益生菌干酪乳杆菌Zhang和双歧杆菌V9发酵豆乳的研究

《乳业科学与技术》      2010 年第 1 期 （总第 140 期）   1  益生菌干酪乳杆菌 Zhang 和双歧杆菌 V9 发酵豆乳的研究 张 青，王记成，魏爱彬，闫丽雅，周 琦，张和平* 内蒙古农业大学乳品生物技术与教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018 摘 要：对益生菌 Lactobacillus casei Zhang 和 Bifidobacterium animalis V9 单独及混合（1:1）发酵豆 乳及以其制作的活性豆乳饮料进行研究，并测定了豆乳 37 ℃发酵期间及活性豆乳饮料 4 ℃ 28 d 贮藏 期间的 pH、TA、FAN 和活菌数。结果表明，豆乳发酵过程中，混合发酵豆乳酸度变化大于单独发酵 且可有效缩短发酵时间；B.animalis V9 发酵的豆乳 FAN 含量变化最大。活性豆乳饮料贮藏期间，含 有 B.animalis V9 活性豆乳饮料的 pH 值和 TA 变化不明显，含有 L.casei Zhang 活性豆乳饮料的 pH 值 显著降低，TA 显著升高；所有样品的 FAN 在贮藏 7 d 期间显著下降，之后变化不明显；在 28 d 贮藏 结束时，L.casei Zhang 和 B.animalis V9 单独及混合发酵豆乳饮料时活菌数分别是 2.28×109 cfu/g、 4.27×108 cfu/g、1.56×109 cfu/g 和 2.8×108 cfu/g。本研究初步表明，在豆乳中 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 混合发酵优于单独发酵，在活性豆乳饮料中 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 具有优良的贮藏稳定性， 显示了其应用于发酵豆乳制品具有良好的潜力。 关键词：益生菌；干酪乳杆菌 Zhang；双歧杆菌 V9；发酵豆乳饮料；存活性 中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1671-5187(2010)01-0001-05 Investigation of the Growth and Survival Activities of Probiotics Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium animalis V9 in Soymilk Zhang Qing, Wang Jicheng, Wei Aibin, Yan Liya, Zhou Qi, Zhang Heping* Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer of Education Ministry of China, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot of Inner Mongolia 010018, China Abstract: The growths of probiotics Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium animalis V9 in soymilk fermented individually and combinely at a ratio of 1:1, and their survival activities in formulated soymilk drink prepared by fermented soymilk were investigated. The pH value, titration acidity(TA), free amino nitrogen（FAN） and the probiotics viable counts of soymilk fermented at 37 ℃ were determined every 3 h for 24 h, and the mentioned four index of soymilk drink were also determined each week during 4 ℃ storage for 28 days. The results indicated that the acidity rate of soymilk fermented combinely by L.casei Zhang and B.animalis V9 was faster than individually, which could effectively shorten the fermentation time. During storage, the biggest FAN content and the smallest pH and TA changes were observed in soymilk fermented with B.animalis V9 individually, while the pH values decreased and TA increased significantly in soymilk drink fermented with L.casei Zhang, respectively. The FAN decreased significantly after 7-day storage in all samples, but afterwards the FAN had no obvious change. After 28-day storage at 4 , t℃ he viable counts in soymilk drink fermented L.casei