨、中国、印度尼西亚、哈萨克斯坦、马来西亚、 蒙古、俄罗斯、泰国和越南家禽又暴发了 -./$型高 致病性禽流感新疫情。土耳其和罗马尼亚的家禽及 克罗地亚的野生候鸟中也出现了 -./$型禽流感感 染。截至目前为止，-./$亚型禽流感疫情已经在欧 洲大陆十几个国家出现，并且蔓延到了非洲［0，M］。 -./$亚型高致病性禽流感不仅给养禽业造成了巨 大的经济损失，严重威胁着养禽业健康发展，同时也 对人类的健康带来了巨大的威胁［ .］。经 R-S 证 实，从 QLL0年起到 QLLF年 Q月止 -./$亚型禽流感 病毒至少造成了 $FE 人感染，E$ 人死亡。其中，中 国发生了 $Q人感染 -./$ 亚型禽流感病毒，% 人死 亡病例。 流感病毒粒子呈球形，病毒囊膜表面的血凝素 蛋白（-A）和神经氨酸酶蛋白（/A）是流感病毒的主 要免疫原性抗原。-A是诱导体液免疫的主要保护 性抗原，大量的研究表明 -A蛋白在病毒入侵宿主 细胞的过程中起着重要作用［ F］。由 -A蛋白裂解而 成的两个蛋白片段 -A$和 -AQ连接肽处的氨基酸 组成决定着 -@AB 的致病性和组织嗜性［ P，% ］。抗 -A蛋白抗体能抑制病毒的血凝活性并能中和病 毒，是病毒诱导机体产生的主要保护性抗体。由于 -A基因突变而引起的 -A抗原变异往往会导致免 疫失败和变异毒株流行。 全群扑杀和生物安全防护是及时扑灭和控制高 致病性禽流感的主要措施。但是，对于养殖管理水 平参差不齐的东南亚各国，疫苗免疫接种可能是防 止禽流感疫情大范围流行的最经济方法。但是采用 传统方法构建 -. 亚型禽流感疫苗株却非常困 难［E］，流感病毒反向遗传学操作技术为禽流感疫苗 的研制提供了新的技术手段［$L］。$EEE 年 /’9>366 等［$$］首次建立了由 $P个质粒拯救流感病毒的反向 遗传学操作技术。QLLQ 年 -"!!>366 等［$Q］报道了采 用该技术构建人流感疫苗株；QLL0年 G59等［$0］采用 人流感疫苗高产株 @T%为骨架成功地构建 -.亚型 禽流感疫苗株。本研究通过 T+1@UT克隆了 -E 亚 型禽源高产病毒株的 F条基因片段，采用反向遗传 学操作构建了全部基因都来自禽源流感病毒的重组 疫苗株，该毒株具有抗原匹配性好、安全、高产、带分 子标记的特征。现将实验结果如下。 ) 材料与方法 )*) 病毒、细胞与载体 高致病性禽流感病毒株 ACD"")’C-GHCIJKCLM （-./$），高 产 禽 流 感 病 毒 ACD"")’CV3:536C0CL$ （-E/Q）和禽流感参考毒株 ACV94(CD’#>36;C$Q$.CP0 （-Q/0）分别用无菌磷酸盐缓冲液（@WX）作 $ Y $L0 稀 释后接种 E Z $$ 日龄 X@J鸡胚，0P[培养 M%, 后收 集尿囊液，\ PL[保存备用。<-RQLLL 转录和翻译 双向载体［$M］由美国 X7 * H98’儿童医院的 R’?)7’#教 授惠赠。V-.!大肠杆菌感受态细胞，购自宝生物工 程（大连）公司。QE0+ 和 ]VU^ 细胞购自北京博大 泰克公司。 )*+ 主要试剂 病毒 T/A 提取试剂 +TBO":，4V/A 合成试剂， S@+B1]_] 细胞培养液和脂质体 G5<"!’473>56’ QLLL 购自 B6257#"=’6公司；_N +3‘V/A聚合酶，限制性内切 酶，+M V/A连接酶购自宝生物（大连）公司；质 粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工 程有限公司。 )*, 引物 参照已知序列设计禽流感反转录通用引物 a651 $Q：.b1ADUAAAADUADD10b；根据流感病毒基因片段 末端保守特性，分别合成流感病毒内部基因 /@、]、 /X和 /A 基因 T+1@UT 扩增引物，引物序列参照 _#54, -"!!>366报道［$.］，其中 @WQ、@W$、@A基因以及 -A基因扩增引物进行了重新设计，上海博亚生物 技术有限公司合成。引物序列如表 $。 $QP刘 明等：利用反向遗传学技术构建 -.亚型禽流感高产疫苗株 表 ! 禽流感病毒聚合酶基因和 "#基因引物序列 $%&’( ! $)( *+,-(+. .(/0(12(. 34+ 5)+(( *4’6-(+%.( %17 "# 8(1(. 43 ,13’0(19% :,+0. !"#$%&’($)& )* +,$-",# +,$-",’# #"./"&0"# 1,’%-"&(# 2’3+2435 6738988::8;8;9;;;#:;:999:;9::8;3<7 +243= 2’3+2435>?@A 6739898::8;8;8#$<$8;998:888::9::883<7 2’3+2435>?B 6738988::8;8;9#;#$9999:89;98:99::983<7 +243== 2’3+2434EA 673;::9;8:9;:999::9A8;;;3<7 +936?E 673:::9D8;;888;:8;9:8;;:3<7 +93== 2-3+9344<46A4 6739889;:8;8;8<<$<88:8;8;8;888:9::::89888;8:9:83<7 2-3F635>4> 6739889;:8;8;9;#;;9;89888::9:;8989:;9::3<7 F94 2-3GH3?@>A 6739898;:8;8;:$#$$9:89:999;99:::8:88883<7 8I" 2’，9’, ’&J 2- ,"K,"#"&(# K,$-",#7 67 "&J )* ,"#(,$0($)& "&J)&/L"’#" #$("#（AM）)* !"#!、$#%! ’&J !"&2! N 8I" J$%$(# )& (I" K,$-",# ,"K,"#"&( (I" (I" *$,#( &/0L")($J" )* (I" K,$-",#，(I" 0I’,’0(", A -"’&# ,"O",#" J$,"0($)&，’&J (I" /&J",L$&" &/0L")($J"# ,"K,"#"&( (I" ,"#(,$0($)& "&J)&/L"’#" ,"0)%&$P"J #$("# ’&J (I" Q)LJ 0I’,’0(",# ,"K,"#"&( (I" 67 "&J )O",I’&%# K)#( (I" J$%"#($)&# R$(I (I" 0),,"#K)&J$&% AMN !=> 病毒 ?@#提取、2A@#合成和基因片段的扩 增 按 8,$P)L试剂说明书从含有流感病毒鸡胚尿囊 液中提取病毒 AG9。以禽流感反转录通用引物 S&$3 54 为引物，采用禽源反转录酶 9TU，进行反转录合 成 0!G9，以 0!G9为模板进行 +;A扩增。+;A反应 程序：@BV预变性 B-$&，@BV变性 <>#，6BV退火 <>#， E4V延伸 <-$&，循环扩增 <>次；E4V延伸 5>-$&。 !=B 高产禽流感病毒内部基因重组质粒的构建 以高产禽流感病毒 9W:))#"W!’L$’&W5（F@G4） 的 0!G9为模板，A83+;A 扩增 C 条内部基因片段， 回收纯化扩增到的目的片段，分别用各自的引物所 带有的限制性内切酶酶切过夜，回收目的片段与经 !"&!!酶切的 KFX4>>>载体进行连接反应。+24、 +25基因各自的两条片段分别同时与载体进行三片 段连接反应。+9基因的两个片段通过基因搭桥方 法扩增全长片段后再与载体连接。细菌转化、质粒 提取、酶切鉴定等按《分子克隆实验指南》方法进行。 各基因重组质粒 KTY3+24、KTY3+25、KTY3+9、KTY3 G+、KTY3T 和 KTY3GH由上海英俊生物技术公司进 行序列测定。 !=C "#和 @#基因重组质粒的构建 以高致病性禽流感病毒 9W:))#"WFYZW[1DW>B （F6G5）的 0!G9为模板，分别以引物 2-3F935W2-3 F935>46A4扩增 F9 基因的 F95 片段，以引物 2-3 F935>4>W2-3GH3?