巨细胞病毒pp65抗原

中华传 染病杂志 2002年 8月第 2O卷第 4期 C— hin J— Infect Dis, g 2QQ2 1 2Q ： 巨细胞病毒 pp65抗原血症检测 覃海燕 盛瑞媛 张月秋 【摘要】 目的 评估巨细胞病毒(CMV)pp65白细胞抗原血症在骨髓移植或外周血干细胞移植 后活动性 CMV感染早期诊断和 CMV病的预测、指导 CMV亚临床期感染的抗病毒治疗及抗病毒疗 效判 断中 的价值 。 1999年 9月 ～2000年 4月共 收集 210份 乙二 胺 四乙酸 (EDTA)抗凝 血 ，骨 髓移植或外周血干细胞移植患者 36例。移植前用 ELISA法检测患者 CMV特异性抗体 IgG和 IgM， 移植后 3周起采用 CMV Brite试 验盒每周检 测 1次 CMV pp65抗原 血症 ，并计数抗 原阳性 细胞 ，直 到 移植后 100 d或治 疗后抗原 阴转 、死 亡或出院 。移 植后患者第 1次检测 到 pp65抗 原 阳性 细胞 即开 始 更昔洛韦抗病毒治疗。结果 36例骨髓移植或干细胞移植患者于移植前 CMV特异性抗体 IgG均阳 性 ，IgM均阴性 ；移植后 l6例出现 CMV pp65抗原血症 ，其中 l5例出现有症状的 CMV感染或 CMV 病，l4例接受更昔洛韦抗病毒治疗，l2例治疗后抗原血症阴转、症状消失，死亡 2例(病死率l4．2％)， 未经抗病毒治疗者 2例均死亡 (P<0．01)。l6例 pp65抗原阳性患者 中，仅 2例 CMV特异性抗体 lgM 阳性 。l0名健康对 照组的 CMV特 异性 抗体 IgG均 阳性 ，IgM 均 阴性 ，pp65抗 原血 症 检测 均 阴 性 。结论 本研究 结果 提示 ，人 CMV pp65白细胞抗 原血 症检 测可作 为骨髓 移植 后 CMV 病 的预测 指标，指导移植后抗病毒治疗的开展和疗效。pp65白细胞抗原血症出现即开始抗病毒治疗可明 显降低病 死率 。 【关键词】 巨细胞病毒感染；CMVpp65；骨髓移植 ；造血干细胞移植 Detection of CMV pp65 antigenemia QIN Ha@an，SHENG Ruiyuna，ZHANG Yueqiu． Depart ment ofInfectious Disease，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730。China 【Abstract】 Objective To evaluate the clinical utility of CMV pp65 antigenemia by CMV brite Kit for predicting active／reactive CMV infection S as well as of CMV diseases in bone marrow or peripheral stem cell transplant patients．We also investigated the efficacy of preemptive therapy guided by detection of CMV antigenemia．Methods A total of 210 EDTA anticoagulant plasma samples from 36 bo ne marrow or Peripheral Stem Cell Transplant Patients were prospectively collected from September 1999 tO April 2000． The specific CMV antibody IgG／IgM of all patients were detected by ELISA．We detected CMV pp65 antigenemia by indirect immunofluorescence assay using CMV Brite Kit．All blood samples were detected weekly from week 3 after bo ne marrow transplantation until 100 days or antigenemia turning negative／dis— chage or death．Ganciclovir preemptive therapy was initiated at first positive pp65 antigenemia．Results 0f 36 bone marrow or Peripheral Stem Cell Transplant Patients．16 patients occurred positive pp65 anti— genemia，15 patients suffered from symptomatic CM V infections or CM V diseases ．In 14 patients of posi— tive pp65 antigenemia receiving gaciclovir therapy at first antigenemia，2 patients died (mortality rate 14．2％)，12 patients of pp65 antigenemia became negative．Otherwise。2 untreated cases died．