蛋清溶菌酶提取工艺研究

动物科学 《现代农业科技)2008年第 6期 蛋清溶茵酶提取工艺研究 史小利 李宗谦 徐淑霞 张世敏 (河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002) 摘要 从新鲜鸡蛋的蛋清中提取溶茵酶 ，通过控制温度、调酸和加 盐，使溶 茵酶得到分 离和纯化 ，最后采用 自然干燥的制成产品。 关键词 溶茵酶 ：蛋清；提取 中图分类号 06—332 文献标识码 A 文章编号 1007—5739(2008)06-0166-01 溶菌酶是一种专门作 用于微生物细胞壁 的水解酶 ，又 称细胞壁溶解酶【i1．它作用于 N一乙酰氨基葡萄糖胺和 N一 乙酰胞壁酸之间的 13-1，4糖苷键吲，能使某些细菌细胞壁中 粘多糖成分分解 ，因而具有溶菌能力 。溶菌酶具有破坏细菌 细胞壁结构的功能．处理革兰氏阳性细菌可得到原生质体。 因此 ，溶菌酶是基 因工程 、细胞工程中细胞融合操作必不可 少的工具酶 ．同时也是食品工业的防腐剂。因此 ，开发溶菌 酶具有 良好的经济价值 。本文就蛋清溶菌酶 的生产工艺进 行了研究，现将有关结果如下。 1 与方法 1．1 原料与试剂 鲜鸡蛋(市售)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧 化钠、盐酸 、氯化钠 、丙酮 、724型阳离子交换树脂等 ，以上药 品均为纯 。 1．2 主要仪 器 分光光度计(7230G型 )、搅拌器 (200~300rpm)、离心机 (4 O00rpm)。 1．3 菌种 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，由本室保存。 1．4 培养基 1．4．1 液体培养基。牛肉膏 0．5g，葡萄糖 0．1g，氯化钠0．5g， 蛋 白胨 1g，溶 于 1L水 中 ，分 装 于 三 角瓶 中 ，121℃灭菌 15min。 1．4．2 固体培养基。牛肉膏 5g，葡萄糖 1g，蛋 白胨 10g，琼脂 20g，置于 1L水 中 ，加热溶解 ，分装于三角瓶 中，121℃灭菌 15min。 1．5 酶活力测定方法圈 1．5．1 底物的制备。将微球 菌接种于液体培养基 扩大培养 (28~(2，24h)，再接种于固体培养基培养(28~(2，48h)，用无菌 水将菌体洗涤 ，4 O00rpm 离心 10min，弃上清 ，再洗菌体数 次 ，最后用少量无菌水 制成悬液 ，冷冻干燥即得干菌粉。取 干菌粉 5g，加入少量 0．1mol／L的 pH6．2磷酸缓冲液置于匀 浆器或研钵中研磨 2min，倾出并稀释至 20~25mL，悬液的光 密度 OD4so在 0．5~0．7范围为宜。 1．5．2 酶液的制备。准确称取干溶菌酶粉 5rag．用 0．1mol／L 的 pH6．2磷酸缓冲液溶解成 0．05mol／L酶液。 1．5．3 酶活力测定。将酶液与底物悬液分别置于 25~(2水浴 中保温 10~15min，测底物悬液的 OD 值 ，作为对照。然后 加入酶液 0．2mL(约 10 g酶蛋白)迅速摇匀。从加酶时开始 记时，每 30s测 1次 OD4so值，共测3次。 1．5．4 酶活力的计算。以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降 低 0．001个单位为 1个酶活力单位。 溶菌酶活力=AOD (0．001 xW)(U／mg) 式中．AOD~o为 450nm处每分钟吸光度的变化 ；w 为 加入的酶量(mg)。 2 提取工艺 2．1 提取工艺步骤 提取工艺步骤见图 1 。 厂+l竺查} 厂叫鲨 墨圭 l 厂_'1 1塑堕 墨兰竺 2 l 上 耍互卜 匝 互巫圆 圆 —回 L 一圜 一 圭 圭 } 厂叫圭 圭 I 上 一圈 一 圆 上 一圈 一 图 1 蛋清溶茵酶提取工艺步骤 2．2 操作要点 2．2．1 蛋黄与蛋清的分离 。取新鲜的鸡 蛋 ，去壳 ，经分离器 后．使蛋清与蛋黄分离。打破蛋壳时应避免蛋黄破散，使两 基金项目 河南省自然基金项 目(0411033900)。 作者简介 史小利(1981一)，在读研究生，从事生物技术研究。 通讯作 者 收稿日期 2008-01—28 】66 者完全分离。 2．2．2 蛋清的预处理。将分离后的蛋清加入到搅拌器 中， 200~300rpm下搅拌 10min，再将蛋清搅拌稠度均匀即可 ，以 不弓I起发泡为宜。最后用 2~3层纱布过滤 ，以除去残余蛋壳 和少量蛋黄。 2．2．3 吸附。将过滤后的蛋清冷至5℃后移入搪瓷捅中，然 (下转第 168页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 动物科学 《现代农业科技)2008年第 6期 107~10。个／g，臭味强度 4~5级(较强一强)。经过无害化菌剂 生物发酵处理 ，所得到的生物有机肥 ，经测定 ，蛔虫卵 为 0。 死亡率 100％，大肠杆菌值分别为 1O 个／g和 1O 个／g，臭气 强度 为 0，均达到国家标 准规定的指标 ，形成无害无臭 的优 质生物有机肥。 