@>A扩增 F9基因的 F94片段；以 禽流感参考株 9W!/0\W:",-’&]W5456WE<（F4G<）的 0!G9 为模板，以引物 2-3G935W2-3G935B5>>载体进行连接，按上述 方法转化感受态细胞，筛选到重组质粒，然后对重组 质粒 KTY3F9和 KTY3G9进行序列测定。 !=D 细胞转染与重组病毒拯救 按 F)**-’&&等报道方法略加改进进行［5B］。取 ? 个阳性质粒（KTY3+24、KTY3+25、KTY3+9、KTY3G+、 KTY3T、KTY3GH、KTY3F9和 KTY3G9）各 5"%，加入适 量的无血清、无抗生素 ^+8=3TMT细胞培养液使之 体积为 5>>"Y。取 ?"Y 脂质体 L$K)*"0(’-$&" 4>>> 加 入到 @4"Y 的 ^+8=3TMT细胞培养液中，二者充分混 合，室温作用 6-$&后，将其加到含有质粒的微量反 应管中，质粒和脂质体室温作用 <>-$&后，加 ?>>"Y 的 ^+8=3TMT细胞培养液使总体积为 5-Y。胰酶消 化 4@<8和 T!;_细胞各 6 ‘ 5>6 混匀后接种 C孔组 织培养板，过夜培养形成单层。^+8=3TMT 细胞培 养液洗细胞单层两次，将上述质粒和脂质体混合物 加到细胞单层表面。b6"%W-Y 8+;_ c (,]K#$&（H$%-’ 公司）的 ^+8=3TMT 细胞培养 液，培养 E4I后收集细胞上清液，细胞上清液进行血 凝活性

检测

工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训

，拯救出的重组病毒命名为 ,F6G<。重 44E ’()*+"+ ,-.%*#/ -0 !)-1+2(*-/-34 生物工程学报 4>>C，U)Lb44，G)b6 组流感病毒的拯救与鉴定过程如图 !所示。 !"# 病毒鸡胚扩增及其血凝和血凝抑制试验 "#$%&细胞上清接种 ’ ( ))日龄的 *+,鸡胚尿 囊腔，&-.孵化 /01，收集尿囊液，作为疫苗毒分装 保存。采用 23$4的公鸡红细胞，按常规微量法分 别进行血凝（#5）和血凝抑制（#6）试验。 !"$ 重组病毒的基因序列分析 "#$%& 感染鸡胚尿囊液提取病毒 7%5，合成 89%5，各基因片段特异引物 7:;+<7扩增相应片段 后测序；同时设立未经反转录的 7%5对照，以排除 尿囊液中转染质粒 9%5的干扰。 !"!% 鸡胚半数感染剂量（&’()%）的测定 "#$%&分别用 +=*做 ) >)2 ( )>)2)2稀释，每个稀 释度接种 $ 枚（23)?@A枚）*+, 鸡胚，&-.孵化 /01， 收集尿囊液，测定尿囊液的血凝活性，按 7BBC; DEBF81法计算病毒的 G69$2。 !"!! 静脉接种致病指数（’*+’）的测定 )：)2稀释的 "#$%&病毒尿囊液，按 23!?@的剂 量静脉接种 )2 只 / 周龄 *+, 鸡，负压隔离器中饲 养，观察 )2C，每日观察鸡的临床表现，分别计算 6H+6。 !"!, -.)/0疫苗免疫效力试验 I周龄 *+,鸡随机分组，每组 0只，负压隔离器 中饲养。"#$%&重组病毒经甲醛灭活后，按矿物油： 含毒尿囊液为 ) >!的比例制成油包水型油乳剂灭活 疫苗，颈部皮下免疫注射，免疫后不同时间采血，以 血凝抑制（#6）试验检测血清中的 #6抗体滴度，计算 抗体效价的几何均数（JD:）。 !"!0 -.)/0疫苗免疫鸡攻毒试验 &周龄 *+,鸡，随机分组，免疫前采血，#6抗体 检测结果全部阴性。"#$%&灭活疫苗按 23&?@A只的 剂量颈皮下接种免疫，同时设空白对照组。免疫后 &周采血测定 #6抗体滴度，时采用滴鼻、点眼方式 进行 #$%)亚型强毒攻击，攻毒剂量 )22 <@9$2，每天 观察记录鸡的临床表现。攻毒后的第 &天和第 -天 分别采取咽喉和泄殖腔拭子，进行病毒分离与滴定。 攻毒后 )/C采血测定攻毒耐过鸡的 #6抗体水平。 , 结 果 ,"! 重组质粒的构建 经过琼脂糖凝胶电泳初步筛选的重组质粒，进 行 +<7鉴定和序列测序，分别筛选到含有 0个目的 基因 +=!