蛋白质化学-2

null第一章　蛋白质化学（3-7章）第一章　蛋白质化学（3-7章）刘新文北京大学医学部生化与分子生物学系null第一节 蛋白质（protein）的生物学功能 nullnull2、蛋白质的重要生物学功能3、氧化供能其他生物学功能：营养蛋白，结构蛋白null第二节 蛋白质的分子组成null一、元素组成1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。 2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。 3、定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量＝6.25×样品含氮量 即1克氮相当于6.25克蛋白质null二、结构单位——氨基酸（amino acid）1、蛋白质的结构单位null透视式nullnullnullnullnull2、氨基酸分类：按其侧链®的结构和理化性质分类①非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)：p127 Ala（丙氨酸），Val（缬）, Leu（亮）, Ile（异亮）， Pro（脯）， Phe（苯丙）， Trp（色） ，Met（蛋）； ②极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Gly（甘） ，Ser（丝）， Thr（苏）， Cys（半胱），Tyr（酪）, Gln（谷氨酰胺）, Asn（天冬酰胺）；null ③酸性氨基酸（含有两个羧基，带负电荷的R基氨基酸）： Glu（谷），Asp（天冬）； ④碱性氨基酸（含有两个以上氨基，带负电荷的R基氨基酸）： Arg（精），His（组）， Lys（赖）。含硫氨基酸：Met（蛋）、Cys（半胱氨酸） 芳香族氨基酸：Phe（苯丙）、Tyr（酪）、 Trp（色）nullnull(Tyr)(Trp)nullnull蛋白质基本结构单位：L－－氨基酸 －氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外 L－氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。小结null三、氨基酸的理化性质1、物理性质（氨基酸的旋光性和光吸收） 除甘氨酸外，氨基酸都有不对称碳原子，具有旋光性；参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光(400-760nm)区域都没有光吸收，但在远紫外区（＜220nm）均有光吸收。在近紫外光区域（220-300nm）只有酪、苯丙、色氨酸有吸收光的能力，蛋白质最大光吸收在280nm波长处。 2、两性解离 等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点(pI)。null(zwitterion)null等电点计算 ①侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨 基酸：pI=½(pK1+pK2) ②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½(pK1+pKR) ③碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=½(pK2+pKR)带电状态判定 pI-pH<0 …………….带负电 pI-pH>0 …………….带正电 pI-pH＝0 …………….不带电null3、紫外吸收：Trp（色）、Tyr（酪）和Phe（苯丙）在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nmnull4、显色反应： 茚三酮反应其他反应：荧光胺反应、侧链特异基团反应例外：Pro黄色；Asp(Asn)棕色nullnull5、成肽反应：null第三节 蛋白质的分子结构null一、蛋白质的基本结构形式1、连接方式：肽键 肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（…CONH…） 肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个不对称碳原子共同构成的刚性平面（CαCONHCα），也称肽单元。nullnullnullnull2、肽分类、命名null3、生物活性肽： 谷胱甘肽 神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽 肽类激素：催产素、加压素等 其他：生长因子；短杆菌S；甜味肽等nullnullnullnull4、蛋白质的基本结构形式： 多肽链 (…NHCHCONHCHCO…) 多肽链的方向性：从N末端指向C末端。null二、蛋白质的一级结构 (primary structure) 一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺 序；主要靠肽键维系。 二～四级结构称为蛋白质的空间结构，或空间构 象；主要靠次级键维系，尤其是疏水键。一级结构体现生物信息：20n ………….多样 一级结构是空间结构及生物活性的基础…..特异 一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键nullnullnull三、二级结构蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。null1、α-螺旋(α-helix) 右手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm； 氢键维系：链内氢键（AA1…AA4），平行长轴； 侧链伸出螺旋nullnullnull2、β-折叠(β-pleated sheet) 多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状； 侧链交错位于锯齿状结构的上下方； 氢键维系：氢键的方向垂直长轴； 可有顺平行片层和反平行片层结构。3、其它 （1）肽链主链出现的180°回折部分称β-转角。 （2）蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分肽链构象称为无规卷曲。null2、β-折叠(β-pleated sheet)nullnullnullnull影响二级结构形成的因素null次级键介导蛋白质高级结构形成null四、超二级结构、域结构1、超二级结构( supersecondary structure )（1）基序或模序（motifs or modules，模体符） 在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模序。有的将这种规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。（2）类型：αα、ββ、αβα、锌指结构、亮氨酸拉链nullnull2、结构域（domain）结构域（StructuralDomain）是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。所谓结构域是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖区。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后，又由相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构，在此基础上多肽链折叠成近似于球状的三级结构。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或多个在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构缔合而成三级结构，这种相对独立的区域性结构就称为结构域 .null结构域是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。结构域与分子整体以共价键相连 具有相对独立的空间构象和生物学功能 同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同nullnull五、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。 长度缩短：球形、椭球形、杆状，等 多数同时含有α-螺旋和β-折叠 氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极 性（表面，少数内部）、带电（表面） 次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、 二硫键 功能区：表面或特定部位nullnullnull寡聚蛋白中亚基的立体排布及相互作用。 亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。 亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力 亚基可以相同或不同六、蛋白质的四级结构nullnull七、蛋白质的分类1、按照组成分类：单纯蛋白、结合蛋白 单纯蛋白：只有氨基酸组分 结合蛋白：氨基酸组分＋其他组分（辅基） 2、按照生物功能分类：酶、调节蛋白、转运蛋白、 运动蛋白、防御蛋白、营养蛋白、储存蛋白、 结构蛋白、毒蛋白等 3、根据形状分类 纤维蛋白 球状蛋白null第四节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。null1、一级结构中的保守序列决定空间结构 （1）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、 不同结构不同功能 （2）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构 【经典举例】酶原激活、分子病、蛋白变性与复性 （3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变 【经典举例】分子病一、一级结构与功能的关系null（核糖核酸酶）nullnull 分子病（molecular disease）：由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变，从而导致蛋白质功能障碍，出现相应的临床症状，这类遗传性疾病称为分子病。 【经典举例】镰形细胞贫血症：编码珠蛋白β链的结构基因第六个密码子由CTT→CAT，相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由Glu→Val；其空间结构发生相应改变，在表面形成互补区，使蛋白质分子之间彼此聚合，促使红细胞在低氧压下变形成镰刀形，丧失运输氧的生物活性。nullnullnull前胰岛素原前胰岛素胰岛素信号序列null前体蛋白与活性蛋白的转变 【经典举例】酶原激活：胃蛋白酶原切除N端42个氨基酸后形成活性中心及其他空间构象，转变为具有水解蛋白质活性的胃蛋白酶；胰蛋白酶原切除N端6个氨基酸后形成活性中心及其他正确构象，转变为具有水解活性的胰蛋白酶。null2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素 分子伴娘(molecular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。 与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成； 引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构； 可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。null1、空间结构体现生物特异性 2、空间结构体现生物活性 3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调 节特性二、空间结构与功能的关系空间结构中的特定区域体现生物活性null别构效应（别位效应、变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为别构效应。包括正协同、负协同效应 【经典举例】血红蛋白（Hb）：由α2β2四聚体组成，每个亚基含有1个血红素辅基；Hb的氧解离曲线呈“S”型。 多种空间构象，多种活性状态nullnullp252p257nullnullnullnullnull4、空间构象并非生物活性的唯一影响因素 【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。 5、蛋白构象疾病：错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。 老年痴呆 疯牛病 亨汀顿舞蹈病nullnull第五节 蛋白质的理化性质及分离纯化 nullnull不能透过半透膜.nullnullnull1、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离” 2、紫外吸收：最大吸收波长＝280nm 3、胶体性质：不能透过半透膜4、沉淀、凝固蛋白质在溶液中维持稳定的因素： 表面电荷、水化层（溶剂化层） 变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性一、理化性质（小结）null（1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出 （2）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强 　　　酸、强碱 （3）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱null（1）蛋白质变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。（p233） 理化性质的变化：紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。5、蛋白质变性(denaturation)与复性(renaturation)（2）蛋白质的复性：当变性因素除去后，变性蛋白 质又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋 白质的复性。null蛋白质的变性与复性去除部分变性剂温和复性温和复性天然蛋白 （具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）变性蛋白 （具有正确的一级结构但无高级结构，无生物活性）变性环境非天然蛋白 （具有正确的一级结构和错误的高级结构，无生物活性）【经典举例】Rnasenullnull（3）应用 ①利用变性： 酒精消毒 高压灭菌 血虑液制备 ②防止变性：低温保存生物制品 ③取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)null6、呈色反应：null二、蛋白质的分离纯化(p302)1.null2.nullnull3.null(p298)null4.null(p310)(p303)nullnullnull5.(20000r/min 以上)nullnull(P302)null二、蛋白质的分离纯化（小结）1、透析、超滤 根据性质：分子大小 2、盐析（salting out） 根据性质：蛋白质的沉淀 作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层 影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质null3、电泳： 根据性质：蛋白质的两性解离 作用机理：异性电荷互相吸引 影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形 状、溶液离子强度及pH等4、层析 （1）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状 （2）亲和层析：生物特性 （3）吸附层析：吸附特性null（4）分子筛（凝胶过滤层析）：分子大小及形状 大分子先洗脱下来 5、超速离心：分子大小及形状、溶液特性null第六节 蛋白质的结构（了解）null(p175)nullnullnullnullnullnull重要内容： 1、重要名词：isoelectric point（等电点）；domain（结构域）; subunit（亚基）；allosteric effect（别构效应）; protein denaturation（蛋白质变性）; molecular disease（分子病） 2、结构层次 元素组成：C、H、O、N（16%）、S 结构单位：20种L-α氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） 一级结构：肽键；多肽链；N端C端 二级结构：稳定力（氢键）；类型（螺旋，折叠，转角，无规卷曲） 三级结构特点：侧链R基参与，近球形的肌红蛋白 四级结构特点：亚基结构，每个亚基均具有三级结构 3、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性 4、分离纯化：超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛 5、结构与功能关系（举例）null随堂测验： 1.写出组成蛋白质20种氨基酸的名称；指出碱性氨基酸和酸性 氨基酸。（50分） 2.氨基酸含氮量是多少？蛋白质系数是多少？（10分） 3.分离纯化蛋白质的方法有哪些？（40分） null透析、超滤；盐析；电泳；层析；超速离心