胆红素与牛血清白蛋白低亲合力相互作用的研究

图 2010，VoI．27 No．8亿亏与生物Z程 Ch emistry & Bioengineering 胆红素与牛血清白蛋白低亲合力相互作用的研究 李 玲，陈 娟。周建刚。宋功武 (湖北大学 有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北 武汉 430062) 摘 要：用核磁方法和 Langmuir吸附等温方程研究了水溶液中胆红素(BR)与牛血清白蛋白(BSA)的低亲合力相 互结合反应 ，并测定 了最大结合 中心数 目( )、推 断了络合物 的络合常数 (K)。 关键词 ：胆红素 ；牛血 清白蛋 白；相互作用 ；低亲合力 中图分类号 ：0 657．39 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2010)08—0048—04 人们在配体一蛋白相互作用方面的研究取得了很 大的进展，可采用多种方法测定配体一蛋白相互作用 的动力学参数。 核磁共振波谱(NMR)方法可用于分子 间相互作 用的动力学研究 ，包括蛋 白质或蛋 白质 一配体络合物 的溶液结构测定 、同位 素编辑／镳 波或核 Overhauser 效应(NOE)技术迅速测定蛋白一配体络合物中配体 的结构[1]。在配体与受体发生作用时，许多 NMR参 数将发生变化。NMR方法可以通过几种途径测定药 物和蛋 白的相互作用 ，如化 学位移、线宽变 化、转 移 NOE及脉冲梯度场实验等 ]。 Langmuir吸附等温方程_6]是物理化学中用以描 述气体分子在固体面吸附和脱附动力学平衡的方 程，可用于研究气体和固体的相互作用及液体和固体 的相互作用r7 。 作者在此研究了水溶液中胆红素(BR)与牛血清 白蛋白(BSA)的低亲合力相互作用 ，结合 NMR动力 学测量、Langmuir吸附等温方程测定牛血清 白蛋 白对 胆红素的最大结合中心数目( )，并推断配体一生物大 分子络合物的络合常数(K)，为该领域的研究开辟了 一 条新途径。 1 实验 1．1 试剂与仪器 牛血清白蛋白，中国华美生物公司；胆红素， 瑞士 Fluka Chemika；所用试剂均为分析纯 ；实验用水 为二次蒸馏水。 Unity Inova 600型核磁共振谱仪，美国瓦里安公 司 。 1．2 原理 Langmuir吸附等温方程采用了两个基本假定：第 一 ，固体具有吸附能力是 因为吸附剂表面的原 子力场 没有饱和，有剩余价力。当气体分子碰撞到固体表面 时，其中一部分就被吸附并放出吸附热，但是气体分子 只有碰撞到尚未被吸附的空白表面才能够发生吸附作 用 ；当固体表面已覆盖满一层吸附分子 ，这种力场得到 了饱和，因此吸附是单分子层的。第二，已吸附在吸附 剂表面上的分子，当其热运动的动能足以克服吸附剂 引力场的位垒时，又重新回到气相。再回到气相的机 会不受邻近其它吸附分子的影响，也不受吸附位置的 影响。换言之，被吸附的分子之间不互相影响，并且表 面是均匀的。 与胆红素相比，分子量高达 66 000 Da的BSA分 子能够提供足够大的表面吸附或者结合胆红素分子。 由于胆红素与蛋白间的低亲合力，其相互作用很弱，结 合态和游离态胆红素分子处 于快速交换 中，因此可以 合理地假设 Langmuir吸附等温方程 的两个基本假定 适用于 BR与 BSA 的低亲合力相互作用 。结合过程 可用式(1)描述： BR+BSA=Complex (1) 基金项目：湖北省 自然科学基金资助项目(2008CDB017)，湖北大学校 自然科学基金资助项目 收稿 日期 ：2010—04—24 作者简介：李玲(1978一)，女，湖北嘉鱼人，博士，讲师，研究方向：表面活性剂与生物大分子作用；通讯作者：宋功武，教授 E：mail： songgw@hubu．edu．cn。 李 玲等 ：胆红素与牛血清白蛋白低 亲合力相互作用的研 究／2010年舞 8圈 假设每一个 BSA分子最多有 个结合中心可用 于接受 BR分子 ，则： nCp一[L8]+[P] (2) fL一[L ]+ [L ] ’ (3) 式中：c 、c 分别为溶液中 BSA和 BR的总浓度 ； [P]为 BSA分子中游离态结合中心的浓度；[LF]、 [LR]分别为游离态和结合态BR的浓度。 由 Langmuir吸附等温方程的两个基本假定 ，可 以得到： 吸附速率： k。[LF](nC 一[LR]) (4) 脱附速率一 一 [ ] (5) 当吸附过程和脱附过程达到平衡 ，则吸附速率 等 于脱附速率，式(4)和式(5)右边也相等。这样，就得到 与 Langmuir吸附等温方程类似的方程： 一 [ ] ㈤ nCP 1+KLLF] ⋯ 可变形为：瓦1 一 蕊1 十 i (7) 式中：K—k ／k 一 [L ]／{[L ]( c 一[L ]))， 是 BR—BSA络合物的络合平衡常数。 