基因_型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用

基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用 葛胜祥, 郭清顺,李少伟, 张军, 夏宁邵 (福建省医学分子病毒学研究中心,厦门大学 � 361005) 摘要 :设计针对国内流行的戊型肝炎病毒( HEV )基因�、�型,在这两型序列的保守区域设计了一套 RT-PCR引物 � � � E引物, 并将 E 引物与目前较常用的 3 对通用引物( Meng、ConORF1 和 ConORF2 引物)比较了检测基因�、� 型HEV 的灵敏度。对基因�型HEV, E 引物能检出的稀释度为 105 ,参考引物能检出的稀释度为 102~ 104; 对基因 �型HEV, E 引物能检出的稀释度为 102,参考引物能检出的稀释度为101~ 102。在 17 份HEV-IgM 阳性血清中, E 引物检出 5 份,检出率为 29. 4% ; 参考引物只能检出 1 份或 2 份,检出率最高为 11. 8%。E 引物在 33 份 HEV-IgM 阳性的隐性感染血清中检出 6 份,阳性率 18. 2% ;在 79份 HEV-IgM 阳性的临床肝炎血清中检出 36 份,阳性率45. 6%。以上结果初步明, 对于在国内流行的基因�、�型 HEV, E 引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。 关键词:戊型肝炎病毒; 基因 I 型;基因 IV 型;聚合酶链反应; 通用引物 中图分类号: Q78 � � 文献标识码: A � � 文章编号: 1000- 8721( 2005) 03- 0181- 08 收稿日期: 2004- 09- 07;修回日期: 2004- 12- 14 基金项目:福建省科技重大专项( 2004YZ01)。 作者简介:葛胜祥( 1976- ) ,男,博士研究生。 通讯作者:夏宁邵, 361005厦门大学福建省医学分子病毒学研 究中心。( E-mail: nsxia@ jingxian. xmu. edu. cn) � � 戊型肝炎病毒( Hepatitis E virus, HEV)是经肠 道传播的非甲非乙型肝炎的主要病原体之一[ 1] , 既 可以引起大规模的暴发和流行[ 2- 5] ,也可以引起散 发型病例[ 6- 8]。RT-PCR 是 HEV 感染确诊的重要 手段之一。HEV 为单链 RNA 病毒, 其基因虽说相 对稳定,同一次暴发不同毒株间同一性高,在猕猴中 多次传代基因不易漂移[ 9] , 但不同地域分离株间基 因变异较大,因此保守引物的选择成了 PCR诊断灵 敏度的关键。 检测临床标本中HEV RNA的通用引物已有一 些报道,扩增的目的片段主要集中于 ORF1的 5�端 和ORF2中部这两个保守区域。Meng 等[ 10]于缅甸 株 5 687~ 6 319nt 的位置设计了一套套式 PCR ( nPCR)引物, 并于美国猪中分离出首株动物源性 HEV RNA。尔后, Wang 等[ 11]用该引物于中国家 畜中检出多株 HEV RNA。Li等[ 12]用该引物分析 了中国 14个城市戊型肝炎(戊肝)患者 HEV 基因 的变异。Wang 等[ 13]于两个保守区域设计了另两套 通用引物 � � � ConORF1 和 ConORF2, 这是目前应 用最广的引物之一[ 14- 20]。笔者为了检测中国不同 地区戊肝散发病例和隐性感染者,分别合成了上述 3套引物,但在实际应用中检出率不尽如人意。因 此,笔者针对目前国内只报道过基因 �型和�型的 事实,设计和评价了一套以 �、�型为主兼顾 II、III 型的通用引物, 并初步应用于临床标本中 HEV RNA的检测。 材料与方法 1 � 血清标本 � 收集抗HEV-IgM [ 21]阳性的健康献血员血清 33 份, 临床急性戊肝血清 79 份。健康献血员血清来源于湖 州血站。79 份临床急性戊肝血清中, 43 份来自广西疾病预 防与控制中心肝炎室, 15 份来自北京地坛医院, 21 份来自北 京佑安医院。 2 � 粪便标本 � 基因�、�型粪便均来自广西疾病预防控制 中心试验感染猴。 3 � 引物合成 � 根据文献报道的通用引物序列( Meng 等[ 10] : 引物 3156、3157、3158、3159; Wang 等[ 13] : 引物 ConORF1s1、 ConORF1a1、ConORF1s2、ConORF1a2; 引 物 ConORF2s1、 ConORF2a1、ConORF2s2、ConORF2a2) , 由上海博亚公司合 成 3 套套式 PCR 引物, 分别由 2 条正向引物和 2 条反向引 物组成。将 33条全长的 HEV 序列用MegAlign 中 Clustal算 法同源列队后, 于�、�型保守处设计出一套 nPCR 的引物, 并命名为 E(表 1)。为了避免一条引物内出现太多的简并碱 基,将引物 E4 分成两条设计, 这两条引物位置相同, 但针对 的变异株不同, 前一条主要针对基因�型, 后一条主要针对 基因�型。使用时将这两条引物等量混合作为 nPCR 的内 侧反向引物。 4 � RT-PCR 检测和测序 � 取 250�l 血清, 用 T rizol 试剂 (G IBCO 公司 ) 按其操作说明提取, 20�l 体积反转录。 Meng、ConORF1和 ConORF2 引物按参考文献提供的方法操 作[ 10, 11]。