ACEI对风湿性心脏病心房颤动患者心房ACE_ERK表达和纤维化改变的影响

文章编号: 0253- 3626( 2005) 02- 0187- 04 ACEI对风湿性心脏病心房颤动患者心房 ACE、ERK 达和纤维化改变的影响 张 � 安 , 殷跃辉 (重庆医科大学第二临床学院心内科, 重庆 � 400010) �摘 � 要� 目的:研究风湿性心脏病(风心病)心房颤动(房颤, AF)患者用血管紧张素转换酶抑制剂( ACEI)时心房组织血管紧 张素转换酶( ACE)、细胞外信号调节激酶( ERK)表达与心房纤维化改变。方法: 35 例风心病二尖瓣狭窄接受外科手术患者, 手术时取右心耳处心房组织 400mg ,通过逆转录 � 聚合酶链反应技术, 以 GAPDH 为内参照,测量 ACE, ERK2 mRNA 变化, 用 Western Blotting观察 ACE、磷酸化 ERK( pERK)在蛋白水平表达的差异, 经 Masson 染色研究胶原纤维容积分数( CVF)改变情 况。结果: 与窦性节律患者比较,慢性房颤患者在 mRNA 水平上 ACE、ERK2 表达上调, 在蛋白水平上 ACE、pERK 表达上调 ( P < 0. 01 或 P< 0. 05) , CVF 也显著增加(P < 0. 01) ; 与未应用 ACEI组比较,用 ACEI 组 ERK2 mRNA、pERK 蛋白表达下调 ( P < 0. 05) , ACE 表达无差异, CVF 虽有减少趋势,但无统计学意义( P > 0. 05)。结论:风心病慢性房颤患者较窦性节律患者 ACE、ERK 表达增加,纤维化加重; 而在应用 ACEI 的慢性房颤患者, ERK2, pERK 表达有显著下降,纤维化减轻,说明在房颤 时,局部激活的肾素 � 血管紧张素系统( RAS)经 ERK 途径介导了心房纤维化, ACEI 在一定程度上减轻心房的纤维化。 �关键词� 心房颤动;血管紧张素转换酶; 血管紧张素转换酶抑制剂; 细胞外信号调节激酶;胶原纤维容积分数 �中国图书分类法分类号� R541. 202� � � � �文献标识码� A � � � � �收稿日期� 2004- 06- 22 Effects of ACEI on the expression of ACE and ERK and the changes of atrial fibrosis in patients with atrial fibrillation ZH ANG An , et al ( Depar tment of Car diology , The Second Col lege of Cl inical Medicine, Chongqing Medical Univer si ty ) �Abstract� Obj ective: To study the expression of angiotensin - converting enzyme ( ACE) , ex tracellular signal - r egulated kinase ( ERK) , and the changes of atrial fibr osis in patients with rheumatic heart disease( RHD) and atr ial fibrillation( AF) treated w ith an- g iotensin- converting enzyme inhibitor( ACEI) . Methods : Atrial tissues were obtained from the r ight appendage during open surgery in 35 patients with RHD. T he mRNA of ACE and ERK2 w ere semi- qualified by reverse transcr iption- ploymerase chain reaction ( RT- PCR) and normalized to the glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase( GAPDH) . Western blotting analysis was employed to examine the expressions of ACE and phosphory lated ERK ( pERK) . Atrial collag en volume fraction( CVF) was detected by Masson� s stain. Results : The mRNA of ACE and ERK2 or the protein of ACE and pERK were significantly increased, and CVF was significant- ly increased in patients with chronic atrial fibr illation( CAF) compared with sinus rhythm g roup( SR) ( P < 0. 01 or P < 0. 05) . Com- pared with CAF patients treated w ithout ACEI, the mRNA of ERK2 and protein of pERK were significantly decreased in CAF patients treated w ith ACEI( P< 0. 