一 旦得到了[LB]和[L ]的具体数据，将 i／[-I e]对 1／[L ]作图并用式(7)拟合所得直线，就可以同时得 到两个参数 ： 和 K。 [LR]和[LF]的具体数据可通过 NMR测量获得。 某些 NMR参数，如驰豫速率和 自扩散 系数 的观测值 (y )，应该是游离态和结合态分子相应参数的权重 平均值 ，即： Yob 一xBYB+xFYF： xB(yB-yF)+YF (8) 式中：y。 。为驰豫速率或自扩散系数的观测值； yB、y 分别为结合态和游离态 BR分子的驰豫速率观 测值 ；x 、X 分别为结合态和游离态 BR分子 的摩尔 分数，X 一[ ]／c ，X 一[L ]／c 。 通过改变 BSA与 BR的浓度 比 Cp c。测量一系列 y 。数据，将此数据对 Cp／c。作图，分别外推 Cp／c 到 0 和无穷大 ，就可以得到 y 和 y 。根据式 (6)～(8)就 可计算出[LB]和[ ]。 1．3 方法 定量溶解 BR于溶液 中，得到 9个 NMR样品，其 中 BSA浓度均为 4．O0×10 mol·L～ ，BR浓度 (× 10 mol·L )则 分别 为 6．33、5．5O、5．13、4．95、 4．40、4．00、3．42、3．3O、2．80，对应 BSA与 BR浓度 比 ( ／cL)分别为 ：1：158、1：138、1：128、1：124、1： 110、1：100、1：85．5、1：82．5、1：70．0，含有 10 (体积分数)的重水(D o)。在 310 K下测定样品的 自 旋晶格驰豫时间。 2 结果与讨论 2．1 核磁图谱 BR溶液 的 HNMR图谱如图 1所示 。 含BSA ． 八 CBSA：4．00× 10 mol·L 图 1 BR溶液 的 HNMR图谱 Fig．1 HNM R of BR solutions 由图 1可看出，由于 BSA 浓度很小 ，加之存在快 速驰豫而引起谱线加宽现象．所以在含 BSA的样品溶 液中 BSA信号都很弱。同时，由于溶液的高粘度及结 合态和游离态分子间交换所造成的影响 ，含 BSA的样 品溶液中所有来 自BR的信号 也都变宽 了，由于微环 境的改变，化学位移值均发生了一定改变。 2．2 驰豫时间 测定 BR分子中 2-CH。中 H 的纵向驰豫时间，驰 豫速率的观测值 yob 随 BSA与 BR浓度比(Cp／c )的 变化如图 2所示。 2 0 1 8 -i ∞ 1 6 、 0 1 4 1 2 1 0 1OOcp／CL 图 2 BR分子的 2-CH 中 H的驰豫速率观测值 随浓 度比clOOcp／C )的变化 曲线 Fig．2 The curve of spin-lattice relaxation rate of BR vs 100cP／cL 从图 2可以看出，随着浓度比 Cp／c 的增大，驰豫 速率的观测值 y。 不断增大。 玲等：胆红素与牛血清白蛋白低亲合力相互作用的研究／2010年■ 8期 外推 Cp／c 为无穷大 ，可得 Y 一1．85 S～；外推 Cp／c 为 0，得 Y 一0 S一。由式 (8)所描述的快速交换 表 1 Tab．1 模型及 x 和 X 的定义，可计算出一系列[LF]和 EL ]值，结果见表 1。 含 4．00×10_5 tool·L-1 BSA的 BR溶液的驰豫速率观测值 The spin-lattice relaxation rates of BR solutions containing 4．00 X l0一 mol·L一 BSA 【LB I ×10—3 mol·L 1 ELF] × 1O一0 mol·L一1 1／ELF] i／[LB] ×1O 0 L ·reel 1 一 ×10a L ·mol～1 0．629 0．727 0．779 0．808 0．909 1．000 1．169 1．212 1．427 3．6800 4．2429 4．0510 3．9441 3．6517 3．4534 3．2632 3．2O15 2．7368 2．6483 1．2591 1．0801 I．O064 0．7488 0．5466 0．1574 。 0．0988 0．O662 0．3776 0．7942 0．9259 0．9937 1．3355 1．8296 6．352O 10．121O 15．0950 0．2717 0．2357 0．2469 0．2535 0．2738 0．2896 0．3064 0．3124 0．3654 将 1／I-L ]对 1／EL ]作图(图 3)，用式(7)拟合所 得直线 ，得 到 BR—BSA络合 物的表观络合 常数 K一 36。0 L·tool_。，BSA分子上的最大结合中心数 目 一 98。 