、+=)、+5、%+、D、%*、#5 和 %5的重组质粒 KD@;+=!、 KD@;+=)、KD@;+5、 KD@;#5、 KD@;%+、 KD@;%5、KD@;D 和 KD@;%*。其中重组质粒 KD@; #5基因已按实验设计缺失了 #5蛋白连接肽处的 / 个连续碱性氨基酸 7;7;L;L，对其中 &/& 位的精氨 酸（7）突变为苏氨酸（:），#5基因核苷酸序列与实 验设计完全一致。#5 基因连接肽修饰前、后的核 苷酸序列和编码的氨基酸序列如图 )。克隆的 %& 基因序列与其他实验室发表的 %&序列（JBF=MFN登 录号 5O$0I/!!）相同。 图 ) #5基因修饰前、后的核苷酸序列和编码的氨基酸序列 ,PQR) S"PQPFMT MFC ?UCPVPBC FE8TBUWPCBX MFC M?PFU M8PCX XBYEBF8BX UV W1B #5 QBFB ,", 重组病毒的拯救与序列测定 0个重组质粒转染 !’&:AD9 &!，经 D9 $)!。"#$%&接种 的 *+,鸡胚尿囊液血凝价高达 ) > !2/0。"#$%&连续 鸡胚传 )2 代，第 )2 代 "#$%& 病毒核酸序列与 "#$%&亲本病毒株核酸序列同。 ,"0 重组病毒的抗原性分析 #6试验表明，"#$%&重组病毒的血凝活性能够 被鸡抗 JXAJEMFQCUFQA)A’I和 JXA#@ZA[,OA2/高免血 清完全抑制，#6抗体效价分别为 ) > $)! 和 ) > )2!/， 但是不能够被亲本毒 JXA9MTPMFA2)（#’%!）的高免血 清所抑制。抗参考株 #!%&的高免血清对 "#$%&病 毒的 %6 抑制价为 ) > 022；抗 JXA#@ZA[,OA!22/ 的高 免血清对 "#$%& 重组病毒的 %6抑制价小于 ) > )2。 由此可见 #$%&病毒具有符合实验设计的 #$和 %& 亚型血清表型。 &!-刘 明等：利用反向遗传学技术构建 #$亚型禽流感高产疫苗株 图 ! 重组 "#$%禽流感病毒的拯救及其鉴定流程 &’()! *+,-,./0-’1,/’23 ,34 (030-,/’23 25 -0.267’3,3/ "#$% ,8’,3 ’359:031, 8’-:; !"# 重组病毒的生物学特性 -"#$%重组病毒的 <=>#?为 ! @ A?B C6D；EF&鸡胚 感染 -"#$% GH+ 后尿囊液的 "I 效价即可达到 A J !?GH；A @ A?H <=>#? C?KA6D剂量接种鸡胚，培养 BL+鸡 胚仍然存活，表明重组病毒对鸡胚无致死性。 !"$ 鸡致病性试验结果 -"#$%重组病毒静脉接种 EF&鸡，A?4观察期内 感染鸡临床表现正常，无任何异常或临床发病，=MF= 指数等于 ?，可见 -"#$% 对鸡属于低致病性毒株。 病毒感染后 %4从部分鸡（!CA?）的气管中分离到病 毒，但是所有鸡的泄殖腔样品检测均为阴性（?CA?）。 !"% 灭活苗的免疫效力试验 -"#$%油乳剂灭活苗免疫后 N4 个别鸡检测出 现低效价 "=抗体；免疫后 !周所有鸡都产生明显的 免疫应答反应，即使 ?KA6D低剂量免疫组 "=抗体也 可达到 A J A!H（N92(!）以上；免疫后 G周 "=抗体水平 达到高峰，"=抗体可达 A J!#L（H92(!）以上；免疫后 AH 周 "=抗体几何均数仍然大于 A JAL这一抗体保护临 界值。鸡免疫抗体水平见表 !。 !"& 高致病性禽流感攻毒试验结果 %周龄鸡以 ?K%6D的剂量免疫同样也能够诱导 产生高效价的 "=抗体，免疫鸡 "=抗体的几何均数 G!N !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12 生物工程学报 !??L，M29K!!，$2K# 图 ! 阳性质粒转染 "#!$%&’()混合培养细胞前后的形态 *+,-! &+./012030,/4125 06 7+89: .9;; .