第七章 微生物的遗传

null第七章 微生物的遗传变异和育种第七章 微生物的遗传变异和育种生物科学专业研究微生物遗传学的意义研究微生物遗传学的意义微生物是现代遗传学、分子生物学和其它许多重要的生物学基础研究中最热衷选用的模式生物。 个体结构简单；营养体多为单倍体；易于在成分简单的合成培养基上生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对各个体作用具有直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。null为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快？ 根据化石显示，单细胞生物于35亿年前首次出现在地球上，但是之后它们用了大约25亿年进化成多细胞生物，剩下的10亿年却发展成了植物、哺乳动物、昆虫、鸟类等各种各样的地球物种。 Rice大学科学家的研究结果可望解决这一问题，他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和病毒不断在不同物种之间传递DNA，如果没有这种作用，只依靠基因突变和两性选择作用是不会达到如此快速度的。null对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。null在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。 遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。null遗传(heredity)：亲代的性状在子代现出来，使子代与亲代有相似的现象，叫遗传。从分子水平上讲，遗传就是遗传信息的复制和表达。 特点：具稳定性。 遗传型（genotype）：又称基因型，生物体所携带的全部遗传因子或基因的总称；是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型（phenotype）：具有一定遗传型的个体，在特定的外界环境中，通过生长发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和。遗传与变异的概念 代谢 发育null饰变（modification）：指相同遗传型的生物，在不同的外界环境下，会呈现出不同的表型，即不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点： a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化； b.性状变化的幅度小； c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。 引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。 例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念null变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。 特点: a.在群体中出现几率极低，（一般为10-5～10-10） b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。遗传与变异的概念null第一节 遗传变异的物质基础null 1883~1889年间，Weissmann提出种质连续理论，认为遗传 物质是一种具有特定分子结构的化合物。 20世纪初，发现了染色体并提出了基因学说，使遗传物质 基础的范围缩小到染色体上，并证明染色体是由核酸和蛋 白质组成的。 1944年后，连续利用微生物这一有利的实验对象进行了3个 著名的实验，并证实核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正 物质基础。 围绕遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，曾有过种种推测和争论。一、3个经典实验一、3个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验（一）经典转化实验（一）经典转化实验最早进行转化实验的是英国的F. Griffith，他以肺炎链球菌作为研究对象。肺炎链球菌可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡。 肺炎链球菌有许多不同的菌株，有的具有荚膜，菌落表面光滑，故称S型，属致病菌株；有的不形成荚膜，菌落外观粗糙，故称R型，属非致病菌株。null多糖类荚膜（1）动物试验null将R型活菌注入小鼠体内一段时间后null将S型活菌注入小鼠体内一段时间后null将杀死的S型菌注入小鼠体内一段时间后null将R型活菌与杀死的S型菌注入小鼠体内一段时间后细菌发生转化，性状的转化可以遗传。null（2）细菌培养试验 热死S菌—————不生长 活 R 菌—————长出R菌 热死S菌—————长出大量R菌和少量S菌 （3）S型菌的无细胞抽提液试验 活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌平皿培养+活R菌null实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。null1944年O.T.Avery等从热死S型pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分,并在离体条件下进行了转化试验:nullAvery的实验说明： 只有S型细菌的DNA才能将pneumoniae的R型转化为S型；且DNA纯度越高，转化效率也越高。 也说明S型菌株转移给R型菌株的决不是遗传性状的本身，而是以DNA为物质基础的遗传信息。null（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验null1952年，Hershey和Chase利用示踪元素，对大肠杆菌 T2 噬菌体进行实验，发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验――噬菌体感染实验。 首先，将E.coli（大肠杆菌）培养在以放射性32PO43–或35SO42–作为磷源或硫源的组合培养基中。结果，可以获得含32P-DNA(噬菌体核心)的或含35S-蛋白质(噬菌体外壳)的两种实验用噬菌体。将这两种不同标记的病毒分别与其宿主大肠杆菌混合。null结果发现，用含有35S-蛋白质的T2噬菌体感染大肠杆菌时，大多数放射活性留在宿主细胞的外边。而用含有32P-DNA 的T2噬菌体与宿主细菌混合时，则发现32P-DNA 注入宿主细胞。nullnull噬菌体DNA 在宿主细胞内能产生噬菌体后代，这些T2噬菌体后代的蛋白质外壳的组成、形状大小等特性均与留在细胞外的蛋白质外壳一模一样。 说明决定蛋白质外壳的遗传信息是在DNA上，DNA携带有T2的全部遗传信息。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质， 1956年，美国科学家法朗克－康勒特H. Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒的拆开与重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离，然后，用RNA和蛋白质分别去感染烟草。 