Zhang and B.animalis V9 individually and combinely were 1.74×109 cfu/g，1.02×109 cfu/g，1.07×109 cfu/g and 1.05×109 cfu/g, respectively. Therefore, it is proved preliminarily that the properties of soymilk drink fermented with L.casei Zhang and B.animalis V9 combinable were better than individually. Key words: Probiotic, L.casei Zhang, B.animalis V9, fermentation of soymilk drink, survival 近年来，具有潜在益生特性的发酵食品越来 越受到人们的重视，并且在世界各地日益流行。 益生菌对于人类的营养和健康具有重要的意义， 常常被用来治疗腹泻、泌尿生殖道感染和胃肠道                                                                收稿日期：2009-12-01； 作者简介：张青，女，硕士研究生，研究方向为乳品工 艺；*通讯作者：张和平； 基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划， No.2007AA10Z353）及现代农业体系建设项目。 疾病等[1,2]。目前，乳杆菌和双歧杆菌被认为是最 常见和最常用的潜在益生菌。 干酪乳杆菌 Zhang（L.casei Zhang）是我国 第一个获得具有自主知识产权的乳酸菌全基因组 序列和首次对该菌株蛋白组学进行了较系统研究 的益生菌[3]。该菌株具有良好的耐酸性、人工胃 肠液耐受性及胆盐耐受性[4,5]，对免疫系统具有显 著的调节作用[6,7]，饲喂该菌体能显著降低高脂血 症大鼠血清胆固醇和低密度脂蛋白含量[8]，显著 2 张 青等：益生菌干酪乳杆菌 Zhang 和双歧杆菌 V9 发酵豆乳的研究   促进小鼠肠道粘膜免疫[9]，提高大鼠体内抗氧化 的作用[10]。同时，Guo 等人[5]研究发现，L.casei Zhang 在发酵乳中具有很好的贮藏稳定性。Wu 和 Zhang[3,11]应用分子手段进一步验证了 L.casei Zhang 具有耐酸耐胆盐的特性。 双歧杆菌可抑制有害菌群、维持肠道菌群平 衡、保护肠粘膜屏障、代谢产生有机酸、促进肠 道蠕动、腹泻便秘双重调节[12]。高鹏飞[13]等从健 康蒙古族儿童粪便中分离得到 11 株双歧杆菌， 其中双歧杆菌 V9（B.animalis V9）具有较强的耐 酸和耐胆盐性，在 pH 2.0 的人工胃液和 pH 8.0 的人工肠液中具有很高的存活率。B.animalis V9 对致病菌株（志贺氏痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓 杆菌和埃希氏大肠杆菌）具有一定程度的拮抗作 用，可以有效治疗小鼠的腹泻[14]。 目前，市场上活性益生菌饮品以单一益生菌 为主（如养乐多、饮乐多等），且基本以牛乳制 品为载体，这对消费者而言，可供选择的种类单 一，尤其对牛乳过敏的消费者和素食主义者更是 望而却步。豆乳含有丰富的低聚糖，是促乳酸菌 特别是双歧杆菌生长的良好益生元[1]。因此，含 有益生菌的发酵豆乳制品将有潜在的市场发展 前景。本研究以豆乳为载体，将 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 结合，研究二者在豆乳中的生长情 况及其在豆乳饮料中的存活稳定性，为 L.casei Zhang和B.animalis V9进一步应用于实际生产提 供理论依据，从而也为丰富益生菌产品市场提供 参考。 1 材料与方法 1.1 材料 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 直投式发酵 剂：均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教 育部重点实验室提供，二者活菌数分别为 2.0×1011 cfu/g 和 1.33×1011 cfu/g。 脱脂脱腥大豆粉：购自山东万得福实业集团 有限公司（蛋白质含量为 55.0 %（w/w），碳水 化合物含量为 34.0 %（w/w））。 1.2 主要试剂和仪器 雷磁 PHS-3C 型 pH 计（上海精密科学仪器 有限公司）；NSC-ⅡA-1200 型无菌工作台（日 本）；TGL-168型高速台式离心机（德国Eppendorf 公司）；Cary 300 紫外分光光度仪（美国 Varian 公司）。 1.3 方法 1.3.1 发酵豆乳的制作 复原豆乳（脱脂脱腥大豆粉为 6 %，葡萄糖 为 1.5 %）预热至 65 ℃，20 MPa 均质，95℃ 5 min 杀菌，冷却至 37 ℃并接入发酵剂（添加量见表 1），37 ℃恒温培养至 pH 4.2 时，终止发酵并迅 速于冰水浴中冷却至 4 ℃备用。 表 1 L.casei Zhang 与 B.animalis V9 添加量 菌种 添加量/(cfu/g 豆乳) 接菌量/(w/w) L.casei Zhang 2.0×106 0.001% B.animalis V9 2.0×106 0.0015% L.casei Zhang＋B.animalis V9 (1.0×106)＋(1.0×106) 0.0005%＋0.00075% 1.3.2 活性豆乳饮料的制作 糖液制备：白砂糖与稳定剂干混后用适量水 溶解，95℃ 5 min 杀菌后冷却至 20 ℃，备用。 酸液制备：柠檬酸与乳酸以一定比例混合配 成 20 %溶液，95℃ 5 min 杀菌后冷却至 20 ℃，备 用。 