流感病毒采集规范

附件5：流感监测实验技术操作规范 1、 流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输 （一）、流感临床标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。 采样液常用的采样液有以下五种：普通肉汤、pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml,-20℃冻存。采样方法有以下几种： 1) 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 2) 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。 3) 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。 4) 漱口液：用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液 5) 鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。 （二）、临床标本运送 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。 冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离的标本应置-70℃或以下保存。 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。 （三）、临床标本处理 临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。 鼻咽漱液或抽取液：用干净灭菌过的毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。 注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同上前，混匀后置4℃ 过夜或室温作用数小时后可接种。 临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离阳性的标本－70℃保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安全的有关规定处理。 （四）、血清标本的采集与处理 血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断及人禽流感待查病例的诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本时同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2～4周采集。一般采集空腹血。单份血清不能用作诊断。 取一根至少能装3 ml以上，干净和灭过菌的血清管做好标记，并进行登记，登记的内容包括：医院名称，患者姓名，性别，急性期（Acute，A）或是恢复期（Convalescence，C），采样日期（年，月，日）。 1． 从患者手臂静脉采2 ml血，放入准备好的上述血清管中。 2． 然后置室温数小时待血完全凝固。 3． 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于1.5 ml 无菌管中，做好标记。 4． 血清可置4℃存放一周，存放超过一周需置-20℃或以下保存。 （五）、流感病毒株的运输 需送国家流感中心实验室检测的病毒分离物，填写“流感/人禽流感毒株送检单”，在冻存后，在低温条件下，送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核，运输时遵守国家生物安全的有关规定。 1．流感毒株的送检要求 （1）自国家级流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的全部毒株。 （2）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，单向血凝抑制效价与国家流感中心提供的标准参照血清相比，有4倍或4倍以上差异的毒株。 （3）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA<8,且网络实验室不具备RT-PCR鉴定能力。 （4）暴发时采样分离到的所有流感毒株。 （5）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株。 （6）所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。 （7）全国流感监测网络实验室直接将毒株送至国家流感中心，填写“流感/人禽流感毒株送检单”。监测网络实验室中的市级实验室送检毒株时，应同时送省级疾控中心实验室备份。 （8）送检毒株在HI试验完成后，每两周送至国家流感中心。 （9）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株，应在HI试验完成后24小时内送至国家流感中心。 2．寄送流感中心的流感毒株标本的包装、运输 （1）病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本。 （2）将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封。 （3）直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填在“流感/人禽流感毒株送检单”内，送检单应单独放在防水的袋子里。 （4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。 （5）标本运输：异地运输可以采用邮寄或快递的方法 国家流感中心联系方式为： 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心 地址：北京市宣武区迎新街100号 联系电话： 010－63580764 传真： 010－635580764 （六）、标本的接收 送检的标本（毒株）送到实验室后，由专人在生物安全柜内打开标本的包装。记录收到日期、送检实验室名称、核对并记录送检标本（毒株）标编号是否与送检单相同。收到的毒株后，国家流感中心给送检单位及时反馈。 附件3.人猪流感（H1N1）病例标本采集和实验室检测指南 （暂行） 猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒的检测 所有猪流行性感冒（ H1N1病毒）疑似病例应该采集上呼吸道标本来检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）的病毒。 推荐采集的呼吸道标本： 疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔冲洗液/吸取物。如果不能收集这些标本，可合并鼻拭子与口咽拭子。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒运输液（ VTM ） ，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上运送至实验室。临床样品收集人员及实验室人员的感染控制指导请见相关文件。 拭子 理想的情况下，标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维 ），用铝或塑料做杆。不推荐棉拭子和木杆。不能用海藻酸钙做的拭子收集标本。标本采集管应包含3毫升病毒运输液（例如，含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液） 。 临床标本储存 所有呼吸道标本应保存在4℃ ，并尽快放置在-70℃。如果没有-70℃度冰箱，标本应保存在4℃ ，但不应超过4天。 临床标本运输 临床标本应按照A类包装要求运送，并用干冰运输。 所有标本应标示清楚。疑似病例标本运送应包含的信息请参照禽流感标本运输。 检测程序 呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。 推荐的检测方法 用Real-time RT-PCR方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。 其他检测方法 快速流感抗原检测 一些商用快速检测可以区分A和B型流感病毒 。快速检测实验A型流感阳性的病例符合可能病例的标准（见上文） 。这些实验对检测人感染猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒临床标本的敏感性和特异性未知，而且检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为猪流感感染的最后诊断。 免疫荧光法（或装配的IFA ） 免疫荧光试验可以区分A和B型流感病毒 。检测A型流感阳性的病例符合可能病例的标准（见上文）。免疫荧光试验的结果取决于临床标本的质量，操作技能，对检测人感染猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒临床标本的敏感性和特异性未知。因此，免疫荧光试验阴性结果可能是假阴性，不能作为猪流感感染的最后诊断。 病毒培养 可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离猪流感（ H1N1病毒）病毒可以诊断感染，但无法为临床诊断及时提供结果。病毒分离阴性并不能排除感染猪流感（ H1N1病毒）病毒。