分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。null选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： （1）RNA（TMV）­ 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV）­ 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。null结　论结　论 通过这三个具有历史意义的经典实验，得到一个确信无疑的共同结论： 只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。null核酸是一切生物的遗传物质，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），绝大多数生物都是以DNA作为遗传物质的，因此DNA是主要的遗传物质。二、遗传物质在细胞中的存在方式 二、遗传物质在细胞中的存在方式 这里从七个水平来讨论遗传物质在细胞中存在的部位和方式。 （一）7个水平 1、细胞水平 大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核区中。 2、细胞核水平 核内染色体（核基因组），核外染色体（真核质粒、质体－线粒体、叶绿体；原核质粒）null3、染色体水平 每种生物的染色体无论是数目还是套数都不一样。 4、核酸水平 绝大多数生物的遗传物质是DNA，只有部分病毒的遗传物质才是RNA。在核酸的结构上，绝大多数微生物的DNA是双链的，只有少数病毒的核酸为单链结构。 5、基因水平 在生物体内，一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，都可称为基因。基因的物质基础是一条具有特定核苷酸顺序的核酸片段。null原核生物的基因是通过组成以下的调控系统而发挥作用的： 启动基因 操纵子 操纵基因 基因调控系统 结构基因 调节基因 nullnull6、密码子水平 遗传密码就是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。每个密码子是由三个核苷酸顺序所决定的，它是负载遗传信息的基本单位。 7、核苷酸水平 核苷酸水平是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多数生物的DNA组分中，都只含腺苷酸（AMP）、胸苷酸（TMP）、鸟苷酸（GMP）和胞苷酸（CMP）4种脱氧核苷酸。但也有少数例外，它们含有一些稀有碱基。null（二）原核生物的质粒（二）原核生物的质粒 1、定义和特点 质粒（plasmid） 是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。 通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中。 分子量一般在106～108，大小约为1%核基因组。携带有某些染色体上所没有的基因，赋予细胞某些特殊功能，例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等。nullnull可转移性：某些质粒可以通过细胞间的接合作用或其他途径在不同菌株间发生转移，如F因子、R因子等。 可整合性：在某种特定条件下，质粒DNA可以可逆性地整合到宿主细胞染色体上。 可重组性：不同来源的质粒之间及质粒与宿主细胞核染色体之间的基因可以发生重组。 可消除性：遇吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素，可使质粒的复制受到抑制而核染色体的复制继续进行，子代细胞中质粒消失。null根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与核染色体DNA复制相伴随，一般一个寄主细胞内只有少数几个（1 ~ 2）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10 ~ 15个或更多。null质粒的分离一般包括细胞的裂解、蛋白质和RNA的去除以及设法使质粒DNA与染色体DNA相分离等步骤，其中最后一步尤为关键。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法。2、质粒的主要类型2、质粒的主要类型（1）F质粒 又称F因子、致育因子 是E.coil等细菌决定性别并有转移能力的质粒。 大小约为100kb，相当于2 %核染色体DNA的环状双链DNA，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中。null（2）R质粒 又称R因子、抗性因子 主要包括抗药性和抗重金属两大类 多数由相连的两个DNA片段组成。一部分称抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF），包括质粒的复制和转移基因，具有转移功能；另一部分称为抗性决定子（r-determinant），含多种抗生素的抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。其本身不能移动，只有在RTF推动下才能转移。 由RTF和r决定子结合形成R质粒。null带有抗药性因子（R因子）的细菌对几种抗生素或其他几种药物呈现抗药性。 许多R质粒能使宿主细胞对许多金属离子呈现抗性，包括碲（Te6+）、砷（As3+）、汞（Hg2+）、镍（Ni2+）、钴（Co2+）、银（Ag+）及镉（Cd2+）等。null（3）Col因子 又称大肠杆菌素质粒 Col因子含有编码大肠杆菌素的基因。 大肠杆菌素是产自E.coli的一种细菌素，具有专一地杀死其亲缘关系很近，且不含有Col因子的其它肠道细菌的功能，而宿主不受其产生的细菌素的影响。 根据Col因子是否具有转移能力可分为两类。 一类相对分子质量小，无接合作用，是松弛型控制，是多拷贝的；缺乏自身传递的遗传结构 。 另一类相对分子质量大，与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有1-2个拷贝。null（4）毒性质粒 携带编码产生毒素的基因。 如：产毒素大肠杆菌是引起人和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或几种肠毒素编码的质粒。 有些使昆虫致病乃至死亡的细菌毒素也是由质粒编码的。如苏云金杆菌含有编码δ内毒素的质粒。null（5）降解性质粒 携带有能降解某些基质的酶的基因，如假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式。尤其是对一些有毒化合物，如农药、辛烷和樟脑等的降解，在环境保护方面具有重要的意义。 这些质粒以其所降解的底物命名，例如有CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。null（6）Ti质粒 即诱癌质粒 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵入到双子叶植物细胞中，Ti质粒的T-DNA片段会与植物细胞核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，转变成癌细胞。 是植物遗传工程研究的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，进一步整合到植物染色体上，改变该植物遗传性，达到培育优良品种的目的。