将 1.3.1 中的发酵豆乳和糖液以一定比例混合 控制发酵豆乳饮料蛋白质含量为 2.0 %（w/w）， 以酸液调节最终 pH 至 4.1，无菌条件 20 MPa 下均 质，灌装于灭菌瓶中，制成的活性豆乳饮料于 4 ℃ 贮藏 28 d，平行试验重复 3 次。 1.3.3 豆乳发酵及其活性饮料贮藏期间化学及微 生物特性研究 豆乳 37 ℃恒温培养期间，每 3 h 测定其 pH、 滴定酸度（TA）及游离氨基氮（FAN）变化。 活性豆乳饮料 4 ℃贮藏期间，于 1 d、7 d、 14 d、21 d 和 28 d 分别取样测定 pH、TA、FAN 及活菌数变化。 1.3.4 pH 值的测定 采用精密 pH 计测量。 1.3.5 滴定酸度的测定 准确称量 5.00 g 发酵豆乳样品，置于 100 mL 三角瓶中，加入 40 mL 去 CO2 水，再加入 0.5 mL 的 0.5 %酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定至微红色在 1 min 内不消 失为止。消耗的 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液毫升 数除以样品克数，再乘以 100，即得酸度（°T）[15]， 取 3 次测定的算术平均值。                                               《乳业科学与技术》        2010 年第 1 期       （总第 140 期）                                          3  1.3.6 游离氨基氮质量浓度的测定 游离氨基氮（FAN）的测定采用邻苯二甲醛 衍生比色法，参照Lemieux等 [16]和Church等 [17] 的方法，在340 nm下用分光光度计测定吸光值， 确定游离氨基氮质量浓度。 1.3.7 活菌数的测定 0.5 mL活性豆乳饮料样品，用1 %（w/v）灭 菌蛋白胨水梯度稀释至一定浓度后，采用MRS培 养基平板倾注法，测定发酵豆乳饮料样品中 L.casei Zhang的活菌数。采用TPY培养基平板倾注 法，测定发酵豆乳饮料样品中B.animalis V9的活菌 数。 1.4 数据统计分析 试验数据采用SAS ANOVA程序进行方差分 析，p<0.05[18]，采用origin 7.0软件作图。 2 结果分析 2.1 豆乳发酵过程中化学变化 2.1.1 pH 及 TA 变化 单独和混合接种 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 的豆乳样品，在 37 ℃发酵过程中，pH 和 TA 变化如图 1（a）和图 2（a）所示。 图 1 L.casei Zhang（■）和 B.animalis V9（◇）单独发酵及 混合发酵（▲）样品在发酵及贮藏期间 pH 变化 由图 1（a）和图 2（a）可知，L.casei Zhang、 B.animalis V9 单独及混合发酵的豆乳样品，其 pH 达到 4.2 时所需时间分别为 16、21 和 17 h，说明 1:1 混合发酵速率快于 B.animalis V9 单独发酵。混 合发酵至 12 h 时，豆乳样品的 pH（4.53）显著低 于单独发酵，TA（68 °T）显著高于单独发酵。此 后至发酵结束，B.animalis V9 在豆乳中生长趋缓， 其样品pH值和TA变化显著低于其他两组样品pH 和 TA 变化。说明 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 复配在豆乳中的生长显著好于 B.animalis V9 单独 在豆乳中的生长。Wang[19]和 Chou[20]等研究发现， 不同种的双歧杆菌在豆乳中生长的产酸能力不 同，如 B.infantis 的产酸能力好于 B.longum。 Samona[21]等以酸奶发酵剂和双歧杆菌发酵牛乳， 发现 pH值和TA的变化随 2者的复配比例而变化。 Wang[19]等研究发现，将嗜酸乳杆菌和双歧杆菌复 配发酵豆乳时，其 pH 值的降低程度显著大于双歧 杆菌单独发酵豆乳，这一点与我们的研究结果相 似。 图 2 L.casei Zhang（■）和 B.animalis V9（◇）单独发酵及 混合发酵（▲）样品在发酵及贮藏期间 TA 值变化   4 张 青等：益生菌干酪乳杆菌 Zhang 和双歧杆菌 V9 发酵豆乳的研究                        2.1.2 FAN 变化 单独和混合接种 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 的豆乳样品，在 37 ℃发酵过程中，FAN 的变 化如图 3（a）所示。 图 3 L.casei Zhang（○）和 B.animalis V9（ᇞ）单独及混合 发酵（■）样品在发酵及贮藏期间 FAN 的变化 如图3（a）所示，L.casei Zhang和B.animalis V9 单独及混合37 ℃发酵豆乳过程中，样品游离氨基 氮在发酵初期缓慢增加，6 h~9 h显著增加。9 h开 始L.casei Zhang单独发酵的豆乳样品游离氨基氮 增加趋缓。发酵12 h后，B.animalis V9发酵的豆乳 样品游离氨基氮含量显著高于其他两组样品，显 示了B.animalis V9比L.casei Zhang有较好的蛋白 水解活性。研究表明，双歧杆菌比其他菌株有很 好的蛋白水解能力[22,23]。Donkor[22]等人研究认为， 乳酸菌首先利用胞外蛋白酶将发酵乳中酪蛋白水 解成许多寡肽，胞外蛋白酶将寡肽进一步水解成 乳酸菌生长所需要的必须氨基酸和肽段。 2.2 活性豆乳饮料贮藏期间化学及微生物变化 2.2.1 pH 值和滴定酸度的变化 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 单独和混合发 酵的酸豆乳制成的活性豆乳饮料，在 4 ℃贮藏期 间，pH 和 TA 变化如图 1（b）和图 2（b）所示。 