<;3：?960/9 .9;; 3/4=569.3+0=；@：A"2 4639/ .9;; 3/4=569.3+0=- 表 ! "#$%& 免疫后不同时间的 #’抗体水平 ()*+, ! (-, #’ )./0*120,3 /0/,"3 14 5-056,.3 713/ "#$%& 8)550.)/01. B/0<1 ’054,9%7C DE 4=3+?0:+95 B&$ 3+39/5 1053FG4..+=43+0=%: ’A ’HA ’"" ’"# ’I! ’JI ’H"K LMHC N HOHL H OHP" H O"PK H OIIP H OH#I H OIP H OIP LM! N H OHL H O"PK H OPJJ H OJ#H H O"#I H O""" H OHHH Q4..+=9 ,/0<1 LMK N H OHL H OPH" H OKAP H OHL"I H OIIP H O""" H OHKJ LM# N H OHL H OJKH H OHL"I H OHL"I H OJ#H H O!!A H O""" (0=3/0; ,/0<1 LMK N H OHL N HOHL N HOHL N HOHL N HOHL N HOHL N HOHL 表 & "#$%&疫苗免疫接种鸡的强毒攻毒试验结果 ()*+, & 9-)++,.:, ",3;+/3 14 "#$%& 8)550., 0<<;.0=,2 5-056,.3 B/0<1 Q+/<5 53/4+=5 @960/9 .24;;9=,9 DE 3+39/（B&$） ’+59459:%’94:%$034; Q+/<5 +50;43+0=%$034; R053 .24;;9=,9 DE 3+39/（B&$） Q4..+=9 ,/0<1 B5%B’%H%#K H OPJJ L%L%J L%J4 H OJKH (0=3/0; ,/0<1 B5%B’%H%#K N HOHL J%J%J J%J? S Q4..+=9 ,/0<1 B5%DCT%U*V%LI H OPH" L%L%J L%J4 H OKAP (0=3/0; ,/0<1 B5%DCT%U*V%LI N HOHL J%J%J J%J. S 4：W0 G+/<595 X9/9 +50;439: 6/07 :4Y ! 4=: :4Y A 3/4.294; 4=: .;04.4; 5X4?5 06 .24;;9=,9: .2+.Z9=5；?：>;; 329 .2+.Z9=5 X9/9 Z+;;9: 0= :4Y P 1053F .24;;9=,9，G+/<595 X9/9 +50;439: 6/07 ?032 3/4.294; 4=: .;04.4; 5X4?5 X+32 329 3+39/ ! HL![E’PL %7C；.：>;; .2+.Z9=5 X9/9 Z+;;9: 0= :4Y " 1053F.24;;9=,9， G+/<595 X9/9 +50;439: 6/07 ?032 3/4.294; 4=: .;04.4; 5X4?5- 在 H OPH"（#;0,"）以上。HLL(C’PL高致病性禽流感病 毒攻击，/DPW! 疫苗免疫鸡无任何鸡出现临床发病 或死亡，病毒分离全部为阴性。空白对照组鸡在攻 毒后 " \ P: 全部死亡，病毒分离全部阳性。可见， /DPW!疫苗免疫不但能够保护鸡抵抗高致病性禽流 感病毒的致死性攻击，同时也能够起到减少或防止 病毒在鸡群中传播的作用。结果见表 !。 & 讨论 >型流感病毒的反向遗传学操作即指由病毒负 链 ]W>合成 .’W>，然后将其克隆到基因转录和%或 表达载体，转染易感细胞后拯救出流感病毒的过程。 与传统方法相比反向遗传学操作可以大大加速流感 疫苗株的研制速度。尤其是对于人流感疫苗株的构 建，只需将目前流行株的 D> 和 W> 基因分别克隆， 然后与人流感病毒 R]J 高产株的内部基因表达质 粒共转染细胞，即可拯救出理想的疫苗株。 D06674==等［H"］（"LL"年）用 J 质粒系统证明了这是 一个简单而快捷的方法。