05) , but there w as no differ ence in ACE, and decrease in CVF was not statistically significant( P> 0. 05) . Conclu- sion: The expressions of ACE, ERK2 and pERK increase, and fibrosis is more severe in RHD patients with CAF as compared w ith those w ith SR. Compared with CAF patients treated without ACEI, the expressions of ERK2 and pERK significantly decrease( P< 0. 05) and de- crease in CVF is detected( P > 0. 05) in CAF pat ients tr eated with ACEI. This suggests that the incr easing expression o f ERK2 and pERK resulting from local renal ang iotensin- converting enzyme system activation mediates the development of atr ial fibrosis, and A- CEI may contribute to lesser atrial fibrosis in RHD patients wit h AF . �Key words� Atr ial fibrillat ion; Angio tensin - converting enzyme; Ang iotensin- converting enzyme inhibitor; Extr acellular signal- r egulated kinase; Collag en volume fraction 作者简介:张 � 安( 1970- � ) ,男,主治医师,硕士, 主要研究方向:心律失常。 基金项目:重庆市科委科研基金项目( 03- 8010)。 �187�重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2) � � 房颤是最常见的心律失常, 随着年龄的增长其 发病率逐渐增加。房颤的发生机制复杂, 至今尚未 完全阐明。以心房间质纤维化改变为特征的组织学 重构在房颤的发生、发展和持续过程中有重要作用。 心房肌局部的肾素 � 血管紧张素系统 ( RAS)激活, 经丝裂原活化蛋白激酶( MAPK)途径介导组织学改 变是一重要机制,也是多种促增殖信号转导途径的 细胞外终点。基础和临床研究已证实 ACEI可改善 或逆转房颤时心房局部电与组织学重构。本文通过 研究房颤患者心房 ACE、ERK2和 pERK 表达与纤 维化改变, 以及 ACEI 对其表达的影响, 对进一步明 确房颤组织学重构的机制及 ACEI 逆转组织学重构 的机理将是很有帮助的。 1 � 资料与方法 1. 1 � 病例选择与分组 35 例均为 2002 年 11 月~ 2003 年 12 月住院接受开胸 换瓣手术的风心病二尖瓣狭窄患者,其中男 19 例, 女 16 例, 年龄 33 ~ 60 岁。将其分为 3 组: A 组 9 例, 为窦性节律患 者; B 组(未用 AECI) 14 例,为慢性房颤患者 (房颤持续时间 > 6 月) ,病程中未用过或间断服用 ACEI, 但术前 6 月未服 用; C 组(用 AECI ) 12例, 为慢性房颤患者(房颤持续时间> 6 月) , 病程中使用且术前 6 月内仍坚持服用 ACEI。所有患者 术前作常规心电图、超声心动图检查, 心功能均为 �~ �级 ( NYHA 标准)。三组患者在年龄、左右房直径、右房压、二尖 瓣口面积及左室射血分数( LVEF )方面, 组间无显著性差异 ( P > 0. 05)。 1. 2 � 标本采集及保存 外科手术时,于体外循环插管前, 打开右心房后立即取 右心耳组织, 取 200mg 放入甲醛中, 备 Masson 染色用, 余下 组织立即放入液氮中保存备用。 1. 3 � 心房组织总 RNA提取及逆转录 � 聚合酶链反应 ( 1)总 RNA提取: 取组织 100mg, 用 T r izol试剂(上海生 物工程公司提供)提取右心耳组织总 RNA,经紫外分光光度仪 分析OD260/ OD280,所有标本OD260/ OD280比值均> 1. 8。( 2) 引物序列及设计(上海生物工程公司) :见表 1。( 3) cDNA 合 成与基因扩增: 取总 RNA 产物 5�g 作 GAPDH、ACE、ERK2 等模板的浓度和循环梯度周期曲线, 确定反应体系 50�l, 包 括 10 � buffer 5�l, 10mmol/ L dNT P 4�l, 25mmol/ LMgCl2 3�l, T aq 酶 2. 5u, cDNA 4�l(约 0. 5�g) , 引物量 25pmo l。反应条 件为 94 � 预变性 5min, 随即进入 PCR 循环, 即 94� 变性 30s,退火 30s,各目标基因退火温度分别为 65 � ( ACE)、60� ( ERK2) , 72 � 延伸 60s, 共 38 个循环, 72� 再延伸 5min。