null第二节 基因突变和诱变育种一、基因突变（geng mutation）一、基因突变（geng mutation）基因突变：是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换而导致的遗传变化，其发生变化的范围很小，所以又称为点突变或狭义的突变。 广义的突变：包括基因突变和染色体畸变。 染色体畸变是指DNA链上大段发生变化或损伤所引起的突变类型，包括染色体在结构上的缺失、重复、倒位、插入、置换等。null微生物的基因突变包括自发突变和诱发突变。 从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株，简称野生型。 野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称为突变株或突变型。 （一）、基因突变的类型（一）、基因突变的类型基因突变的类型是多种多样的，根据突变的表型不同，可分为以下几种类型：　 营养缺陷型 抗性突变型 条件致死突变型 形态突变型 抗原突变型 产量突变型1、营养缺陷型（auxotroph)1、营养缺陷型（auxotroph) 某一野生型菌株由于基因突变丧失了合成自身生存所必需的一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物质才能生长的一种突变型。 无法在基本培养基中正常生长、 繁殖、只能在加有相应营养物 质的基本培养基上生长 null2、抗性突变型（resistant mutant）2、抗性突变型（resistant mutant）是一类能抵抗有害理化因素的突变型 分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变类型。 可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。 抗性突变型普遍存在，例如对一些抗生素具抗药性的菌株等3、条件致死突变型（conditional lethal mutant）3、条件致死突变型（conditional lethal mutant）是指某菌株或病毒经基因突变后，在某一条件下具有致死效应，而在另一种条件下没有致死效应的突变类型。 这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因。 因为这类基因一旦发生突变是致死的，因而也就不可能得到这些基因的突变。null温度敏感突变株（Ts突变株）：是一类典型的条件致死突变株例如T4噬菌体突变株在25℃ 下可感染宿主大肠杆菌， 而在37℃时却不能感染 大肠杆菌的某些菌株在 37℃下正常生长，而 在42℃下却不能生长 null 突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生 改变，以致会在某特定温度下具有功能，而在 另一温度下则无功能 4、形态突变型（morphological mutant） 指造成形态改变的突变型，包括影响 细胞和菌落形态、颜色以及影响噬菌体的 噬菌斑形态的突变型。 是一类非选择性突变，形态突变和非 突变类型均同样生长在平板上，只能靠 看得见的形态变化筛选 4、形态突变型（morphological mutant）null选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。5、抗原突变型（antigenic mutant）5、抗原突变型（antigenic mutant）指由于基因突变而引起的抗原结构发生的变异类型。 具体类型很多，包括细胞壁缺陷变异、荚膜变异或鞭毛变异等 属非选择性突变6、产量突变型（metabolite quantitative mutant)6、产量突变型（metabolite quantitative mutant)通过基因突变而获得的在有用代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。 若产量显著高于原始菌株者，称为正变株，反之则称负变株。 筛选高产正变株的工作对生产实践异常重要。（二）、基因突变的特点（二）、基因突变的特点自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 通常认为：突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。基因突变的自发性和不对应性的证明基因突变的自发性和不对应性的证明从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，证明了在接触抗性因子前便已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。 3个著名实验 变量试验(fluctuation test) 涂布试验(Newcombe experiment) 影印平板培养试验(replica plating)1、变量试验 又称波动试验1、变量试验 又称波动试验1943年，S. E. Luria 和M. Delbrück 根据统计学原理，设计了变量试验。2、Newcombe的涂布试验2、Newcombe的涂布试验原理与变量试验相同，方法更为简便。3、影印平板培养法3、影印平板培养法1952年，J. Lederberg夫妇的论文《影印平板培养法和细菌突变株的间接选择》，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。null通过影印培养试验证明链霉素的存在和抗药性突变的发生无关突变与选择证明实验 影印培养 replica plating (Lederberg 1952)突变与选择证明实验 影印培养 replica plating (Lederberg 1952)证明：耐药突变是自发的、随机的，药物只起选择作用null稀有性：自发突变的频率（突变率）低且稳定。一般在10-6~10-9间 所谓突变率是指每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 独立性：突变一般是独立发生的，某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。 可诱变性：诱变剂可提高突变率，但不改变突变的本质。 稳定性：变异性状稳定、可遗传的。null可逆性：由原始野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变（forward mutation）， 反之称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。 实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。 规律性：特定微生物的某一特定性状的突变率具有一定的规律性。（三）基因突变及其机制（三）基因突变及其机制基因突变的机制是多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为点突变和畸变。null1、诱发突变（induced mutation） 是指通过人为的方法，利用物理、化学或 生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。 注诱发突变不是用诱变剂 产生新的突变,而是通过不 同的方式提高突变率 诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，都称为诱变剂。