槟榔促大鼠结肠平滑肌收缩的量效及机制探讨

第 28 卷 第 1 期 2 0 1 0 年 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 28 No. 1 Jan. 2 0 1 0 中 华 中 医 药 学 刊 槟榔促大鼠结肠平滑肌收缩的量效及机制探讨 吕 涛，魏睦新 (南京医科大学第一附属医院中医科，江苏 南京 210029) 摘 要:目的:观察槟榔对离体大鼠结肠平滑肌收缩运动的影响，并初步探讨其机制。方法:制备大鼠结肠平 滑肌肌条，以 9 g /L NaCl溶液 (NS)、槟榔为对照组，分别记录单独使用槟榔和阻断剂(酚妥拉明、维拉帕米和阿 托品)孵育后槟榔引起的收缩效应。结果:不同浓度槟榔对离体大鼠结肠平滑肌的促进作用明显，与 NS 对照组 比较，槟榔 0. 1g /L、1g /L、10g /L浓度时引起的肌条收缩最大振幅和面积均有统计学意义(P < 0. 05) ;与单独槟榔 组比较，阻断剂维拉帕米和阿托品对槟榔引起的肌条收缩有抑制作用，其最大收缩振幅和面积均有统计学意义 (P < 0. 05) ;而阻断剂酚妥拉明对肌条的收缩振幅和面积的影响均无统计学意义 (P > 0. 05)。结论:槟榔对大鼠 结肠平滑肌的收缩活动有兴奋作用，且呈正相剂量关系，引起的收缩效应可被 M 受体阻断剂阿托品和 Ca2 +阻断 剂维拉帕米阻断，而未能被 α －受体阻断剂酚妥拉明阻断。 关键词:中药;槟榔;结肠;平滑肌;促进 中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2010)01 － 0141 － 03 Promotion dose － effect Relationship of Areca Seed on Murine Colonic Smooth Muscle Strips in Vitro and Its Mechanism LU Tao，WEI Mu-xin (Department of Traditional Chinese Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China) Abstract:Objective:To determine the effect of Areca Seed (AS)on murine colonic smooth muscle strips in vitro and to investigate its possible mechanism. Methods:The colonic longitudinal smooth muscle strips of rats were prepared. Con- trol group was treated with sodium chloride (9g /L)and AS. We observed the effects of AS on the spontaneous contrac- tion in muscle strips. We also observed its promotion effects on muscle strips fully incubated with Verapamil，Phento- lamine and Atropine，respectively. Results:AS of different concentrations showed dose － dependent promotion effects on the spontaneous contraction of colonic muscle strips in vitro at the concentration of 1 － 1000g /L. Compared with NS group，the final concentration of AS 0. 1g /L，1g /L and 10g /L，the peak value and area data of smooth muscle strips have significant difference (P < 0. 05). Compared with AS group，the peak value and area data of smooth muscle strips were inhibited in Atropine and Verapami group was inhibited significantly (P < 0. 