阴 性对照:反应体系中未加入模板总 RNA, 代之以去离子水, 其他均相同。( 4)电泳及图象扫描: 取扩增产物 10�l, 于 2% 琼脂糖上电泳(电压 90V ,时间 30min) , 然后于 Gel Doc 2000 凝胶成像系统( Bio- RAD)扫描, 分别测目标基因和 GAPDH 条带的 OD值比,后者代表目的基因的相对表达含量。 表 1 � 目标基因及内参照引物序列设计 基因 方向 引物序列 ACE( 297bp) 上游 5� - ACTGGTGGTATCTTCGAACC- 3� 下游 5� - GACCATGTCCTTCAGCACC- 3� ERK2( 218bp) 上游 5� - CATCGCCGAAGCACCATTCAAG- 3� 下游 5� - GATAAGCCAAGACGGGCTGGAG- 3� GAPDH( 376bp) 上游 5� - TCCATGACAACTTTGGCATCGTGG- 3� 下游 5� - GTTGCTGTTGAAGT CACAGGAGAC- 3� 1. 4� Western Blotting ( 1)总蛋白提取与含量测定:加入组织裂解液进行匀浆, 离心, 取上清液,以比色法进行定量。( 2)聚丙烯酰胺凝胶电 泳( SDS- PAGE) : 积层胶浓度为 5% , 分离胶浓度为 5%、 10%。蛋白质样品经稀释并煮沸后, 取同样浓度等体积的蛋 白质样品加入到样品孔中 (样品 2�l及上样 buffer2�l) , 80V 电泳至分离胶, 100V 电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。( 3) 转膜:制作好三明治, 于 4� , 电流 90mA, 电转移过夜。 ( 4) 免疫学检测: PVDF 膜经 5% (W / V )脱脂奶粉封闭后加入以 封闭液稀释的第一抗体: 鼠抗 ACE 单克隆抗体( Novocastra Laboratories Ltd, Unided K ingdom) 1�30, 兔抗 pERK 多克隆 抗体( Santa Cruz, CA ) 1�400, 再加入辣根过氧化物标记的二 抗,经 DAB 显色, 待蛋白条带清晰后以自来水冲洗, 照相。 ( 5) 结果分析: 结果用 Gel Doc 2000 凝胶成像系统 ( Bio - RAD, 美国)对目的条带进行密度分析,蛋白含量以相对光密 度( ROD) � 面积表示。 1. 5� 统计学分析 各组数据以 �x � s 表示, 组间比较用 q检验, P < 0. 05 有 统计学意义, 使用 SPSS 软件分析。 2 � 结 � 果 2. 1 � ERK2、ACE、GAPDH 的 mRNA转录 以 100bp plus ladder 为 Marker, 3个基因的 RT - PCR产物电泳条带的位置与理论值相符 (见图 1)。 2. 2 � 心房组织 ACE、ERK2 mRNA 相对表达量的 改变(见表 2) 与 A 组比较, B、C 两组 ACE、ERK2 显著上调 ( P< 0. 01或P< 0. 05) ;与B组比较, C组ERK2有显 著下调( P< 0.05) ,而ACE无显著性差异( P> 0.05)。 2. 3 � 心房肌 pERK ( pERK1/ 2)、ACE 蛋白印迹图 (见图 2) �188� 重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2) 表 2� 房颤患者心房肌 ERK2、ACE mRNA水平变化( �x � s) 组别 ACE ERK2 A组( n= 9) 0. 49� 0. 19 1. 03 � 0. 24 B 组( n = 14) 0. 67� 0. 21* 1. 39 � 0. 28* * # C 组( n = 12) 0. 70� 0. 18* 1. 21 � 0. 27* � � 注:与 A 组比较, * P< 0. 05; 与 A 组比较, * * P< 0. 01; 与 C 组比较, # P< 0. 05 图 1� 心房 ACE、ERK2和 GAPDH mRNA 转录水平 1、4分别为 A 组的ACE, ERK2电泳条带, 2、5 分别为B 组的 ACE, ERK2 电泳条带, 3、6 分别为 C 组的 ACE, ERK2 电泳 条带, 7 为 GAPDH 图 2 � 抗ACE 单克隆抗体和抗 pERK 多克隆抗体免疫印迹图 从左到右, 1、2为 A组, 3、4为 B组, 5、6 为 C组 图 3� ACE 和 P- ERK 相对蛋白含量 � � 注:与 A 组比较, * P< 0. 05; 与 A 组比较, * * P< 0. 01; 与 C 组比较, # P< 005 2. 4 � 心房肌 pERK( pERK1/ 2)、ACE 蛋白相对含 量(见图 3) 与A 组比较, B、C 两组 ACE、pERK 显著上调 ( P< 0. 01或 P< 0.05) ;与 B组比较, C组 pERK有显 著下调( P< 0. 05) ,而ACE无显著性差异( P> 0. 05)。 2. 5 � 心房纤维化指标 CVF 的改变(见表 3) 与 A组比较, B、C两组 CVF 均显著升高( P< 0. 01) ;与 B组比较, C 组降低, 但无统计学意义( P > 0. 05)。 