null（1）碱基的置换（substitution） 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 转换（transition）：DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换。 颠换（transversion）：一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。 null碱基变化与遗传信息的改变null错义突变：是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。 无义突变：是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子（UAA，UAG，UGA）。蛋白质合成提前终止，产生截短的蛋白质。 同义突变：是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。null一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂等。 亚硝酸能引起含有NH2的碱基（A、G、C）产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变。 使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U ），从而发生转换；也可使鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤（X），但仍和胞嘧啶（C）配对，不引起碱基转换。直接引起置换的诱变剂null① 腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He） ② He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK） ③ DNA复制时，HK 与胞嘧啶（C）配对 ④ DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现转换腺嘌呤（A）→次黄嘌呤（H）后引起的转换过程null羟胺（NH2OH）能专一地与胞嘧啶发生反应，引起GC→AT的转换。 羟胺引起的转换是单向的，无法引起TA→CG的碱基转换。C‥GC-NH2 ‥ GC-NH2 ‥ A C ‥ GC-NH2 ‥ AT ‥ Anull烷化剂（alkyating agent）是一类极其重要的诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基。它们的烷基可以转移至其他分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中碱基或磷酸作用。 烷化作用导致基因突变的机制尚未定论。① 碱基类似物作用，引起碱基配对的错误。② 烷基在鸟嘌呤引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从DNA 链上脱落下来，进而引起DNA复制时碱基对的缺失和置换。null这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）和2-氨基嘌呤（腺嘌呤结构类似物）等。 作用方式：通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中，而不妨碍DNA的正常复制。在DNA复制时错误地插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。 以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的类似物 ，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。间接引起置换的诱变剂5-BU引起的转换5-BU引起的转换null从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的G┇C回复到A׃T的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。 也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。null （2）移码突变（frame-shift mutation ） 指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增加（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。 与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。 吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和α-氨基吖啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。nullnull （3）染色体畸变 某些强烈理化因子引起DNA 分子大段的变化或损伤。包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。 理化因子如X射线等的电离辐射及烷化剂、亚硝酸等。 注意：许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的。例如，亚硝酸既能引起碱基对的转换作用，又能诱发染色体畸变；一些电离辐射也可同时引起基因突变和染色体畸变。null染色体结构变化，分染色体内畸变和染色体间畸变。前者只涉及一条染色体，后者非同源染色体间的易位。 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加； 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。 倒位--是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反； 易位--是指断裂下来的一小段染色体连接到另一条非同源染色体上。null缺失环重复环相互易位null2、自发突变（spontaneous mutation)定义：指生物体在无外界诱变剂作用而自然发生的低频率突变。 原因: ①背景辐射和环境因素引起 ②微生物自身有害代谢产物引起 ③互变异构效应导致的碱基配对错误 ④环出效应null互变异构效应 胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现； 胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）的第六位上是氨基，会以氨基或亚氨基两种互变异构的状态出现。 一般趋向于酮式或氨基式，在DNA双链结构中一般总是以A-T和G-C碱基配对的形式出现。 null在DNA复制时，当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，与胸腺嘧啶进行正常配对（A-T），如果以亚氨基形式出现，则与胞嘧啶配对，那么经复制DNA分子中的A-T碱基对就变成了G-C，造成自发突变。 胸腺嘧啶也可因为由酮式到烯醇式的异构作用将碱基对由原来的A-T变成G-C，即鸟嘌呤取代了腺嘌呤，经复制后便导致AT→GC的转变。 碱基对发生自发突变的几率约为10 –8 ~ 10 – 9。null在复制过程中，由于互变异构作用产生的突变：鸟嘌呤的暂时烯醇式导致突变中的AT碱基配对形成，并发生GC到AT的转换突变。