05) ，but there was no significant difference of the peak and area in Phentolamine group. Conclusion:AS showed promotion effects on spontaneous contraction of murine colonic smooth muscle strips in vitro. Its possible inhibitory mechanism has close relations with the calcium and perhaps with the M － cholinergic receptor，but has little relation with the α － adrenoceptor receptor. Key words:Chinese medicine;Areca Seed;promotion effects;smooth muscles;colon 收稿日期:2009 － 09 － 15 基金项目:江苏省兴卫工程中医药领军人才基金资助项目(苏卫规 财 2007 /158) ;江苏省六大人才高峰专项基金(07 － B － 015 IB07) 作者简介:吕涛(1980 －) ，男，安徽宿州人，主治医师，硕士研究生， 从事中西医结合消化胃肠动力研究。 通讯作者:魏睦新(1959 －) ，男，教授，博士研究生导师。E-mail: weimuxin@ njmu. edu. cn。 近年来，胃肠动力学异常性疾病 (包括由胃炎、胃溃疡 等其他胃肠道疾病所引起的胃肠动力学异常)的发病率逐 年升高，但临床常用的促胃肠动力药物的疗效尚不够理想， 且有一定的不良反应。胃肠功能障碍属于中医学“胃脘 痛”、“痞满”等病证范畴，认为脾胃虚弱、气机阻滞、升降失 司是该病的主要病机，主要涉及脾、胃、肝等脏腑功能的失 调。由于中医药通过辨证施治，能调整脏腑、阴阳、气机的 失衡，使其临床上改善消化道症状的疗效显著，且不良反应 小，中药对胃肠运动的调节作用逐渐受到人们的关注。 传统中医学认为槟榔有杀虫、消积、行气化湿、利湿通 便的功用，主要治疗食积气滞、腹痛胀满、腹水、痢疾、虫证 等病证，临床主要作为杀虫药使用。长期临床应用及研究 显示槟榔可增加胃肠平滑肌张力，增加肠蠕动，促进消化液 141 第 28 卷 第 1 期 2 0 1 0 年 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 28 No. 1 Jan. 2 0 1 0 中 华 中 医 药 学 刊 分泌。笔者课题组对槟榔进行了大量的研究，通过在体灌 胃实验，观察到槟榔对功能性消化不良(FD)模型大鼠胃平 滑肌运动有显著的促进作用［1］，并且有明显升高大鼠的胃 动素(MTL)和降低血管活性肽(VIP)的作用［2］。在离体实 验中，槟榔的提取物氢溴酸槟榔碱(Ah)对豚鼠胃平滑肌条 的收缩活动有明显的兴奋作用［3］，但是对于槟榔的水煎液 的作用如何以及剂量依赖关系等未作进一步的探讨。本实 验以结肠平滑肌为载体，观察槟榔促进作用的量效关系，并 以 3 种不同阻断剂的干预探讨其机制，完善课题组的以往 的研究结果。 1 材料和方法 1. 1 材料 清洁级 SD大鼠 6 只，雌雄各半，体重(200 ± 20)g，南 京医科大学实验动物中心提供;槟榔颗粒(Areca Seed， AS) ，三九医药股份有限公司，批号 20070801。实验前将槟 榔颗粒溶解于纯水，经充分震荡混匀，离心，浓缩上清液，制 备成含生药 1、10、100、1000g /L 4 个梯度的槟榔溶液;氯化 乙酰胆碱 (Ach) ，上海三爱思试剂有限公司，批号 20060328;酚妥拉明(FTLM) ，Novartis Pharma Schweiz AG， Switzerland，批号 S0046;维拉帕米(WLPM) ，上海禾丰制药 有限公司，批号 070901;硫酸阿托品(ATP) ，上海禾丰制药 有限公司，批号 080901;9g /L NaCl溶液 (NS)溶液，南京小 营药业集团有限公司，Krebs 液:NaCl 112. 08mmol，KCl 5. 90mmol，CaCl2 1. 97mmol，MgCl2 1. 18mmol，NaH2 PO4 1. 22 mmol，NaHCO325. 0mmol，Glu 11. 49mmol，所用试剂均为国 产 AR级，实验时新鲜配制，给予 95% O2加 5% CO215min， 调整 pH至 7. 4;微量多导体外器官水平浴槽及配套器材 (日本国立生理研究所) ;JZ101 肌肉张力换能器(新航机电 公司) ;RM －6240 四道生理记录仪(成都仪器厂) ;艾科浦 P系列纯化水机(重庆市颐洋企业发展有限公司) ;洁净工 作台(苏州安泰空气技术有限公司)。 1. 2 方法 1. 2. 1 实验药物槟榔浓度的确定 参照槟榔临床常用剂 量每次 10 g，假设服药后主要成分全部吸收循环到体内，以 此浓度为基准。根据人体与动物的换算标准，确定槟榔的 实验浓度。 1. 2. 