E引物 RT-PCR程序为: 用 E5 作反转录引物, 第 21卷 � 第 3期 2 0 0 5 年 5 月 � � � � � � � � � � � � 病 � � 毒 � � 学 � � 报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY � � � � � � � � � � � � Vol. 21 � � No. 3 May � 2 0 0 5 表 1 � HEV RT-PCR 引物序列 Table 1 � The primers� sequences for HEV RT-PCR Primer S equence# Site* E1 CT GTT TAAYCTTGCTGACAC 6260-6279nt E2 GACAGAATT GATTT CGTCG 6298-6316nt E4-1 T GTT GGTT RTCATAATCCTG 6486-6467nt E4-4 T GCTGGT TATCGT AATCCTG 6486-6467nt E5 WGARAGCCAAAGCACAT C 6568-6551nt � � # . Y= C/T , R= A/ G, W= A/ T. * . Sites on the genom e of Burma strain ( GeneBank accession number: D10330) . AMV 反转录酶 42 � 反转录 40min。第一轮 PCR 引物为 E1、E5, 反转录加 2�l, 总体积为 20�l; 94� 预变性 5min; 94 � 变性 30s, 53� 复性 30s, 72� 延伸 40s, 35 个循环; 72� 延伸 5min。第二轮 PCR 引物为 E2、E4, 加 2�l第一轮产物 为模板, 总体积为 20�l; 94 � 预变性 5min; 94� 变性 30s, 53 � 复性 30s, 72� 延伸 40s, 35 个循环; 72 � 延伸 5min。E 引物扩增片段用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收纯化, 连 接入 pMT-18载体(大连宝生物公司) ,由上海博亚公司进行 序列测定。从湖州地区无偿献血员中分离出的毒株片段的 命名以� hz�开始;从南宁地区戊肝患者中分离出的毒株命名 以� n�或� NN�开始; 从北京地坛医院或北京佑安医院戊肝患 者中分离出的毒株命名分别以� DT�或� YA�开始。 5 � 同源性分析与进化树生成 � 同源性分析参比的 33 株 HEV 全长序列如下: 缅 甸株 ( B1, GenBank 录入号为 D10330; B2, M73218 ) , 巴 基 斯坦 株 ( P1, M80581; P2, AF185822) , 印度株 ( I1, X98292; I2, X99441; I3, AF076239; I4, AF459438 ) , 中国 株 ( C1, D11092; C2, D11093; C3, L08816; C4, L25547; C5, M94177; Cv1, AB108537; Cv2, AJ272108) , 乍得株 ( Chad1, AY204877) , 墨西哥株 ( M1, M74506) ,美国株( U s1, AF060668; Us2, AF060669) , 日本株 ( J1, AB074918; J2, AB074920; J3, AP003430; J4, AB099347; J5, AB091394; J6, AB097812; J7, AB080575; J8, AB074917; J9, AB074915) , 美国猪株 ( swUS1, AF082843) , 加拿大猪株 ( swCa1, AY115488) , 日本猪株 ( swJa1, AB073912; swJa2, AB097811)。各序列采用 MegAlign( Laser gene软件包, Dnas- tar Inc)进行同源列队。同源队列用 MEGA 软件包( 3. 0 Beta version, ww w. megasoft ware. net ) 中的 Neighbor- Joining 法 ( Kimura-2-parameter 模型) 生成进化树, 并用 Bootstrap 法 ( Replication 值为 250)验证。Bootstrap 值大于 70%的系统进 化分组被认为有足够的支持证据。 结 � � 果 1 � 引物分析 1. 1 � E 引物的同源性和特异性分析 � E1引物第 9 位的兼并碱基,是 15条基因 �型全长序列和 8条基 因�型全长序列的主要变异位点(图 1)。就全部 4 图 1� E 引物与 33 条 HEV 全基因序列的同源比较 F igure 1 � The homologous compar ison of E pr imer set w ith the genomes of thirty- three HEV strains �182� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 21 卷 � 个基因型而言, E1 3�端的第 3个碱基也是一个高变 位点。E1在基因�、�、�型序列中保守, 但与 �型 同源性较差。E2引物除了第 10位G有零星突变为 A外,在 4个基因型中均保守。E4引物 3�端第 6个 碱基在少数序列中有突变外, 其余的 4个基因型序 列均能与此混合引物很好配对。