null环出效应 在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。右图就是环出效应的设想机制。在上链中，标记B处发生“环出”，故只有A及C能获得复制， 从而发生自发突变。而在下链中，复制仍正常进行（四）紫外线对DNA的损伤及其修复（四）紫外线对DNA的损伤及其修复DNA由于各种原因而受到损伤，这些损伤可由微生物本身存在于细胞内的各种修复系统加以修复。研究比较详细的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）引起的嘧啶二聚体的修复。 紫外线的主要作用是相邻碱基形成二聚体阻碍碱基间的正常配对，从而导致碱基置换突变或死亡。1、光复活作用（photoreactivation）1、光复活作用（photoreactivation）定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可出现明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 修复机制：在微生物细胞内存在光解酶，此酶在黑暗中专一地识别嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，当给予可见光光照时，酶利用光能将二聚体解离，恢复原状，酶再释放出来。 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及后续操作，放置在黑暗条件下培养。nullnull根据突变的光修复作用、原理，你认为在进行紫外线诱变处理时，应注意什么？为了使被诱变的细胞均匀地受到紫外线照射，你将如何做？ 答：处理时注意避光，以防光复活修复作用。在红光下操作，黑暗中培养。在紫外线照射时，盛菌液的培养皿应置于磁力搅拌器上，边照射边搅拌使细胞能均匀的受到紫外线照射。 问题2、切除修复（excision repair）2、切除修复（excision repair）又称暗修复，是一种不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。 有四种酶参与 ①内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口； ②外切核酸酶从5’-P至3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口； ③DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从3’-OH末端重新合成缺失的DNA片段来填补切除后的空隙； ④通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端与原链的5’-P末端相连接，从而完成了修复作用。null修复酶结合到DNA上酶检测到由于形成的二聚体产生的扭曲该酶的内切酶活性切去受损的DNA链，其切除的范围以二聚体为中心向其5’端切除4个核苷酸3’端切除4~5个核苷酸。DNA聚合酶Ⅰ填充形成的缺口，DNA连接酶弥合它们之间的切口3、重组修复 （recombination repair)3、重组修复 （recombination repair)是一种越过损伤而进行的修复 这种修复不是将损伤碱基去除，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空缺部位由母链弥补，母链失去的部分则由DNA聚合酶和连接酶修复。4、SOS修复（SOS repair）4、SOS修复（SOS repair）SOS修复是在DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。 涉及到一批修复基因：切除修复基因uvrA、uvrB、uvrC 、重组基因recA以及lexA等。 正常的SOS系统被LexA蛋白所抑制，DNA损伤时激活RecA蛋白酶活性，使LexA蛋白失活，从而解脱受抑制的recA和其他修复基因，对形成的二聚体进行切除修复。一旦修复完成，SOS系统关闭。null在正常情况下，修复蛋白的合成 是处于低水平状态的，这是由于它们的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制。细胞中的recA 蛋白也参与了SOS修复。 LexA阻遏物null二、突变与育种二、突变与育种（一）自发突变与育种 1、从生产中育种 2、定向培育优良菌株 采用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。过程十分缓慢，“守株待兔” 。 卡介苗： 结核杆菌 显著减毒的结核杆菌 (即卡介苗) 定向培育230代，13年（二）诱变育种（二）诱变育种诱变育种：是利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种具有极其重要的实践意义。发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。 诱变育种能提高有用代谢产物的产量、改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等，是使用最广泛的育种手段之一。null确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）诱变育种的步骤null诱变育种的基本过程选择合适的出发菌株 ↓ 制备待处理的菌悬液 ↓ 诱变处理 ↓ 分离和筛选 ↓ 保藏和扩大试验1、基本原则1、基本原则（1）出发菌株的挑选 出发菌株是用于育种的起始菌株 出发菌株应具备： ①对诱变剂的敏感性高； ②具有特定生产性状的能力或潜力。 出发菌株的来源： ①自然界直接分离到的野生型菌株： ②历经生产考验的菌株： ③已经历多次育种处理的菌株null（2）敏感期和合适对象的选择 敏感期：要求菌体处于指数生长期、孢子或芽孢的萌发前期； 合适对象：如孢子、芽孢 表型延迟现象（phenotype lag) :指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 处理前制成单孢子或单细胞悬液 目的：分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂，避免长出不纯菌落。null（3）诱变剂的选择 诱变剂的作用： ①提高突变的频率 ②扩大产量变异的幅度 ③使产量变异朝着正突变或负突变移动 选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。Ames test：对化学诱变剂做检测Ames test：对化学诱变剂做检测菌种：鼠伤寒沙门氏菌his-； 原理： his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。 加少量组氨酸的安全培养基含受检的诱变剂和少量组氨酸Ames test 方法示意图Ames test 方法示意图用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品的中致癌物null（4）诱变剂量的选择 凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。 正变较多出现在偏低剂量中，负变则相反；经多次诱变而提高产量的菌株，更容易出现负变。 过去用紫外线作诱变剂，常采用杀菌率为99~99.9%的剂量，近年来倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。