哺乳期母鼠暴露大豆异黄酮对仔鼠卵巢类固醇受体表达的影响

第 36卷 第 5期 564 2007年 9月 卫 生 研 究 JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH Vo1．36 Sep． No．5 2007 文章编号：1000．8020(2007)05．0564．04 ·论 著 · 哺乳期母鼠暴露大豆异黄酮对仔鼠卵巢类固醇受体表达的影响 李丽 张晓鹏 张文众 宋雁 王伟 崔文明 刘兆平 李宁 严卫星 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 100050 摘要 ：目的 研 究大豆异黄 酮对新生儿期雌性 大鼠卵巢发 育的影响。方法 将 孕鼠随机 分至 大豆异黄 酮0、10、50、100、150和 200mg／kg bw染毒剂量组中，在母鼠产后第5～10天通过给母鼠灌胃使新生儿期大鼠 间接暴露大豆异黄酮，在产后第 l1天分离子代雌性大鼠的卵巢进行病理检查，并用免疫组织化学和 RT-PCR 方 法测定 卵巢中雌激素受体(ER)、雄 激素受体(AR)、孕激素 受体(PR)和增 殖细胞核抗 原(PCNA)及其 mRNA 的表达水平。结果 与对照组比较，大豆异黄酮 100、150和 200mg／kg bw剂量组的卵巢／体重显著增加，卵泡 发育加快；150mg／kg bw和200mg／kg bw剂量组卵巢 ER及其 mRNA和 PCNA蛋 白表达显著增加，而 PR mRNA 表达显著降低；但卵巢 AR、PR蛋白及 AR mRNA的表达各处理组与对照组差异无显著性。结论 新生儿期 暴露大豆异黄酮的雌性大鼠卵巢发育表现出明显的不良作用，这种作用至少涉及到雌激素敏感受体 ER、PR mRNA的转 录 关键词 ：大豆异黄酮 新生儿期 卵巢 类固醇受体 哺乳期 中图分类 号 ：TS214 Q946．885 Q579．13 文献标识码 ：A Effects of lactational exposure to soy isoflavones on steroid receptor expression in neonate rat ovaries LI Li，ZHANG Xiaopeng，ZHANG Wenzhong，SONG Yan，et a1． Institute for Nutrition and Food Safety，Chinese Centre for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China Abstract：Objective To study the effects of lactational exposure to soy isoflavones(SIF)on ovary development in neonate rats．Methods Virgin Sprague·Dawley female and male rats were fed with soy and alfalfa free diets(SAFD)．The pregnant rats were randomly divided into six groups with seven animals in each group．Dams in different~eatment groups received 0，10，50，100，150 and 200mg／kg bw of SIF from postnatal day 5 to 10(PND5·10)by gavage，respectively． On PND1 1， female litters were killed and ovaries were removed for pathological evaluation and detection of estrogen receptor(ER)，andron receptor(AR)，progesterone receptor(PR)，proliferating cell nuclear antigen(PCNA)protein expression by immunohistochemistry as well as ER．AR．PR mRNA expression by RT-PCR Results Th e ratios of ovary weight tO body weight increased significantly in 100， 150 and 200mg／kg bw groups than that in control group．