E5 引物能与全部 23条 �、�型序列配对,但其 3�端在 �、�型中变异 大。因此, E引物适合于检测�、�型HEV 序列。 同时,为了检验引物的特异性,将此四条引物于 GenBank数据库进行 BLAST 分析, 并未发现能配 对非 HEV序列,表明此引物的特异性较好。 1. 2 � E引物的基本参数分析 � 为了解 E 引物的基 本理化性质, 用软件 Oligo6. 0分析了引物的解链温 度( T m)、Loop 值( Loop Tm )以及 GC 含量(表 2)。 可见各引物的 GC 含量和 Tm 值适中, 且在配对的 两条引物间相差无几; 各引物均未有明显的Loop结 构。同时, P rimer 软件分析结果显示, 各引物自身 和引物间二聚体的形成不明显。 表 2 � E引物的 Tm值、Loop值和 GC含量 Table 2 � Tm, Loop Tm and GC% of E pr imers Primer Length ( bp) Tm ( � ) Loop Tm ( � ) GC% E1 20 54. 9- 57. 6 � 40- 45 E5 18 55. 9- 56. 8 � 44. 4- 50 E2 19 57. 7 3 42. 1 E4 20 58. 0- 60. 9 � 35- 45 1. 3 � 目的片段的同源性分析 � 为了确定 E 引物扩 增出来的片段能否用于基因分型,我们将上述 33株 全长HEV 序列 ORF2的相应区段( 6 317~ 6 466nt, 共 150bp)进行同源性分析, 绘制进化树, 并与根据 全长序列生成的进化树进行比较。 图 2� E 引物扩增片段绘制的进化树( A )与 HEV基因组进化树( B)的比较 F igur e 2 � Compar ison of nucleotide phylo genetic trees protracted by the amplified fragments o f E primer set ( A) and by the complete genomes of HEV ( B) Details and accession numbers for the sequences used for comparison are provided in Materials and M ethods. � � 从图 2可以看出, E 引物扩增的目的片段与全 基因组绘制的系统树不完全一致,但分型结果完全 一致。Schlauder 等[ 22]曾将与 E 引物扩增片段几近 相同的 148bp 的 ORF2片段( 6 322~ 6 469nt )用于 �183�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用 HEV各分离株的同源性分析, 也得出同样的结果。 此外,一个包含于 E 引物目的片段中的更小片段 ( 6 369~ 6 466nt , 98bp)也常用于 HEV 的序列分 析[ 13]。 2 � 与已报道引物的比较 为了遴选更适合于诊断中国境内的临床戊型肝 炎(以基因 �型和基因�型为主)的引物,比较了 E 引物和目前被广泛应用的、已报道的通用引物 ( Meng 引物, ConORF1引物和 ConORF2引物)对已 知�型和�型 HEV 的扩增效率, 并同时评价这些 引物在 17份抗-HEV IgM 抗体阳性的随机血清中 的检出率。 2. 1 � 扩增效率比较 � 将两份分别含基因 �型和� 型HEV的猕猴粪便,用 PBS( 20mmol/ L , pH7. 2)制 成 10%的粪悬液上清, 再梯度稀释 101~ 106 倍, 分 别用上述四种引物检测梯度稀释液中的 HEV,结果 如表 3。对基因�型HEV 的检测, E 引物的灵敏度 均要高于其它 3对引物;对基因�型 HEV 的检测, E 引物的灵敏度与 Meng 引物和 ConORF1 引物持 平,要高于 ConORF2引物。 表 3� 不同引物对基因�、�型 HEV的扩增灵敏度比较 Table 3 � Compar ison of t he sensitivity o f differ ent primer sets on PCR detecting of genotype I or IV HEV HEV Primer Meng ConORF1 ConORF2 E Genotype I 104 104 102 105 Genotype IV 102 102 101 102 2. 2 � 检出率的比较 � 从广西省疾病预防控制中心 提供的HEV-IgM 阳性临床肝炎血清中随机选取 17 份标本,并用上述 4对引物平行检测其中的 HEV RNA。E引物检出了其中 5份, 分别为 n3、n6、n7、 n8和 n9;其它引物的检出数均要少于 E 引物,且阳 性标本均在 E引物检出的 5份标本之内。现将这 5 份标本各引物检测的结果列于表 4。E 引物的阳性 率为 29. 4%,要明显高于其它 3对引物, 同时也要 高于 ORF1和 ORF2保守区引物联用。将 5份 标本用 E引物扩增的 PCR产物测序,并将其序列进 行进化树分析, 其中有 4 份为基因�型,仅标本 n9 为基因�型。可见, E 引物比目前所发表的通用引 物更适合于对基因 �、�型 HEV的检测。 