随后不久，^ 基因亚型不同于流行株的 DPW!FR]J 重组疫苗株。 _9??Y 等［HA］（"LLI年）按 B&R标准，采用 DPWH亚型 人流感病毒，在 I 周左右时间构建成功 DPWHFR]J 人流感疫苗株。总之，上述疫苗株不论是禽流感疫 苗株还是人流感疫苗株，都是建立在人流感疫苗 P"A刘 明等：利用反向遗传学技术构建 DP亚型禽流感高产疫苗株 !"#高产株基础之上的。为了克服人 $禽流感病毒 重组株可能的安全隐患，我们构建了以 %&’( 亚型 高产禽流感病毒为骨架的 # 质粒系统，拯救出了全 部基因片段都来自禽源的重组禽流感疫苗株 )%*’+。由于重组病毒的所有基因全部来自禽源， 保留了禽流感病毒与人流感病毒之间所固有的种间 屏障，大大降低了重组禽流感疫苗株感染人的机会。 由于流感疫苗的免疫效果主要取决于疫苗株与 流行株的抗原相关性，为此世界卫生组织根据全球 流感病毒监测网的检测结果提前一年推荐下一年的 流感疫苗株。虽然流行病学证据显示 ,&&- 年中国 广东分离株 ./01123/045678167/,/&- 是目前东南亚 地区流行的 %*’,亚型高致病性流感病毒的共同祖 先，但是 (99: $ (99*年新分离株与其相比不仅基因 型不同，而且存在着较大的抗原性差异［,#］。为了保 证禽流感疫苗的最佳免疫效果，必须根据禽流感的 流行变异情况更新疫苗株，以确保疫苗能够有效预 防新出现的变异株。 虽然抗 ’.蛋白抗体可能对流感病毒感染起到 一定程度的保护作用，但是只有抗 %.蛋白抗体才 能够中和流感病毒感染。因此，本研究选择 (99:年 国内流行的 %*’,亚型高致病性禽流感代表株作为 疫苗株 %.基因供体，通过基因操作删除了 %.,和 %.(之间与毒力相关的 *个连续碱性氨基酸（";"; ";<;<），从而使得疫苗株对鸡和鸡胚的毒力完全消 除。同时选取国内流感病毒中较少见的神经氨酸酶 亚型 ’+ 作为疫苗株的分子标记［,&］，为疫苗免疫家 禽和野毒感染家禽的鉴别诊断提供方便。)%*’+疫 苗株具有安全、低毒、高产的特性，与野毒株相比不 仅抗原性完全一致，而且鸡胚生长性能大大改善，尿 囊液中病毒 %.效价提高 #倍以上；基因重组疫苗 株不仅具有很好的遗传稳定性，而且具有良好的免 疫原性，免疫动物完全能够抵抗强毒株的致死性攻 击。该疫苗株的成功研制为 %*’,亚型高致病性禽 流感的防控提供了新的技术保障。 致 谢 感谢美国 => ? @483 儿童研究医院 A)BCD %1EEF566博士和 "BCD5)8 G3HHI博士热心帮助。 !"#"!"$%"&（参考文献） ［ ,］ G3H2>3) "0，J356 G@，01)F56 KL !" #$ ? AM1N4>B16 568 3C1N17I 1E B6EN436O5 . MB)42? %&’()*&)$ +!,，,&&(，’(：,*( $ ,P& ［ (］ QB <=，0456 R，G567 @ !" #$ ? 03632B2 1E 5 DB7DNI S5>D1736BC 568 S1>36>B5NNI S5683FBC %*’, B6EN436O5 MB)42 B6 352>3)6 .2B5? -#".(!， (99:，)*+：(9& $ (,+ ［ +］ .HH1>> .，!35)216 %? T35) 1E D4F56 S5683FBC 7)1U2 52 HB)8 EN4 2U33S2 >D)147D .2B5? -#".(!，(99:，),-（-&P:）：:P( $ :P+ ［ :］ A623)B6V W，.MB56 B6EN436O5? %*’, F1M32 B6>1 .E)BC5，A4)1S356 X6B16，833S36B67 7N1H5N C)B2B2? =CB36C3，(99-，*..（*P-+）：&+( ［ *］ X67CD425V <，.43U5)5V4N !，Y1U3NN =T !" #$ ? !)1H5HN3 S3)216;>1; S3)216 >)562FB22B16 1E 5MB56 B6EN436O5 .