第四次课_3.9 原代细胞培养和红血球吸附

nullnull鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附nullnull 原代培养期： 　　也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛 原代培养细胞与供体组织在形态结构和功能活动上相似性大 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同 细胞相互依存性强，细胞独立生存性差 原代培养细胞呈二倍体核型null传代期： 　　原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。 在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化null衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期衰退期。 　　细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。null在传代末或衰退早期，由于多种因素的影响，部分细胞可能发生转化 转化的标志之一是细胞可能获得永生性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体 null常规细胞实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管原代培养的过程原代培养的过程取材 培养材料的制备 接种 加培养液 培养null准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒取材和培养材料的制备取材和培养材料的制备A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润； B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中，剪碎nullC. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。取材注意事项取材注意事项1. 取材要准确 2. 因“材”制宜进行处理 3. 保持湿润 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤 5. 动作快，耗时越少越好，必要时可以使用低温（4℃） 6. 取材应注意组织类型、分化程度、供体年龄等。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养 7. 原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的，以备以后查询。培养注意事项1.培养液 按照细胞生长情况，选择最适合的培养液；摸索需要补加的成分及添加量；培养体系的酸碱度；适当换液 2.培养空间 培养液体与液体上方的空间的体积比为1:10为宜。液体的高度最好维持在2-5mm培养注意事项细胞原代培养用于病毒研究的优点细胞原代培养用于病毒研究的优点1）较低的隐性感染 2）没有免疫力 3）容易选择易感细胞 4）接种量大 5）培养条件易于控制 6）提高疫苗的产量和质量 7）加速病毒分离过程null用于病毒原代培养的组织首选病毒的自然宿主细胞。 实验材料实验材料8-9日龄鸡胚 RPMI1640+5%小牛血清 D-Hanks液 0.2%胰蛋白酶 灭菌眼科剪、镊子、3cm平皿、吹打管、10ml小烧杯、25ml细胞培养瓶，50ml三角瓶、吸管,紗布实验方法实验方法一、鸡胚细胞的原代培养 1）消毒鸡胚卵壳，在气室一端敲破卵壳，取出鸡胚放入灭菌的平皿内 2）用剪刀除去鸡胚的头、爪和翅，用D-Hanks液漂洗3次 3）用眼科剪将胚胎剪成1立方毫米大小的小块 4）剪碎的组织块内加入0.2%胰蛋白酶，倒入三角瓶中将瓶口封好，放入37 ℃水浴消化5-10分钟，null5）加入少量1640液，吹打数十次，吸出分散的细胞，通过纱布过滤到10ml烧杯中 6）将烧杯中的细胞平均分配于5个25ml细胞瓶中，补充1640培养基至3ml，置37 ℃培养 7）培养24小时后观察细胞的生长情况并描述细胞形态。nullnull原代细胞的培养与维持 充分漂洗; 起始的2天中尽量减少振荡; 分离繁殖或测定病毒之用，细胞浓度可以加大，尽量贴壁形成厚层； 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化应及时换液； 若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。