null（5）诱变处理方法 诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应，这对育种工作是很有参考价值的。复合处理有几类： ①两种或多种诱变剂的先后使用； ②同一种诱变剂的重复使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用。null（6）突变株的筛选 ①初筛 即粗筛，以量为主。 目的：删除明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来。 ②复筛 以质为主 目的：确认符合生产要求的菌株 变异菌的一般筛选方法 变异菌的一般筛选方法 平皿快速检测法 变色圈法（淀粉酶）、显色圈（氨基酸）； 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 生长圈法（氨基酸、核苷酸和维生素） 抑菌圈法（抗生素）； 梯度平板法 摇瓶培养法（常用于复筛）null四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈2、几种重要突变株的筛选方法2、几种重要突变株的筛选方法营养缺陷型的筛选 抗药性突变株的筛选营养缺陷型(auxotroph)的筛选营养缺陷型(auxotroph)的筛选与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 A 、基本培养基(MM) 与基础培养基不同 仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，称基本培养基。 B 、完全培养基(CM) 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为完全培养基。 C 、补充培养基(SM) 凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为补充培养基。null与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体 A 、野生型： 从自然界分离到的任何微生物在其发生营养突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。 野生型菌株能在其相应的基本培养基上生长。 B 、营养缺陷型： 一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。 它不能在基本培养基上生长，而只能生长在完全培养基或相应的补充培养基上。 C 、原养型： 一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。其营养要求在表型上与野生型相同。营养缺陷型诱变筛选步骤及方法营养缺陷型诱变筛选步骤及方法营养缺陷型的鉴定 诱变处理淘汰野生型营养缺陷型的检出null 中间培养 利用CM或SM培养基，培养过夜。 目的：克服表型延迟。 淘汰野生型 即浓缩营养缺陷型，以提高检出率 方法 抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）淘汰野生型淘汰野生型①抗生素法 原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌体培养在含抗生素的MM基上。null②菌丝过滤法适用于：丝状生长的放线菌和真菌 原理：使能在基本培养基上生长繁殖的野生型留在滤膜上；而不生长的auxo孢子可通过滤膜。 检出营养缺陷型 检出营养缺陷型① 夹层培养法① 夹层培养法 ③ 影印平板培养法 ③ 影印平板培养法null④ 逐个检出法营养缺陷型的鉴定常用生长谱法：快速，直观 测定一般分两步： a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸、哪一种维生素或哪一种碱基) 具体操作:一般采用“滤纸片法” 营养缺陷型的鉴定null抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选方法：梯度平板法（gradient plate） 抗药性突变株的应用： 作为菌株的遗传标记 作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）抗生素抗性变异株的筛选抗生素抗性变异株的筛选null第三节 基因重组和杂交育种null将两个不同性状的个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（gene recombination）。 作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 杂交： 是遗传类型不同的个体相互交配或结合，产生杂种的过程。 重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而杂交是细胞水平上的概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。基因重组的意义基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点： ①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。 ②利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。基因重组的意义基因重组的意义杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。生长快、产量低生长快、产量低生长慢、产量高基因重组生长快、产量高一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组原核微生物的基因重组的方式 转化 转导 接合 原生质体融合主要包括nullnull(1) Transformation, which involves donor DNA free in the environment(2) Transduction, in which the donor DNA transfer is mediated by a virus(3) Conjugation, in which the transfer involves cell-to-cell contact and a conjugative plasmid in the donor cell Three main processes of genetic recombination in prokaryotes fragments of homologous DNA from a donor chromosome are transferred to a recipient cell （一）转化（transformation）（一）转化（transformation）受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化（transformation)。转化后的受体菌，就称转化子（transformant）。 转化发生的条件 ①受体细胞要处于感受态. 感受态（competence）：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态 ②供体DNA片段（转化因子）大小适宜，平均约含15个基因 ③菌株间的亲缘关系密切null感受态 感受态的出现受受体菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件的影响。 