2 实验步骤 动物购进后适应性饲养 1 周，每次取 1 只，禁食不禁水 24h，颈椎脱臼处死，开腹，迅速自肛门上 2cm处取长约 8cm 结肠，轻柔洗净，剪成小段置于 4℃ Krebs液中，沿肠系膜剪开结肠，取肠系膜对侧结肠纵肌肌 条 (10mm ×2mm) ，浴槽中同时悬挂 4 根肌条，每根肌条一 端以非弹性细丝固定于浴槽 (容积 10mL)中，另一端与张 力换能器相连。以 1mL /min 的流速持续灌流 Krebs 液，持 续给予 95% O2 加 5% CO2，施加约 500mg 预初张力，平衡 60min，以结肠平滑肌自律性规则、稳定的自发收缩为平衡 标准。 平衡后，滴加药物于浴槽中，加药顺序 NS(空白对 照)、Ach 及 4 个浓度梯度的槟榔，每种药物每次均滴加 100μL，其终末浓度分别为 0. 09g /L，1 × 10 －6mol /L，0. 01g / L、0. 1g /L、1g /L、10g /L，加入药物并记录收缩曲线。药物每 次均重复加 2 ～ 3 次，取均数后作为实验数据。滴加药物时 要等待肌条平衡至基础张力引发的收缩基本回到零位。分 析对象为加药后 5 min内出现的最大收缩振幅 (g)和曲线 下面积 (g·s)。实验数据以最大收缩振幅和曲线下面积 占 Ach引发的收缩百分率示。 重新调整肌条平衡后，以滴加槟榔 100g /L引起的肌条 收缩作为空白对照，5min 后依次滴加酚妥拉明 (终浓度 1 × 10 －5mol /L) ，维拉帕米 (终浓度 1 × 10 －7mol /L) ，阿托品 (终浓度 1 × 10 －6 mol /L)进行孵育，并皆于 1min 后滴加槟 榔 (终浓度 1 g /L) ，每次加入药物并记录收缩曲线 5min， 待波形平衡后再加入下一种药物。对象为加入槟榔后 5min内的收缩曲线，实验数据以最大收缩振幅和曲线下面 积占空白组的百分率表示。 1. 3 统计学方法 数据以所有数值用均数 ±标准差(珋x ± s)表示，并作 One － way ANOVA 统计处理，用 Fisher LSD 法多重比较。 以 Ach组及空白组的观察指标为 100%分别标准化相应的 观察指标作图，以减少实验动物个体差异带来的误差。 2 结 果 2. 1 不同浓度 AS对大鼠结肠平滑肌自发收缩的影响 以 Ach激发的平滑肌的收缩指标为 100%，随 AS浓度 增大，促进作用逐渐增强。各组最大收缩振幅结果:AS 1g / L (63. 53 ± 19. 87)%(P = 0. 303) ，AS 10g /L 81. 62% ± 7. 03%(P = 0. 019) ，AS 100g /L(106. 52 ± 26. 93)%(P = 0. 0001) ，AS 1000g /L(122. 11 ± 26. 75)% (P = 0. 0001)。 各组面积结果:AS 1g /L(41. 80 ± 11. 04)%(P = 0. 334) ，AS 10g /L(68. 16 ± 12. 56)% (P = 0. 002) ，AS 100g /L (151. 07 ± 27. 78)%(P = 0. 0001) ，AS 1000g /L(222. 32 ± 24. 54)%(P = 0. 0001)。各组与 NS 对照组比较，其中 AS 终浓度 0. 1g /L、1g /L、10g /L组最大收缩振幅和面积均有统 计学意义(P < 0. 05) ，见图 1。 (n = 6，珋x ± s) ，aP < 0. 05，bP < 0. 01 vs NS组 图 1 不同剂量 AS(g /L)对离体大鼠结肠平滑 肌自发收缩的影响 2. 2 3 种阻断剂孵育后对槟榔促进离体大鼠结肠平滑肌 收缩效应的影响 以 AS (100g /L)引起的平滑肌的收缩指标为 100%，并 作为对照组。各组最大收缩振幅结果:FTLM 组(101. 32 ± 5. 90)%(P = 0. 764) ，WLPM 组(74. 03 ± 9. 49)% (P = 0. 0001) ，ATP组(12. 77 ± 9. 98)%(P = 0. 0001)。各组面 积结果:FTLM 组(98. 16 ± 3. 41)%(P = 0. 676) ，WLPM 组 (73. 10 ± 11. 92)%(P = 0. 0001) ，ATP组(11. 45 ± 8. 54)% (P = 0. 0001)。与 AS 组相比，ATP 组、WLPM 组对肌条的 收缩有抑制作用，其收缩振幅和面积的比较均有统计学意 义(P < 0. 01) ，可以认为其有阻断作用;而 FTLM 组的比较 则没有统计学意义(P > 0. 05) ，见图 2。 241 第 28 卷 第 1 期 2 0 1 0 年 1 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol. 28 No. 1 Jan. 2 0 1 0 中 华 中 医 药 学 刊 (n = 6，珋x ± s) ，bP < 0. 