（%*’,）? - /01$ 2 %!3， (99*，*’,：+++ $ +:9 ［ -］ GBN216 Z.，[1\ ’@? =>)4C>4)5N H52B2 1E BFF463 )3C176B>B16 1E B6EN436O5 MB)42 D3F577N4>B6B6? .664 "3M ZFF461N，,&&9，/：P+P $ PP, ［ P］ J5B736> =@，WC[54N3I @G? 0NIC12IN5>B16 1E D53F577N4>B6B6 568 2>5NV;N367>D 1E 634)5FB6B8523 C1FHB63 >1 )374N5>3 >D3 7)1U>D 1E 5MB56 B6EN436O5 MB)4232 B6 >B2243 C4N>4)3? 4&(.5 +!5，(99,，-0：,PP $ ,#* ［ #］ !3)843 WQ，=45)3O YQ? =>)4C>4)5N E35>4)32 1E >D3 5MB56 B6EN436O5 MB)42 D3F577N4>B6B6 >D5> B6EN436C3 MB)4N36C3? 4!" %&’()*&)$，(999， -)：PP $ #- ［ &］ 4)3 B6EN436O5 M5CCB632 568 >D3 423 1E 7363>BC )3C1FHB656>2? 6.$$ 7)($3 8!#$"9 :(1#0，,&-&，).：-:+ $ -:* ［,9］ =4HH5)51 <，<5>O @W? Z6EN436O5 M5CCB632 7363)5>38 HI )3M3)23 7363>BC2? ;.(( <)= %&’()*&)$ >??.0)$，(99:，,/*：+,+ $ +:( ［,,］ ’34F566 0，G5>565H3 L，Z>1 % !" #$ ? 0363)5>B16 1E B6EN436O5 . MB)4232 36>B)3NI E)1F CN1638 CY’.2? @()’ -#"$ A’#3 B’& CBA， ,&&&，0(：&+:* $ &+*9 ［,(］ %1EEF566 A，<)5422 =，!3)3O Y !" #$ ? AB7D>;SN52FB8 2I2>3F E1) )5SB8 7363)5>B16 1E B6EN436O5 MB)42 M5CCB632? 4#’’&0!，(99(，,+： +,-* $ +,P9 ［,+］ QB4 W，G118 @W，ANB2 L !" #$ ? !)3S5)5>B16 1E 5 2>5685)8BO38， 3EEBC5CB142 57)BC4N>4)5N %*’+ M5CCB63 HI )3M3)23 7363>BC2? 4&()$)1D， (99+，*.)：*#9 $ *&9 ［,:］ %1EEF56 A，’34F566 0，<5U51V5 R !" #$ ? . Y’. >)562E3C>B16 2I2>3F E1) 7363)5>B16 1E B6EN436O5 . MB)42 E)1F 3B7D> SN52FB82? @()’ -#"$ A’#3 B’& CBA，(999，0-：-,9# $ -,,+ ［,*］ %1EEF56 A，=>3CD @，0456 R !" #$ ? X6BM3)25N S)BF3) 23> E1) E4NN; N367>D 5FSNBEBC5>B16 1E 5NN B6EN436O5 . MB)4232? A(’9 4&()$，(99,， .)(：((P* $ ((#& ［,-］ =4HH5)51 <，[D36 %，=U5I63 Y !" #$ ? AM5N45>B16 1E 5 7363>BC5NNI F18BEB38 )35221)>56> %*’, B6EN436O5 . 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