表 3� 房颤患者心房 CVF( �x � s) 组别 CVF (% ) A组( n= 9) 9. 36� 1. 91 B 组( n= 14) 16. 49� 2. 01* C 组( n = 12) 15. 71� 2. 23* � � 注: 与 A组比较, * P < 0. 05 3 � 讨 � 论 在 RAS中, 血管紧张素 �( Ang�)是最为重要 的效应分子, Ang �的生成有三条途径: ACE 途径 (经典途径)、糜酶途径和非 ACE 非胃促胰酶途径。 据研究,在人体完整的心脏中, 血管紧张素 � ( Ang � )的转化有 80%是经 ACE途径完成的,说明 ACE 仍是 Ang �生成的限速因素[ 1]。但在心房心室的 ACE和糜酶活性是有差异的, 右心房 ACE 活性是 左心室的 3- 4倍,右心室 ACE 活性是左心室的 2 倍,相反,心室糜酶活性是心房的 2 倍, 而左右心室 则相似[ 2] , 故对心房而言, Ang �的生成仍是以 ACE 经典途径为主。心房 ACE的表达对局部 RAS 一系 列病理生理效应有重要的影响。本研究提示,慢性 房颤患者心房 ACE 表达在 mRNA、蛋白水平升高, 与文献报道一致[ 3, 4] , 而慢性房颤时心房局部 RAS 中由于 ACE表达的增加,导致 Ang�在心房局部生 成增加,与伍炜锋等[ 4]的报道一致, 说明慢性房颤 时存在局部 RAS 的激活, 而不论循环或局部的 RAS,通过 Ang �与 AT 1 受体( AT 1R)结合, 经受体 偶联的 G蛋白途径而产生效应。Ang �与AT 1R结 合后,主要通过 Gq型 G蛋白激活磷脂酶 C激活,从 而激活相关信号通路。 本研究还发现, 慢性房颤患者心房 ERK2 在 mRNA水平以及 pERK 在蛋白水平上表达明显上 调,与有关文献报道一致[ 2, 5]。已如前述, 慢性房颤 患者心房局部生成增加的 Ang�与心房成纤维细胞 膜上 AT 1R结合后,相应生理效应增强。其间通过 了 MAPK多级信号转导, 已知 ERK 是 MAPK 途径 主要的和经典的通路, 本研究结果说明慢性房颤患 者心房局部存在 ERK 途径的激活。增加的 pERK 移位至细胞核,催化转录因子磷酸化、活化,增加调 节基因的表达和开放, 导致细胞活化, 相应功能增 �189�重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2) 强,如成纤维细胞分泌胶原增加,同时其分泌生长因 子,如转化生长因子- �1 ( TGF - �1 ) 也增加。而 T GF- �1 可减少基质金属蛋白酶- 1( MMP- 1)的 合成,并促进 MMP- 1的抑制物( T IMP- 1) 的合 成,从而抑制胶原降解, 促进纤维化的发生[ 6] , TGF - �1 还可增加纤维连接蛋白和胶原在细胞外基质 的沉积[ 7] ,导致心房间质纤维化。 在纤维化方面, 也观察到慢性房颤患者 CVF 较 窦性节律组明显增加,同时,在慢性房颤患者,用 A- CEI组较未用 ACEI组其心房 ERK2、pERK表达明 显下调,可能与 ACEI 减少局部 Ang �的生成, 减弱 后者在局部的效应, 表现为信号通路(如 MAPK 途 径)中 ERK2、pERK 表达下调, 进一步证实了慢性 房颤时心房局部 RAS 的激活, 经 MAPK 途径介导 了组织学重构。在纤维化指标方面, 用 ACEI 组较 未用ACEI组 CVF 有下降趋势, 但无统计学意义, 这可能与以下几个方面有关: � 本研究样本数量有 限; � 心房局部 Ang �的生成除了 ACE 经典途径 外,还有糜酶途径的存在,单用 ACEI只能部分抑制 其生成; � 房颤持续时间不一, ACE I只是对新的胶 原沉积、基质增加有影响,应用后对已沉积的胶原和 增加的基质影响不大,并且部分未用 ACEI 组患者, 在其病程中亦曾间断服用 ACEI。 房颤时心房间质纤维化所涉及的信号通路较为 复杂, ERK信号通路是迄今研究得最为透彻的一条 MAPK 信号通路。本研究也发现风心病房颤患者 心房 ERK 途径中 ERK2、pERK 表达和相应的纤维 化指标的增加, Ang�与 AT 1R结合后,除了经 ERK 途径产生效应外, 还可能通过其它信号转导途径。 相信通过对这些途径的深入研究, 可以进一步明确 其在房颤心房组织学重构中的作用。 参 � 考 � 文 � 献 [ 1 ] � De Mello WC, Jan Denser A. H. Angiotensin and the heart on the intracrine RAS[ J] . Hypertension, 2000; 35 ( 6) : 1183- 1188. [ 2] � Horiuchi M , Hayasbida W , Kambe T , et al. Angiotensin type2 recepto r dephosphory lates BCL- 2 by act ivating mitogen activated protein kinase phosphatetase- 1 and induces apoptosis [ J] . Biol Chem, 1997; 272( 30) : 18022- 19026. [ 3] � Goette A, Stack T , Rocken C, et al. Incr eased expression of ex tracellular signal- regulated kinase and angio tensin- con- verting enzyme in human atria dur ing atrial fibr illation[ J] . J Am Co ll Cardiol, 2000; 35( 6) : 1669- 1677. [ 4] � 许春萱,黄明方, 张建成,等. 