01 vs AS组 图 2 3 种阻断剂孵育后对 AS(g /L)促进离体大鼠结肠 平滑肌收缩作用的影响 3 讨 论 槟榔又叫大腹子或海南子，为棕榈科植物槟榔成熟干 燥种子，有驱虫消积、下气行水、截疟之功，可治疗食积气 滞，腹痛胀满便秘等病症。历代本草多有记载，《药性论》: “宣利五脏六腑壅滞，破坚满气，下水肿。治心痛，风血积 聚”。《新修本草》曰:“治腹胀，生捣末服，利水谷道”。《本 草名言》曰:“槟榔入胸腹破滞气而不停”。《用药心法》曰: “槟榔，苦以破滞，辛以散邪，专破滞气下行”。《现代实用 中药》曰:“驱除姜片虫、绦虫，兼有健胃、收敛及泻下作 用。”槟榔的这一功能与其有促胃肠运动的作用有关。药 理研究发现槟榔可兴奋胆碱能 M 受体，对平滑肌有较强的 收缩作用，可引起胆囊收缩，兴奋子宫平滑肌。而且槟榔能 明显增强胃平滑肌收缩幅度，有调节胃肠激素的作用［1］。 FD是一种常见病，其发病机制尚未完全清楚，大多数 学者认为 FD不是一个明确的、单一的疾病过程，而是包括 多种不同机制和多因素所致的综合征，且没有器官或结构 上的异常被发现来解释这些症状的出现。目前普遍认为胃 肠动力障碍是 FD的主要病理生理基础。胃排空延迟曾被 认为是 FD最主要的病理生理机制［4］。研究表明，胃排空 延迟与消化不良症状的类型及其严重程度相关，胃固体食 物排空障碍患者更易出现餐后饱胀、恶心和呕吐等症状。 国内研究显示，FD患者中 31. 8%存在胃排空延迟，45. 5% 存在近端胃容受性障碍。有研究者通过同位素和超声研究 证实 FD患者胃内容物分布异常，在远端胃积聚相对较多， 提示餐后近端胃容受功能受损。餐后胃容受功能降低往往 伴有胃内压力上升，激活胃壁机械感受器，从而引起消化不 良症状［5］。Talley等［6］发现 40%患者存在近端胃容受性障 碍，并与早饱症状有关。有研究者认为上消化道运动功能 障碍可能是引起上腹饱胀、嗳气、早饱等症状的主要原因。 用双核素标记试验检测 60 例 FD 和 27 例正常人的胃排空 功能，38%的 FD 患者固体和液体排空时间同时延迟［7］。 有大量的文献报道肌电和运动异常出现在 FD 病人中，表 现为胃排空延迟、胃窦低动力、胃运动节律紊乱、异常的小 肠传输以及小肠动力紊乱等，这些异常单独或不同组合出 现于 50%的 FD 病例中。FD 与中医学痞症的发病机制相 似［8］，属于祖国医学的“痞证”、“胃脘痛”、“纳呆”等证的 范畴，多由于情志不遂，饮食伤胃，劳倦伤脾等因素导致脾 胃气机升降失常，运化功能减退，中焦痞塞不通所致。实验 制作大鼠的 FD模型，研究显示槟榔能明显增加正常和 FD 大鼠胃平滑肌的收缩幅度，说明槟榔能明确的促进胃动力， 是其行气导滞功效的药理基础［1］。 离子通道的信号传递也是细胞外信号调控胃肠道平滑 肌细胞活动的一种重要途径，有赖于 Ca2 +，Na +，K +等多种 离子的存在，其中 Ca2 + 是肠道平滑肌的兴奋一收缩耦联 者。现已明确，Ach是胃肠道最重要的神经递质之一，其可 以与毒蕈碱的 M 型受体结合。副交感神经节后纤维释放 Ach作用于平滑肌 M受体后可开放质膜上 Ca2 +通道，产生 内流致肌收缩［9］。本课题组已经通过培养大鼠结肠平滑 肌细胞，发现槟榔提取物氢溴酸槟榔碱 (Ah)可引起结肠 平滑肌细胞收缩，升高细胞内游离 Ca2 +浓度，且其收缩效 应可以被 M受体阻断剂阿托品所抑制［10］，并且随着氢溴 酸槟榔碱浓度的增大，对结肠平滑肌细胞钙离子移动的作 用影响亦增强［11］，其收缩作用主要是通过细胞外 Ca2 +的 内流介导［12］。本研究中加入 Ca2 +阻断剂维拉帕米和 M受 体阻断剂阿托品后，肌条的收缩活动明显受到抑制，提示槟 榔的促进作用经由 M －胆碱能受体，I 型电压依赖性 Ca2 + 通道介导。而 α －受体阻断剂酚妥拉明对肌条收缩活动的 影响不明显，说明槟榔的作用与其关系不大。本实验通过 离体结肠平滑肌条，观察了槟榔作用的量效关系，其促进肌 条收缩的作用是明确的。随着槟榔浓度的增大，其促进作 用加强，在高浓度组，其促进作用强于相应 Ach的作用。 综合以上内容，本课题组对槟榔进行了不同层次的研 究，发现其均有明确的胃肠平滑肌运动促进作用，是很有发 展和研究前途的促胃肠动力中药。但是中药的成分较复 杂，具体起作用的成分、作用的靶点等问题还需要进一步的 研究。为此笔者还需要不断地改进实验方法，更加全面的 研究槟榔，并对其中的作用组分作进一步的分离和研究，最 终开发出较为理想的促胃肠动力药物。 参考文献 ［1］ 邹百仓，魏兰福，魏睦新.槟榔对功能性消化不良模型大鼠胃运 动的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2003，11 (1):6 －8. ［2］ 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