表 4 � 四种引物对 17 份 HEV-IgM 阳性临床肝炎标本的检 出情况 Table 4 � The PCR results of 17 HEV- IgM reactive clinical serum samples amplified w ith four primer sets Primer set Tested no. Posit ive sample n3 n6 n7 n8 n9 Posit ive rate ( % ) Meng 17 - + - - - 5. 9 ConORF1 17 - + - + - 11. 8 ConORF2 17 - - - + - 5. 9 E 17 + + + + + 29. 4 3 � E引物的初步临床应用 共收集了 HEV- IgM 阳性的 79份散发型肝炎 的临床血清和 33份 ALT 正常的献血员血清(隐性 感染者) ,并用 E引物对这些标本做 PCR 筛查并将 PCR产物测序并做进化树分析,结果如表 5、图 3。 在 33 份 HEV- IgM 阳性的隐性感染标本中有 6份 HEV PCR阳性, 阳性率 18. 2%。在不同次收集的 临床肝炎标本中, PCR阳性率从 33. 3% ~ 85. 7%不 等,平均达 45. 6%。在总共36份 HEV PCR阳性的 临床标本中, 33份为基因�型,占 90%以上。 表 5� 不同来源抗 HEV-IgM阳性血清中的 E引物 PCR 结果 Table 5 � The PCR result using E pr imer set on different clinical sera with ant-i HEV IgM Source of sera Clinical status T ested no. Positive no. Total Genotype I Genotype IV Posit ive rate ( % ) Blood bank Subclinical 33 6 4 2 18. 2 Hospital A Acute h epat it is 36 12 1 11 33. 3 Hospital B Acute h epat it is 7 6 0 6 85. 7 H ospital C Acute h epat it is 15 9 2 7 60. 0 Hospital D Acute h epat it is 21 9 0 9 42. 9 Total Subclinical 33 6 4 2 18. 2 Acute h epat it is 79 36 3 33 45. 6 � � 7个基因 �型的序列分别来源于北京(医院 C 和D)、浙江(血站)和广西(医院 A) ,相互间同源性 为96. 7% ~ 100%, 表明在各地引起隐性感染和临 床散发病例的�型分离株变异不大,与HEV 4个基 因型中 �型最为保守的看法一致。而属于基因�型 的 35 个序列变异大, 相互间同源性为 84% ~ 100%,并有一定的地域性:来自北京(医院 C和 D) 的分离株相互接近, 而来自广西(医院 A 和 B)的分 �184� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 21 卷 � 离株也相互聚集(图 3)。大体可以将基因�型分离 株分为两个群, Group1和 Group2,但 Bootst rap分析 只支持 Group 1 的分群 ( Group1 的 Bootst rap 值为 100% )。Group 1包括 7株分离自北京的毒株和参 考序列 Cv1, 群内同源性为 92. 7% ~ 100%; Group 2 群内序列变异较大,同源性从 88. 6%到 100%不等, 并且 Bootst rap分析不支持其分群,但因其群内序列 与 Group 1 群内序列的差异较大, 群间同源性为 84%~ 90. 7%,因此与 Group 1对应, 将其定义为一 个群。 图 3 � 42 份 E 引物阳性标本的进化树分析 Figure 3 � Phylogenetic analysis of fourt y- two E primer set detected samples � represent the reference sequences, their details and accession numbers are provided in Materials and Methods. 讨 � � 论 目前, 一般将HEV 分为 4个主要的基因型: 基 因�型流行于亚非多数国家, 以缅甸株为原型株; 墨 西哥株为基因�型, 此外还包括尼日利亚株[ 23]和新 近于纳米比亚发现的两株[ 24] ; 从美国、部分欧洲国 家(意大利、希腊、西班牙等)和阿根廷的急性戊肝患 者中分离的 HEV 株[ 14- 16, 25, 26]是为基因 �型; 基 因�型由最近在中国发现的新的分离株组成[ 13] , 包 括中国台湾株[ 27]和部分日本株[ 7]。4 个基因型间 的HEV 序列的同源性小于 81%, 而在各基因型内 部,除了基因 �型各序列间的同源性高于 90%外, 其它各型变异均较大[ 22]。基因 �型的纳米比亚株、 墨西哥株、尼日利亚株三者间的同源性为 80% ~ 90% [ 23, 24] ; Schlauder 等[ 22]将 2001 年前发表的基 因 �型序列分为 5个亚型,各亚型间的同源性小于 88%;基因�型与基因 �型一样,目前只报道过散发 型病例, 其变异度也较大, 一些日本的分离株与 Wang 等报道的�型原型株(中国变异株)的同源性 小于 90%。 目前较多报道的 HEV PCR 引物有 Meng、 ConORF1 和 ConORF2。