心房颤动患者心房组织中 血管紧张素转换酶和血管紧张素受体 mRNA 表达的研究 [ J] .中华心血管病杂志, 2003; 31( 1) : 55- 56. [ 5] � 伍伟峰,黄从新, 刘唐威,等. 风湿性心脏病心房颤动患 者心房细胞外信号调节蛋白与纤维化的关系[ J] . 中国心脏 起搏与心电生理杂志, 2002; 16( 2) : 100- 103. [ 6] � Conception L , Nerea V , Jav ier F , et al. Abno rmalitier of the ex tracellular degr adation of collagen type � in essential hy- pertension[ J] . Circulation, 1998; 98( 5) : 535- 540. [ 7] � L ijnen P , Petrov V . Induction of cardiac fibrosis by aldos- ter one[ J] . J Mol Cell Cardiol, 2000; 32( 6) : 865- 879. (上接第 186 页) diagnosis of genital tract infection w ith Chlamydia trachomatis [ J] . J Clin M icrobiol, 2003; 41: 3784- 3789. [ 5] � Anguenot JL , de Marval F , Vassilakos P, et al. Combined screening for Chlamydia trachomatis and squamous intra- ep- it helial lesions using a single liquid- based cerv ical sample [ J] . Hum Reprod, 2001; 16: 2206- 2210. [ 6] � Schachter J, Stature WE, Quirm JC, et al. L igase chain re- action to detect Chlamydia trachomatis infection of the cervix [ J] . J Clin M icrobiol, 1994; 32: 2540. [ 7] � Dille BJ, Butzen CC, Birkenmeyer LG . Amplification of Chlamydia trachomatis DNA by lig ase chain reaction[ J] . J Clin M icrobiol, 1993; 31: 729- 731. [ 8] � Golden MR, Astete SG, Galvan R, et al. Pilot study of COBAS PCR and ligase chain react ion for detection of rectal in- fections due to Chlamydia tr achomatis [ J] . J Clin M icrobiol, 2003; 41: 2174- 2175. [ 9] � Kacena KA , Dohnal K, Benesova V , et al. Chlamydia, gonorrhea, and HIV - 1 prevalence among fiv e populations of women in the Czech and Slovak Republics[ J] . Sex T ransm Dis, 2001; 28: 356- 362. [ 10] � Noguchi Y , Yabushita H, Noguchi M , et al. Detection of Chlamydia trachomatis infection w ith DNA ex tracted from for- malin- fix ed paraffin- embedded tissues [ J] . Diagn M icrobiol Infect Dis, 2002; 43: 1- 6. [ 11] � Braverman PK , Schwarz DF , Mph M , et al. U se of ligase chain reaction for laboratory identification o f Chlamydia tra- chomatis and Neisseria gonorrhoeae in adolescent women[ J] . J Pediatr Adolesc Gynecol, 2002; 15: 37- 41. �190� 重庆医科大学学报 2005年第 30卷第 2期 ( Journal of Chongqing Medical University 2005. Vol. 30 No. 2)