And the ovary follicles developed more quickly in offsprings exposed to SIF．In 150 and 200mg／kg bw groups，ER，PCNA protein and ER mRNA expression in ovaries increased significantly，while PR mRNA expression decreased significantly． Other receptor expressions had no significant difference from the control group Conclusion Lactational exposure to soy isoflavones could induce adverse effects on ovary development in neonate rats，which mechanisms may，at least，partically involved with modification of mRNA transcription for ER and PR． Key words：soy isoflavones，neonate，ovary，steroid receptors 大豆异黄酮(soy isoflavones，SIF)是一类具有多种生物活 性的天然植物雌激素，主要包括染料木素(genistein，GEN)、大 豆黄素(daidzein，DAI)及少量 的黄豆素(glycitein，GLY)。SIF 的结构与内源性雌二醇(17~-estradiol，E2)相似，这种结构相似 性使大豆异黄酮可以与内源性雌激素 E2竞争结合雌激素受 基金项 目：国家自然科学基金资助项目(No．30400350)；“十一五” 国家科技支撑计划重大项目(No．2006BAK02A07) 作者简介：李丽，女，硕士，现工作单位北京市药品检验所 1通讯作者 体(estrogen receptor，ER)，发挥雌激素效应或抗雌激素效应。 虽然 SIF对健康具有一定的保护作用 ’ ，但随着大豆异黄酮 在食品工业(尤其是保健食品)中的广泛应用，人类的接触量 越来越大，SIF对生命早期生殖系统的潜在毒性作用已引起了 研究者的密切关注。因此，本研究以雌性大鼠为对象 ，研究新 生儿期暴露于大豆异黄酮对卵巢发育的影响，并初步探讨其 可能的受体介导机制。 1 材料与方法 1．1 主要材料与试剂 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 李丽，等．哺乳期母鼠暴露大豆异黄酮对仔鼠卵巢类固醇受体表达的影响 565 大豆异黄酮(纯度为 80％，GEN：DAI：GLY=13：5：2，购 自 上海同田生化技术有限公司)，不含大豆异黄酮和紫花苜蓿的 大鼠饲料(SAFD，由中科院实验动物中心合成)，ER一抗、AR 一 抗、孕激素受体(progestrone receptor，PR)一抗、增殖细胞核抗 原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)一抗 (购 自北 京 中杉 金桥生物技术有限公司 )，免疫组 化染色 试剂盒 (购 自北 京 中 杉金桥生物技术有限公司 )，DAB染 色试 剂盒 (购 自北京 中杉 金桥生物技术有限公司 )，B—actin 5'-引物 ATGGATGACGATA．r- CGCTGCG、B—actin 3 一引 物 CTCCATATCGTCCCAG rrGGT、AR 5 一引物 GACCAGATGGCAGTCArrrCAG、AR 3 一引物 CAGCTCTC一 ITGCAA n GGCTG、ER¨ 5 一引 物 TGACCAACCTGGCAGACAGG、 EB 3 一引 物 GCC1TlTI’GTYACTCATGTGCC、PR 5 一引 物 CAT— G rCAGTGGACAGATGCT、PR 3 一弓I 物 AC ITCAGACATCA IT— TCCGG(由上海生工生物 工程技 术服 务有 限公 司合成 )，Trizol (购 自 Sigma公司)，EB、DNA 100bp ma~er(购 自北京 莱博生 物 实验材料研究所 )，RNA提取试 剂盒 (购 自 Takara公 司)，DEPC (购 自 Sigma公司)，PCR管 (购 自 Axygen公 司)。 1．2 主 要仪器 低温高 速离 心机 (Beckman公 司)，紫 外 分光 光度 计 (Beckman公司)，光学显微镜(Nikon)，37℃恒温箱(天津泰斯 特仪器有限公司)，高温烘烤箱(江苏南通实验电器厂)，电泳 仪 (北 京 六 一 仪 器 厂 )，PCR仪 (PTC一200，Alpha Unit Block Assembly for PTC DNA Engine Systems)，紫外光凝胶成像系统 (VILBER L0URMA)。 