4 生物有机肥和有机无机复混肥在小麦上应用效果 将生产的生物有机肥和有机无机复混肥在河南西平县 郊区的两处进行 应用试验 ，对照用三元复合肥(25％)。肥料 均作为基肥施用。两处分别在 2002年 9月 22日和 1O月 18 表 1 畜禽粪便发酵前后组成成分 日播种，小麦品种分别用太空 4号和 9023。播种量 150kg／b．m2； 2003年初调查、收获 。结果如表 2。 表 2 生物有机肥在小麦上应用效果 由表 2可知 ，小麦施 用生物有机肥和有机 无机 复混肥 分别与对照(三元复合肥)比较，小麦的每穗粒数、干粒重和 产量均有显著 的效果 ，小麦分别增产 1 755kg／hm2和 870 kg／'hm2，增产率分别为27．8％和 18．7％，而且使土壤变得明显 松软。 5 小结 应用无害化活菌制剂处理畜禽粪便 ，在 多种 有益微生 物作用下进行生物发酵，能充分分解其中的有机质。释放出 养分 ，所形成 的生物热和高温发酵过程 ，能杀死病菌 、虫卯 ， 除毒去臭 ，净化环境 ，生产形成高效优质生物有机肥和有机 (上接第 166页) 后在搅拌下加入已处理好的树脂(14％加入)，使其悬浮在蛋 清中 ，在 0~5~C下 ，搅拌吸附 5h，然后在 0~5~C静置 20h以 上，等分层后 ，弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗 2~3次 ， 以除去杂蛋白，最后晾干树脂 ，移入一个搪瓷缸中。 2．2．4 酶的洗脱 。在上述树脂中加入同体积 的 0．15mol／L的 pH6．5磷酸盐缓冲液 ，搅拌洗脱 20rain，过滤洗脱液 ．除去一 部分杂质。再重复洗脱2次。将除去杂质的树脂加入等量浓 度为 10％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱30rain，滤出洗脱液，重复 洗脱 3次 ，滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀 。 2．2．5 沉淀 。在沉淀缸 中按洗 脱液的体积加入 32％固体 硫 酸铵 ，搅拌使其溶解 ，在 4~C放置过夜 。第 2天 ，用虹吸法取 出上清，4 000rpm离心 10rain分离沉淀物。 2．2．6 透析。将沉淀物用蒸馏水全部溶解 ，然后放入透析袋 中，在 10~C水中透析过夜 ，以除去沉淀中的硫酸铵 。收集透 析液。 2．2．7 盐析。将透析液移入一容器内，用0．1mol／L的NaOH 调溶液 pH 至 8．5~9．0，有 白色沉淀时 ，应立即离心除去沉 淀。用 2mol／LHC1调 pH至 3．5，搅拌 ，并在 0~C放置 48h，同 上离心收集沉淀物。 2．2．8 成品的干燥。将上述沉淀物加入到丙酮，搅拌。放置 2h，收集沉淀 ，用冷冻干燥法干燥沉淀即得产 品。干燥 的溶 菌酶可在室温下长期保存。其纯品为白色或微黄色的结晶 168 无机复混肥 ，形成产业化。 发酵后 的生物有机肥具有改土作 用，有利于提高作物 产量和品质 ，适用于无公害农产品和绿色食品生产。在小麦 应用试验中 ，施用生物有机肥和有机无机复混肥比施 用纯 无机态三元复合肥 ，小麦穗粒 、干粒重和产量增加 ，效果显 著。 6 参考资料 ⋯1李远．我国规模养殖业存在的环境问与防治对策U]．上海环境科 学 ．2002(10)：597-999． [2j2张克强．畜禽养殖业污染物处理与处置[M】．北京：化学出版社，2003． [3j3刘更另．中国肥科学[M】．北京：农业出版社 ，1991． 体或粉末 ，无臭 ，味甜 ，易溶于水 ，不溶于丙酮 、乙醚 等有机 溶剂。 3 小结与讨论 关于酶 的纯化上 ，蛋清中溶菌酶的等 电点在 pill0．8左 右 ，在偏酸性和偏碱性溶液 中，其稳定性都比较好 ，蛋清中 其他 蛋白杂质的等电点约在 pH4．6~5．0左右 ，适量酸的添加 既不会破坏溶菌酶 ，又便于蛋 白杂质的沉淀 ，使溶菌酶得到 分离纯化同。 对于酶活力的高低，温度对其影响比较大 ，温度低时产 品纯度低，导致酶活力降低；而温度过高时，可导致酶蛋白 发生不可逆变性 ，同样造成酶活力下降。所以温度控制要适 当。除此之外，酶活力还与酶的纯度相关。因此 ，可在透折后 用超滤工艺使酶液得到浓缩 ，从而提高酶 的比活力，同时又 可除去大部分蛋 白杂质胸。 4 参考文献 ⋯ 戴清源．溶菌酶的研究进展U]．山东食品发酵，2oo5(3)：23—25． [2j2林翠花．溶菌酶结构特点及其应用U】．潍坊学院学报 ，2005，2(5)： 108-110． [3j3刘源岗，邓倩莹，廖问陶．溶菌酶的活性测定UJ．食品科技，2005(1o)： 71-73． 林 亲录 ，马美湖．鸡蛋卵清中溶菌酶 的提取与纯化U】．食品科学 ， 2002，2(23)：43—46 [5】张金城，高以炬，叶凌碧．超过滤技术在酶制剂工业中的应用U]．食品 与发酵工业 。~989(5)：62-69． [6j6张灏，赵玉萍 ，杨严俊．超滤法提取蛋清溶菌酶卟 无锡轻工大学学 报 ，2002，6(21)：607—612． 维普资讯 http://www.cqvip.com