结核分枝杆菌的分子分型技术研究进展

文章编号:1001-764X(2011)08-609-03 ·综述· 结核分枝杆菌的分子分型技术研究进展* 代旭磊1a，柳爱华1b，宝福凯1a，汪亚玲2，文霞1a，赵勤2，吕松琴2(1．昆明医学院 a．微生物学与免疫学教研室，b． 生物化学与分子生物学教研室，昆明 650031;2．昆明市第三人民医院，昆明 650032) 关键词:结核分枝杆菌;分子分型;技术 中图分类号:R446． 5 文献标志码:A 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是细胞 内致病菌，流行病学资料显示，我国结核病呈高患病率、高耐 药率、高死亡率、高感染率、病例发现率低等特点［1］。结核病 的诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等。提供 快速、敏感、特异、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技 术是目前研究的重点之一。MTB 基因分型技术能更准确地 预测疾病的暴发流行及传播模式，主要是根据其插入序列或 重复序列通过扩增或酶切杂交获得指纹图进行分析。本文 就 MTB的分子生物学分型方法的研究进展作一综述。 1 结核分枝杆菌复合群分型方法 限制性片段长度多态性(IS6110-RFIP)分析是应用最广 泛的 MTB基因分型方法。IS6110 属插入序列 IS3 家族，可根 据其在基因组中插入序列数目和位置的差异而区分不同的 菌株。IS6110-RFLP具有较高的分辨率、较好的重复性及很 强的鉴别菌株的能力，在国际上得到广泛的认同与应用，已 被用作 MTB基因分型的金标准。但也具有一些局限性:如 对 IS6110 拷贝数少(基因组 DNA ＜5 ～ 10 μg)或无 IS6110 的 菌株难以鉴定;程序复杂，操作费时、费力;图谱识读困难，需 要软件支持;需菌量大，DNA提取失败率高;不同实验室以及 不同实验者之间的数据难于比较，缺乏可信性［2］。为此国际 上逐渐建立一些以 PCR 为基础的 DNA 指纹分型方法，通过 多种分型技术、多步分析的方法替代标准指纹分型，以达到 快速鉴定的目的。 2 以 PCR为基础的 DNA指纹分型方法 PCR技术是利用体外基因扩增方法，将少到几个拷贝病 原微生物的 DNA 扩增到常规可水平。对 MTB 这类生 长十分缓慢的病原菌的检测和分型有独特的意义。以 PCR 为基础的分型技术如:间隔区寡核苷酸分型技术(spoligotyp- ing)、数目可变的串联重复序列和 MTB散在分布重复单位分 型(VNTR-MIRU)、扩增片段长度多态性分析和荧光扩增片 段长度多态性分析(AFLP-FAFLP)、双重复元件 PCR、连接酶 介导 PCR(LMPCR)、混合接头 PCR(mixed-linker PCR)、随机 扩增多态性 DNA(RAPD)、聚合酶链反应 /单链构象多态性 分析(PCR /SSCP)、以肠杆菌基因间重复序列为引物的 PCR (ERIC-PCR)等，各法原理与特点见 1。 以 PCR为基础的分子分型技术弥补了 IS6110-RFIP 的 许多不足，但单独应用分辨力均不够强，两种或多种 PCR 方 法联合运用可获得更高的分辨力。spoligotyping 为目前使用 最广泛的 MTB的 PCR分型方法，商品化的 spoligotyping试剂 盒已上市;VNTR-MIRU技术得出的分型更具多样性，被美国 疾病预防控制中心推荐为 MTB 基因分型的首选方法，适用 于做全球流行病学研究。 3 基因芯片技术 1999年，Troesch等［11］用在位合成的方法开发了首块诊 断结核病的芯片，该芯片所用的探针包括两部分:一部分是 有分枝杆菌种间多态性的 16S rRNA 基因片段，借以鉴别 MTB与 NTM;另一部分则是用于分析利福平耐药菌株 rpoB 基因突变的发生情况。该技术具有高通量、集成化、自动化 的特点;可用作分子流行病学调查工具，探查全基因组，用全 序列作为 DNA芯片的模板，分析 MTB 和其他分枝杆菌属分 离株的基因组，识别相同和不同的序列区，可揭示重要的临 床和流行病学现象。目前已用于 MTB的分类鉴别和药敏试 验。Mikhailovich等［12］用基因芯片检测 MTB rpoB 基因的点 突变和基因重排来判定 MTB 对利福平的耐药性，在利福平 耐药菌株中检出 30 个 DNA 突变体(约占所有耐药模式的 95%) ，检测时间缩短到 1． 5 h。张万江等［13］研制一种 MTB 耐药性筛查的基因芯片，该芯片能快速、准确、高效地检测 MTB对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇的耐药性。利用该 基因芯片检测 5 株临床 MTB 分离株的耐药性，与常规药敏 检测结果相符。Park等［14］以 ITS 为靶序列用寡核苷酸阵列 从临床分离菌株中成功鉴定了 19 种分枝杆菌。Sanguinetti 等［15］开发出一种微电子阵列，检测手段精确，操作简单，需 样本少。理论上基因芯片具有高通量、集成化、自动化、平行 性、精确可靠等优点，但由于成本高、现有的技术发展不够成 熟，致使其检测效率与预期尚有差距。 