1．3 动物分组 与处理 9周龄 sD大鼠，适应性饲养3天后，雌雄大鼠1：1进行交 配，每日观察阴栓，查出阴栓为受孕 0天。将 42只孕鼠按体 重随机分至 6个实验组 ，各组仔鼠出生后进行数量化，使 每个母鼠哺乳 8～10只仔鼠，其中含有 4～6只雌性仔 鼠。母 鼠在产后 5至 10天(即仔鼠出生后天数 PND 5～10)灌 胃给予 SIF，剂量 分别 为 0、10、50、100、150和 200mg／kg bw(记 为对 照 组 、SIF10、SIF50、SIF100、SIF150和 SIF、200)。 1．4 饲料配方 试验期间雌雄大鼠均以不含大豆异黄酮和紫花苜蓿的饲 料(SAFD)喂养 。 表 1 饲料配方含量 Table 1 The feedstuff ingredient ％ 成份 含量 玉米面 玉米油 小麦粉 酵母 鱼粉 (6o％蛋 白) AIN矿物盐 粗小麦 维生素预混物 酪蛋白 氯化胆碱(60％活性成分) 脱脂奶粉 玉米蛋白(60％蛋 白) 总计 30．56 2．0o 27．27 2．0o lO．0o 3．0o l0．00 O．O5 7．0o O．12 5．0o 3．0o l0o．0o 1．5 卵巢病理学检查 在母鼠染毒结束后次日随机处死 10只雌性仔鼠，分离仔 鼠双侧卵巢，称重后用福尔马林液固定 ，然后制成石蜡切片， HE染 色 ，显微镜下观察病理改 变。 1．6 卵巢 ER、PR、AR、PCNA蛋白表达 的测定 用免疫组织化学染色方法测定仔 鼠卵巢 ER、PR、AB、 PCNA蛋白表达水平，具体染色方法见。ER一抗稀释 比例为 1：150，PR、AR一抗 稀释 比例 为 1：200，PCNA一抗稀 释 比例为 1：100。采用美国BECKMAN Image—pro plus图象分析系 统分析免疫组化染色图片。 1．7 卵巢 ER mRNA、PR mRNA、AR mRNA表达的测定 用 R．r_PcR方法测定仔鼠卵巢 ER mRNA、PR mRNA、AR mRNA的表达水平 。RT反应条 件为：30℃ 、lOmin~48℃ 、30min 一99℃、5min一5℃、5min；PCR反应条件为：94℃、2min一94℃、 30s一58℃ 、30s一 72℃、1min一 72℃、5min，共 35个 循环 。电泳 图像采用 Geo—pm—analyser 3．1分析软件进行分析。 1．8 统计 学分 析 数据以 ±s表示 ，采用 SPSS10．0软件进行分析。 2 结果 2．1 大 豆异 黄酮对 卵巢重量的影响 如表 2所示，染毒前后各组仔鼠体重差异无显著性(P> 0．05)。染毒 6天 后 ，与对 照组 比较 ，SIF100、SIF150和 SIF200 组仔鼠的卵巢重量、卵巢／体重显著增加(P<0．05)。 表 2 大豆异黄酮对大 鼠卵巢重量的影响 Table 2 Eff酏ts of lactational exposure to soy isoflavones on ovary weights in ne0llate ratsI n=10，X±s) 注：与对照组比较(1)P<0．05 2．2 大豆异黄酮对大鼠卵巢的病理学影响 如 图 1所 示 ，对 照组 大 鼠的卵巢 小 、卵泡少 ，以原始 及初 级卵泡 为主 ；SIF10组 和 SIF50组 仍 以原始 卵泡 、初级 卵泡 为 主 ，个 别初 级卵泡 发 育为 次级 卵 泡；而 SIF100组 、SIFI50组 、 SIF200组次级卵泡 明显增 多变 大。 2．3 大豆异黄酮对 大鼠卵巢 ER、PR、AR、PCNA蛋 白表达 的 影响 图2和图 3所示 ，ER抗原、PCNA抗原分布在胞核中，在 图中表现为深棕色的阳性颗粒。随着大豆异黄酮染毒剂量的 增加 ，细 胞 中 阳 性 颗 粒 也 增 多 。通 过 光 密 度 分 析 ，SIF150、 SIF200剂量组 ER蛋白和 PCNA蛋白表达显著高于对照组(P <0．05)。但大豆异黄酮各染毒组 AR蛋白表达水平与对照组 差异无显著性(P>0．05)。大豆异黄酮各染毒组 PR蛋白的 平均光密度值与对照组相比有下降趋势，但差异无显著性(P >0．05)(表 3)。 2．4 大 豆 异 黄 酮 对 大 鼠 卵 巢 ER mRNA、PR mRNA、AR mRNA表达的影响 表 4所 示 ，灰 度 分 析 表 明 ：SIF1 50、SIF200剂量 组 ER／B一 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 第5期 李丽，等、哺乳期母鼠暴露大豆异黄酮对仔鼠卵巢类固醇受体表达的影响 表 4 大豆异黄酮对卵巢 ER mRMA、PR mRMA和 AR mRMA表达的影响 Table 4 Effects of lactational exposure to soy isoflavones on ovary ER mRNA。