一 巨 ／×10 L． I10 reel 1盯 × ‘ 图中直线为 Langmuir吸附等温方程(式 7)的拟合结果 图3 1／EL ]～1／EL ]关系 Fig．3 The relationship of 1／ELB]～1／ELr] 2．3 讨 论 本实验所用的模型适用于游离态和结合态配体快 速交换的体系。对于慢交换体系，式(8)不再有效，因 为此时 NMR信号非常宽，无法测得 yB，因而也就无 法计算y0 。血清白蛋白的X一射线研究和很多光谱研 究结果表明，在 BSA分子上与配体结合的高亲合力结 合中心数 目一般为 1或 2C 。由于洞穴可以很紧密 地结合配体小分子 ，因此很容易理解这类 BSA一配体络 合物的络合常数K非常大E ~1 。这类络合物的络合 常数 K通常在 1×10 ～1×10 L·mol 范围，可 以 肯定属于慢交换类型。然而，正与作者前面所提到的 那样，本实验观测不到这种类型的相互作用 。本实验 中采用很高的配体一蛋白浓度比，从而确保了BSA分 子上的高亲合力结合中心完全饱和。虽然实验体系中 高亲合力相互作用和低亲合力相互作用同时存在，但 本实验仅能获得低亲合力相互作用的信息。 作为生物大分子 ，不仅牛血清 白蛋 白可以和小分 子配体发生作用，DNA、RNA或者酶都可以发生这种 作用。可以预料，Langmuir吸附等温方程在配体一生 物大分子研究中的应用有着非常广阔的前景。 3 结论 采用核磁共振驰豫测量研究了胆红素和牛血清白 蛋白间的低亲合力相互作用 。得到 BR—BSA络合物 的表观络合常数 K一36．0 L·tool_。，BSA分子上 的 最大结合中心数目 =98。显然，研究配体一蛋白络 合物的结合等温线是理解 该类络合物形成过程 的关 键 。作为描述小分子在固体表面吸附和脱附动力学平 衡的一种手段，Langmuir吸附等温方程能够很好地解 释生物大分子对小分子配体的低亲合性结合能力。 参 考文献 ： E 1] Roberts G C K．NMR Spectroscopy in structure-based drug design [J]．Curr Opin Biotechnol，1999，10(1)：42—47． [2] Campbell I D，Dwek R A．Biological Spectroscopy[M]．Canada， 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affinity interaction between bilirubin(BR)and bovine serum albumin(BSA)was studied by NM R method and Langmuir adsorption isotherm equation．The maximum binding number was determined and the binding constant was concluded． Keywords：bilirubin(BR)；bovine serum albumin(BSA)；interaction；low affinity 复 旦 大 学 用 大 型 海 藻 制 成 生 物 油 复旦大学环境科 学与工程 系张士成副教授和陈建民教授课题组将海洋水体富营养化造成的海上“绿潮”大型 海藻浒苔成功转化制成生物油，从而有望使 浒苔这一污染“元凶”成为制造新能源的原。这一成果于近 日发 表在最新 出版的美国化学会能源领域权威期刊《能源与燃料》上。 近年来，由于全球气候变化、水体富营养化等原因，造成海洋大型海藻浒苔绿潮频频爆发，大量浒苔漂浮聚集 在岸边，阻塞航道 ，同时浒苔堆积腐烂繁殖后，破坏海洋生态系统 ，成为主要海洋环境问题之一。 复旦大学经过多次研究探索，采用水热液化工艺，将浒苔转化为生物油。在 220～320℃的水热条件下，经过 10~30 min即可得到生物油，最高产量可达 23 (质量百分比)。生物油具有较高的热值 ，为 28～30 MJ·kg ； 生物油为脂肪酸、酚类、酯类、酮类等组成的化合物 ，可以作为低级燃料直接燃烧，也 可以经过进一步精制得到不 同级别的生物质液体燃料或化工产品。同时，还得到 以乙酸为主的水溶相产物，可以作为化工原料 。该水热液化 工艺是模拟化石燃料的天然形成地质条件 ，在高温高压的水热环境 中进行反应 ，一般反应温度为 200~400℃ ，条 件相对比较温和 ，原料不需要干燥，能量输入较 少，对于浒苔等含水量高的水生植物，具有其它工艺无法比拟的优 势。 复旦大学充分利用环境污染副产物质 ，不仅对水生植物利用水热液化工艺制备生物质液体燃料 ，也对净化水 体优 良物种水葫芦等水生植物进行 了油料转化利用。 (摘编 )