出现时间：只在细菌生长的某一时期出现，不同菌种的感受态出现在不同生长时期。 感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2 处理E. coli可以诱发其产生感受态。 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同.null感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白 如S. Pneumonia的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而Bacillus subtilis的感受态因子则无此功能。 转化因子：本质是供体DNA片段 吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。 转化频率：一般只有0.1~1%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）null供体菌的dsDNA片断与感受态受体菌的膜连DNA结合蛋白相结合 一条链被核酸酶水解，另一条进入细胞 来自供体菌的ssDNA片断被细胞内的特异蛋白RecA结合 其与受体菌核染色体上的同源区段配对、重组，形成一小段杂合DNA区段 null转化过程示意图nullnull人工转化 是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。 方法： ①CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态。 ②电穿孔法electroporation：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA ）能通过这些小孔进入细胞。null转染（transfection） 把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染其宿主细胞或原生质体，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染。 与转化的区别： 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌 中间不发生任何遗传因子的交换或整合 最后不产生具有杂种性质的转化子（二）转导（transduction）（二）转导（transduction）通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合。从而使后者获得前者部分遗传形状的现象，称为转导。通过转导作用获得部分新性状的重组细胞，称为转导子。 转导的种类转导的种类 完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导null 1、普遍性转导（generalized transduction） 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。 （1）完全普遍转导 以其野生型菌株作为供体菌 营养缺陷型菌株作为受体菌 P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体null一个稳定的转导子的形成一个稳定的转导子的形成第一次交换 第二次交换 交换完成，外源DNA掺入染色体组中null流产普遍性转导（abortive transduction） 受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而是以游离和稳定的状态存在于细胞质中，能进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。 现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物 — 酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释。null流产转导示意图null 2、局限转导 (specialized transduction) 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。 特点 噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体 只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因） 该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带 缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率（约10 – 5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体） 局限转导噬菌体的产生要通过紫外线等因素对溶源性细菌的诱导并引起裂解后产生。null低频转导（LFT，low frequency transduction） 一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（10 – 4 ~ 10 – 6）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）裂解。 用LFT裂解物以低 m. o. i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。null该溶源菌被诱导裂解时，有极少数（~10–5）的前噬菌体（prophage）发生不正常切离（abnormal excesion），其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E.coli前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体（defective phage）。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。 nullnull高频转导（HFT，high frequency transduction） 当用LFT裂解物以高m. o. i 感染E. coli gal–（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有λdgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的 λ 噬菌体。这时λ 与λdgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌（double lysogen）。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常λ 噬菌体的基因可补偿λdgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常λ 噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helper phage）。 双重溶源菌的裂解物中含有等量的λ 和λdgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。