PR mRNA and AR mRNA levels in neonate rats(H=5，x±s】 注 ：与对照组比较，(1)P<0．05，(2)P<0．O1 3 讨 论 一 般动物饲料 中以大 豆 (SIF 14～153rag／100g大 豆 )作 为 重 要的蛋 白来源 ，有研 究表 明这 种常 规饲料 中 的低剂 量 SIF 也可影响雌性大鼠某些生长发育指标 。为了尽可能的减少 非处理因素对实验的影 响，我 们将 富含大豆 异黄酮 的大豆 和 紫花苜蓿成 分 由玉米 、小 麦和 酪 蛋 白代 替 (即 SAFD饲 料 配 方 )，从 而有 效控制饲料 中的大 豆异黄酮含 量 ，以突出处理 因 素(大豆异黄酮 )对实验结果的影响 。 本研 究 发 现 ，新 生 儿 期 雌 性 大 鼠在 SIF100、SIF150和 SIF200剂量组的卵巢／体重显著高于对照组 ，表明生命早期暴 露大豆异黄酮能增加卵巢重量，促进卵巢过快生长；病理学观 察发现高剂量组大鼠卵巢的卵泡多为次级卯泡，明显不同于 对照组的初级卯泡 ，说 明新生儿 期暴露 大豆异 黄酮可 刺激 卵 巢卯泡的提前发育。HUGHES等研究发 现 ，在妊娠 14天至 分 娩 21天母 鼠通过饮豆奶暴露 1O～31mg／kg SIF，子 代雌性大 鼠 在断乳 (即出生后 21天 )时卵巢 重量 显著增 加 。另有 研究 表明，雌性小鼠在出生后 1～5天皮下注射染料木素，卵巢出 现多卵卵泡 ，说明了染料 木 素可刺激 卵巢发 育 。而 卵巢 的 提前发育可导致体内雌激素合成释放量增加，诱发雌性个体 性早熟等不 良后果。 PCNA在细胞增殖调控中起重要作用 ，是一个很好的评价 细胞增殖活性的生物学标志物。本实验发现 150mg／kg bw和 200mg／kg bw的大豆异黄酮使卵巢中 PCNA蛋 白表达显著增 加 ，说明大豆异黄酮可使卵巢细胞增殖活性增加 ，细胞异常增 殖则可能使新生儿期雌性大鼠卵巢形态和功能发生改变。 卵巢是雌激素产生的重要场所，又是雌激素作用的靶器 官之一，ER、PR表达异常可引起卵泡发育及排卯异常、生殖能 力降低甚至卵巢肿瘤等；AR表达异常与不对称性多囊卵巢发 生有关 。ER、AR、PR均为核受体超家族 成员 ，是雌激 素 、雄 激 素和孕激素发挥生理学效 应 的物质基础 ，可与相应 的激 素结 567 合形成配体 ～受体复合物，调节特异性蛋 门 DNA或 RNA的 表达 ，从 而引发一系列 的激素 依赖性 乍 化过程 、这 砦受 体一旦表达异常，就会直接导致激素活性物质的作肘发生 常，最终引起靶器官的结构和功能发生变化 水研究未发现 AR表达 有显著改变 ，但 150mg／kg bw和 200mg／kg 剂 艟水平 的大豆异黄酮 已显 著上调新生 儿期雌 r 大 鼠卵巢 织 Ell及 其 mRNA的表达 ，显著下 调 PRmRNA的表达 水平 ；PR蚩 白的 表达水平虽未 明显 改变 ，但 已显示 出一 定的 下凋趋势 。说明 ER、PR蛋 白表达的变化可能是 因为其 tuRNA表达 水平 发生 r 变化，受体表达水平的变化可部分解释卵巢卵泡的 常发育 因此 ，从本研 究结 果可以看 出。大 豆异 黄酮可明显影 响新生 儿 期雌性大鼠的卵巢发育 ，其机制至少涉及到 ER、PR mRNA的 转录与表达 参考文献 1 HUMFREY C D N．Phytoestrogens and human heahh effects：weighiug up the current evidence【J J Nat Toxins，1998，6：5I．59． 2 COS P， BRUYNE T D， APERS S， et al Ph?toestrogens： recent developmentslJj Planta Med，2003，69：589．599． 3 CHEUNG S Y，YUEN M T，CHOI H L．et a} An expre,,~ion sludy of hormone receptors in spontaneously developed，carcinogen—iluluced and hormone-induced mammary tumors in female Nohle rats J 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