4 变性高效液相色谱 变性高效液相色谱(DHPLC)的原理基于离子对反向液 相色谱技术，通过独特的 DNA分离基质，对特定的 PCR反应 产物进行分离。目前该技术可用于对微生物进行检测鉴别。 Mohamed等［16］用 DHPLC建立了 MTB和牛分枝杆菌的 pnc-A 基因差异性图谱，能迅速鉴别出标本中是否含两种分枝杆菌 亚型。石瑞如等［17］用 DHPLC 异源双链突变方法鉴别 MTB ·906·临床检验杂志 2011 年 11 月第 29 卷第 8 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2011，Vol． 29，No． 8 * 基金项目:云南省应用基础研究项目(2010CD221) ;云南省教育厅科学研究基金(08Y0240)。 作者简介:代旭磊，1979 年生，男，硕士研究生，主要从事热带传染病和结核病研究。 通信作者:柳爱华，E-mail:lunaliu123@ yahoo． com． cn。 和牛分枝杆菌。陈茹等［18］用多重核酸扩增和非变性 DHPLC 分析相结合的原理建立了同时快速鉴别 MTB、牛分枝杆菌、 禽分枝杆菌和副结核分枝杆菌的四重 PCR-DHPLC高通量检 测分析方法。目前该技术也用于 MTB耐药基因研究。Evans 等［19］对 MTB 进行利福平耐药表型分析，发现了 1 个利福平 敏感株表型的 M482T基因突变和 2 个有利福平耐药表型的 杆菌及其扩增片段的 rpoB 基因突变。此外，DHPLC 也用于 结核病相关耐药情况的研究［17-18］。DHPLC 技术具有高通 量、自动化、准确、成本低、结果稳定等优势，但对引物设计、 PCR产物高;对 DNA片段的多个解链温度需要筛检;只 提供定性信息，对具体突变位点和类型还需后续检测等。 表 1 以 PCR为基础的 DNA指纹分析法 方法 原理 特点 spoligotyping［2］ 基于染色体上直接重复区位点的多态性。 简便、重复性高、只需少量 DNA;数字化结果，便于不同 实验室比较;能对含 IS6110 拷贝数少的菌株进行分型。 缺点:分辨率不高，不能识别复合感染。 VNTR-MIRU［3-4］ 通过确定不同串联重复位点重复单元的重 复次数，获得相应菌株特异的数码编码，再 利用相关软件对菌株进行分型。 操作简便、快速、重复性好、敏感性和特异性均高、便于 不同实验室结果比较，其数字化结果有助于建立全球数 字化数据库、开展结核病分子流行病学研究。缺点:尚 需进一步发现多态性等位基因位点。 AFLP-FAFLP［5］ 利用限制性内切酶获得限制性片段。AFLP 选择性扩增基因组 DNA 限制性片段，检测 相应的基因组克隆，用于克隆化的 DNA片段 也有较好的分型效果;FAFLP是用 1 个荧光 标记的引物来分析扩增片段长度多态性。 能监测整个基因组的碱基置换，能从“种”水平揭示 MTB的进化，有较高精确性和可重复性。缺点:操作相 对繁琐，成本高。 RAPD［6-7］ 以单一的随机引物(一般为 10 个碱基)利用 PCR技术随机扩增未知序列的基因组 DNA 获得的 DNA片段长度变异。 简单快速、灵敏度高、多态性检出率高、用途广。缺点: 影响因素较多，有假阳性带、重复性差、分型过少。 PCR /SSCP［2］ 根据单链 DNA构象差别，快速、灵敏地检测 基因变异。 能鉴别 MTB和非结核杆菌(NTM)。缺点:实验易受凝 胶温度的影响;尚不能用于 NTM菌种之间的鉴别。 ERIC-PCR［8］ 以肠杆菌科基因间重复序列中核心序列为 引物进行 PCR，扩增出多态性的 DNA图谱。 对模板要求不高;较其他 MTB 分型技术的分辨率高，快 捷、方便。缺点:图谱的稳定性有待提高。 DRE-PCR［9］ 扩增 MTB IS6110 和多态性 GC 丰富区重复 序列(PGRS)两个重复元件之间的 DNA 序 列;利用重复成分之间距离和拷贝数变化， 扩增大小和数目不同的 DNA片段。 只需少量 DNA，可对临床标本直接检测，全过程只需 2 d。缺点:低和高分子量带难比较，分辨力不足。 LMPCR 基于 DNA连接酶的接头序列和目的基因内 部的已知序列介导的 PCR，扩增已知序列上 游的未知序列。 简单省时、敏感性和特异性好、所需 DNA 量少(2 ng) ， 是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。缺点: 对于带数少的 MTB菌株则敏感性差。 mixed-linker PCR［10］ 以 IS6110 片段多态性为基础的 RFLP 快速 分型的技术，利用限制性酶 HhaⅠ消化 DNA，形成均有 3'端的片段，然后与具有互 补的 5'端的接头结合。 较传统的 IS6110-RFIP 快速、可靠、重复性好，可鉴别 MTB分离株，研究 IS6110 插入位点的流行率。缺点:较 其他分型方法慢。 5 DNA测序 DNA测序是检测分枝杆菌特异性核苷酸序列和菌种鉴 定的金标准。测序法依赖已经建立的由多种特异性基因序 列构成的数据库。有学者评估 hsp65 序列数据库，鉴定了 35 个种或群的分枝杆菌，表明测序法和其他鉴定方法的一致性 为 85． 