Meng 引物是 Meng 等[ 10] 于 1997年为了克隆美国本土 ant-i HEV 抗体阳性的 猪中的HEV 序列设计的通用引物。由于当时基因 �型还未发现,其设计引物的参考序列主要为基因 �型、�型和少量的�型。通过与上述的 33条全长 序列对比,此套引物中的某些引物的 3�端与几乎全 �185�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用 部8 条 �型序列出现了不匹配。1999 年, Wang 等[ 13]为了检测多份采集于国内的非甲-戊型临床散 发型急性肝炎标本, 分别在HEV ORF1和 ORF2的 两个保守区设计了 ConORF1 和 ConORF2 两套引 物。此次试验首次发现了 HEV 基因 �型序列, 但 在设计引物时没有也不可能考虑到基因�型。与 33条全长序列的同源性分析表明, ConORF1 的两 条正向引物同源性较高, 在 4个基因型中变异不大, 但两条反向引物的 3�端在几乎所有的�型序列中 出现了 1~ 2个碱基的突变。ConORF2的外侧反向 引物 3�端的第 6个碱基在 8个�型序列中有5株出 现突变,其内侧反向引物在外侧反向引物的基础上 仅有 3个碱基的位移,不仅同样有不匹配的问题, 还 会导致一定的假阳性。 本研究设计的 E 引物的扩增区段与 ConORF2 大致相同,且有两条引物的位置相同。但 E引物在 设计时参考了大量的�型序列并放弃了与众多�型 序列的匹配,虽然降低了引物的通用性,但在以流行 HEV 基因�型和�型为主的区域应用时拥有更大 的优势。这一优势在平行检测 17 份 HEV-IgM 阳 性血清时, E引物比其它引物明显要高的阳性率得 到了验证。 在以往的报道中[ 12, 13, 28] , 国内散发性临床戊 型肝炎中基因�型所占的比率从 9%到 62. 5%不 等,总体上基因 �型和�型的比例大致相当。在本 研究中,基因�型比率达到了 91. 7%( 33/ 36) , 明显 要比以往报道的要高。其原因可能与选择的样本有 关,也可能是 E引物进一步提升了对基因�型的检 出率。 本研究从北京地区戊肝患者中分离出的 18 株 HEV 中, 16株属于基因 IV 型; 广西地区戊肝患者 中分离的 18株 HEV 中, 17 株属于基因 IV 型。最 近,郑玲等[ 29]用 E 引物检测了福州市传染病医院自 2000年 1 月到 2003 年 12 月收集的 158 份 HEV- IgM 阳性的临床肝炎血清,共检出 81份 PCR阳性, 阳性率 51. 27%,与本研究接近。这 81 株均属于基 因 IV型。但本研究从湖州地区献血员中分离出的 6株序列中, 仅 2株属于基因 IV 型, 而 4 株属于基 因 I型。这是由于湖州地区毒株基因型分布的特殊 性,还是有其它原因? 这一问题值得进一步深入研 究。 参考文献: [ 1] Purcell R H, Emerson S U. 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The sensit ivity of E primers and three sets of reported primers ( Meng, ConORF1 and ConORF2) w ere compared by using HEV genotypes I and IV challenged monkeys� stools and sera of hepatit is E patients. The detect ion limit of E primers for genotype I HEV in monkey stools w as 10 to 1000 times lower than that of reference primers, and the same or 10 t imes low er than that of reference primers for g enotype IV HEV. When amplified by RT-PCR using E primers, five out of seventeen ( 29. 4% ) ant-i HEV IgM posit ive pat ients� sera were posit ive, and just 1 or 2 samples w ere posit ive w hen RT-PCR were performed using reference primers. T hus, the E primers w ould be a bet ter choice for detect ion of HEV RNA in samples from China, where only g enotype IV and genotype I HEV were reported. Key words: hepatit is E virus; Genotype I; Genotype IV; polymerase chain reaction; universal primer Cor responding author : XI A N ing-shao, E-mai l : nsxia@ j ing xian , x mu . ed u . cn �187�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用