在 4 ℃贮藏 28 d 过程中，B.animalis V9 单独发酵 活性豆乳饮料样品的 pH 和 TA 变化不明显 （p>0.05），而 L.casei Zhang 单独及与 B.animalis V9 混合发酵活性豆乳饮料样品的 pH 显著降低， TA 显著升高（p<0.05）。Kamaly[24]用双歧杆菌发 酵酸乳，其在贮藏期间 pH 几乎保持不变。已有研 究表明，由 L.casei Zhang 发酵的豆乳及牛乳在贮 藏过程中 pH 持续下降[25]，且 L.casei Zhang 在其 中保持很好的稳定性。本试验中 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 制作的活性豆乳饮料贮藏期间酸度 的变化也得到了相同的结果。 2.2.2 FAN 变化 如图3（b）所示，1 d~7 d贮藏期间，含有L.casei Zhang和B.animalis V9的活性豆乳饮料中的FAN快 速下降，7 d~28 d期间游离氨基氮变化不明显，基 本 保 持 不 变 （ p>0.05 ）， 而 L.casei Zhang 和 B.animalis V9混合发酵的活性豆乳饮料中的游离 氨基氮含量在7 d~28 d有所上升。Kamaly[24]认为菌 株的蛋白水解活性与其利用碳水化合物的程度有 关。通过糖代谢试验可知L.casei Zhang不从棉子糖 产酸[25]，而B.animalis V9能够发酵棉籽糖[13]。这 可能就是B.animalis V9发酵的豆乳及其活性豆乳 饮料游离氨基氮含量较L.casei Zhang发酵豆乳高 的原因之一。 2.2.3 活菌数变化 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 在其活性豆乳 饮料 4 ℃贮藏过程中活菌数如表 2 所示。虽然整 个贮藏过程中活性豆乳饮料样品中活菌数都有不 同程度的下降，其中 B.animalis V9 活菌数的下降 显著高于 L.casei Zhang，但 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 在 28 d 储藏结束时单独及混合发酵 豆乳饮料时活菌数分别是 2.28×109 cfu/g、4.27×108 cfu/g、1.56×109 cfu/g 和 2.8×108 cfu/g。 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 在单独发酵活 性豆乳饮料中活菌数与它们在混合发酵中活菌数 没有显著差异，这就说明在同样接菌量的条件下， L.casei Zhang 和 B.animalis V9 混合发酵达到了双 倍的效果。而且由发酵终点 pH 值可知混合发酵可 缩短发酵时间，对实际生产很有意义。已有研究 表明，双歧杆菌在活性豆乳饮料中的存活性较其 他乳酸菌低[19,20]，我们的研究也了这一点。 作为评价益生菌的一个重要指标，贮藏期间益生 菌在载体中活菌数至少达到 106 cfu/g 以上，才能 够发挥其益生作用[26]。在整个贮藏过程中，L.casei Zhang 和 B.animalis V9 单独及混合发酵豆乳饮料 中活菌数都在 108 cfu/g 以上，远远超过 106 cfu/g， 保持了良好的稳定性。                                               《乳业科学与技术》        2010年第 1期       （总第 140期）                                          5  表 2 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 在豆乳饮料的贮藏过程中活菌数测定结果（n＝3, x±SD） 贮藏过程中的活菌数/log(cfu/g) 发酵菌株 1 d 7 d 14 d 21 d 28 d L. casei Zhang 9.36±0.00b,B 9.51±0.00a,A 9.34±0.02a,B 9.24±0.01a,C 9.36±0.01a,B B.animalis V9 9.20±0.01d,A 8.74±0.01c,C 8.81±0.03c,B 8.72±0.04b,C 8.63±0.03c,D 混合发酵中 L.casei Zhang 9.27±0.01c,A 9.21±0.01b,B 9.25±0.02b,A 9.25±0.02a,A 9.19±0.01b,B 混合发酵中 B.animalis V9 9.68±0.01a,A 8.53±0.02d,B 8.50±0.07d,B 8.34±0.15c,BC 8.45±0.03d,C 注：abcd 含有不同字母的每列数据差异显著（p<0.05）；ABCD含有不同字母的每行数据差异显著（p<0.05） 3 结论 本次试验利用益生菌 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 单独及混合发酵豆乳并以发酵 豆乳制成了活性豆乳饮料，研究其在豆乳发酵 过程中的生长及活性豆乳饮料贮藏期间的存 活性。研究发现，L.casei Zhang和B.animalis V9 在豆乳中生长良好，且以 1:1 混合接种发酵可 有效缩短发酵时间。在贮藏期间 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 的活菌数均可在 108 cfu/g 以 上，并保持良好的稳定性。这些特性初步显示 了 L.casei Zhang 和 B.animalis V9 应用于发酵 豆乳制品中具有良好的潜力。 参考文献 [1] 张勇, 刘勇, 张和平. 世界益生菌产品研究和发展趋势[J]. 中 国微生态学杂志, 2009, 21(2): 185-193. 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