12%，但不适合混合感染［20］。焦磷酸测序法准确性更 优于传统测序法［21］。吴雪琼等［22］用 DNA 测序、SSCP、RFLP 和反向斑点杂交技术分析 167 株 MTB 临床分离株的耐药基 因型，评价 rpsL或 rrs基因突变与链霉素(SM)耐受性之间的 关系，结果表明，用分子技术分析 rpsL和 rrs基因突变可快速 检测大多数 MTB 对 SM 的耐受性。Choi 等［23］用 DNA 测序 技术检测 110 个临床怀疑多重耐药结核病患者的 113 份痰标 本，结果发现 30 份与 katG 基因突变有关;39 份与 rpoB 基因 突变有关;13 份与 embB 基因突变有关;24 份与 pncA 基因突 变有关。敏感性和准确性对异烟肼为 63． 6%和 94． 6%;利福 平为 96． 2%和 93． 9%;乙胺丁醇为 69． 2%和 97． 5%;吡嗪酰 胺为 100%和 92． 6%。随着 DNA测序技术发展，现在已经发 展到第三代测序技术，以第一代(自动测序)技术虽然成本 高、速度慢，但对于少量序列仍是最好选择;第二代(焦磷酸 测序)技术具有高通量、低成本的特点，已商品化，并趋向成 熟;第三代(单分子测序)技术尚在研发中。总之，测序法准 确可靠，不断优化后有望成为 MTB鉴定的首选方法。 综上所述，目前 IS6110-RFLP仍是 MTB菌株分型的参照 标准和确定流行病学分簇的最终方法。因操作不便，需菌量 大，实验数据难于比较，因此发展了多种 PCR 为基础的替代 方法。但单独应用分辨力均不够高，需两种或多种 PCR方法 联合运用。而 DNA测序是公认的鉴定菌种和检测耐药基因 突变的金标准，随着测序仪器不断改进，其操作日益自动 化，其应用也可望普及。为增加流行病学分簇的可靠性，两 种方法最好使用不同的遗传多态性标志。我国学者根据自 身的研究，初步提出了基因分型策略:MIRU分型技术作为一 线分析方法找出菌株间成簇的关系，以 spoligotyping 技术补 充 IS6110-RFLP技术作为二线的分析方法加以验证［24］。相 ·016· 临床检验杂志 2011 年 11 月第 29 卷第 8 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2011，Vol． 29，No． 8 信随着技术方法的不断改进，将使分子水平上的 MTB 分型 技术得到进一步的完善。 6 参考文献 ［1］全国结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国结核病流行病学 抽样调查办公室． 2000 年全国结核病流行病学抽样调查 ［J］．中国防痨杂志，2002，24(2) :65-108． ［2］Mathema B，Kurepina NE，Bifani PJ，et al． Molecular epidemiology of tuberculosis:current insights［J］． Clin Microbiol Rev，2006，19(4) : 658-685． ［3］Oelemann MC，Diel R，Vatin V，et al． Assessment of an optimized my- cobacterial interspersed repetitive unit-variab1e-number tandem-repeat typing system combined with spoligotyping for population-based molec- ular epidemiology studies of tuberculosis［J］． J Clin Microbiol，2007， 45(3) :691-697． ［4］Christianson S，Wolfe J，Orr P，et al． Evaluation of 24 locus MIRU- VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolates in Canada ［J］． 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欢迎向本刊“检验与临床”栏目投稿 分析前质量控制是确保检验结果真实、客观反映患者状况的重要措施。分析前许多影响检验质量的因 素与临床密切相关，但临床又往往忽略此点而将检验结果与临床不符的责任归咎于检验科。为此，本刊自 2011 年起设置“检验与临床”栏目，刊登影响分析前质量的临床因素和环节、有关疑难问题与典型病例、失败 教训以及检验与临床沟通的成功经验等文章，以期促进检验与临床的沟通，减少影响分析前质量的因素，使 检验科更好地服务于临床。文章内容要求来源于临床实践，包括病史(背景情况)与分析等部分，全文 2 000 字左右。希望本栏目能得到临床工作一线的检验人员和临床医护人员的积极支持和参与。 《临床检验杂志》编辑部 ·116·临床检验杂志 2011 年 11 月第 29 卷第 8 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2011，Vol． 29，No． 8