The study showed a significant difference in mortality rate between treated and untreated patients(P<0．01)．Con． clusions CM V pp65 antigenemia assay can predict active／reactive CM V infections or CM V diseases in bone marrow or peripheral stem cell transplant patients．pp65 antigenemia can guide preemptive therapy and evaluate efficacy of antiviral drug treatment and decrease mortality significantly at first positive pp65 antigenem ia． 【Key words】 Cytomegalovirus infections；CMV pp65；Bone marrow transplantation；Hematopoietic stem cell transDlantation 作者单位：100730 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院感染科 215 · 论 著 · 维普资讯 http://www.cqvip.com 2002年 8月第 20卷第 4期 Chin J Infect Dis，August 2002，Vol 20，No．4 巨细胞病毒(CMV)感染是免疫 功能低 下者 常 见的机会感染。 目前 器官移 植后抗 CMV 病 的重 点是预 防，包括 预防性抗 病毒治疗 和 Pre—emptive 治疗 ，前者对象为全部移植后患 者 ，于移植后立 即 用抗病毒 药物 (如更昔 洛韦和／或 CMV 特异性免 疫球蛋白)进行普遍性预防治疗；后者指检测到 CMV亚临床感染的证据或针对 CMv感染高危者 行抗病毒治疗_l J。早期检测到活动性 CMV感染 是 Pre—emptive治疗的先决条 件。众所 周知 ，常规 病毒培养需 4周才能获阳性结果 。ELISA法检测 CMV特异性 IgM 抗体可用于免疫功能正 常的 CMV活动性感染或 CMV病的诊断，但其阳性率 低，在严重免疫抑制患者可缺乏抗体反应或抗体延 迟出现。巨细胞病毒 pp65白细胞抗原血症较特异 性 IgM抗体出现早，也优于病毒培养的检测。 本研究 旨在采用 CMV pp65白细胞抗 原血症 检测作 为骨 髓 移 植 后并 发 活动 性 CMV 感 染 和 CMV病 的预测指标，并前瞻性观察 pp65抗原阳性 细胞数的变化，指导抗病毒治疗并判断治疗效果。 对象和方法 一 、试验对象 1999年 9月 至 2000年 4月 共 收 集 210份 EDTA抗凝血 ，为北京协和医院和三。七医院的骨 髓移植 患者 36例 ，包 括 异 基 因骨 髓 移 植 (Allo— BMT)26例 ，外周血干细胞移植 (PBSCT)10例。 骨髓移植前采用 ELISA法检测患者 CMV 特 异性 IgG和 IgM，移植后 3周 或人 院后开 始采用 CMV Brite试验盒每周检测 1次 CMV pp65抗原 。 直到移植后 100 d或治疗 后 pp65抗原 阴转 、死亡 或出院。异基 因骨 髓移植 患者 首次检 测 到 CMv pp65抗原阳性 细胞 即开始 更昔洛 韦抗 病毒 治疗 ， 外周血自体干细胞移植患者则在出现症状后用药。 同期检测 10例健康人的 CMV特异性 IgG和 IgM抗体和 CMV pp65抗原血症。 二、CMV pp65白细胞抗原血症试验 1．采用 CMV Brite试验 盒 检测 。CMV 抗 原 阳性和阴性对照玻片由试剂盒提供 。 2．抗 pp65单克隆抗体 C10／C11(IgG)为异硫 氰基 荧光 素 (FITC)标 记 的羊 抗 鼠免疫 球 蛋 白。 pp65是 CMV病毒 的低基质磷蛋 白，为 CMV 病毒 最丰富的蛋 白。本试验所用一抗为 C10和 Cll单 克隆抗体的混合物，2株单克隆抗体分别针对 pp65 不同的抗原决定簇以提高检测的敏感性。 3．CMV pp65白细胞抗原血症的检测步骤 ：① 分离 白细胞 ：取 EDTA抗凝血 5 ml，采用右旋糖酐 沉降法分离白细胞；②制备细胞涂片：用 1 ml PBS 悬浮细胞沉淀(中性粒细胞<0．2×10 ／L者，用 0．2 m1 PBS)，用 自动血细胞计数粒细胞 ，用 PBS将 细胞浓 度调 整至 1．5×10 ／ml；③ 制 备 白细胞 玻 片 ；④固定 和打孔 ；⑤免疫荧光染色。 4．读片和结果判断 ：用 荧光 显微镜观察结果 ， 在镜下观察全部细胞 ，pp65阳性细胞 呈均匀 的绿 色／黄绿色 ，圆形／多叶的核染色。如果染色的 2张 玻片结果有矛盾，染备份玻片。 三 、CMV感染的分类和定义_3 J 1．CMV 活动性 感染 的定 义 ：血 中出现 CMv pp65抗原阳性 白细胞 ，即出现 CMV抗原血症 ，包 括无症状感染和 CMV病。 2．CMV病 的定义 ：CMV pp65抗 原血症 出现 7 d内若体温≥37．8DC持续 3 d以上者并出现下列 二项者可诊断为 CMV 病 ：① 白细胞 计数≤3．0× 10 ／L，无其他原因可解释者；②肝炎(肝功能异常、 肝脾肿大)；③不典型淋巴细胞增多 ，异常淋巴细胞 >10％；④ 问质性肺 炎 (胸片证实 ，而 无其他原 因 者)；⑤视网膜炎；⑥移植物功能异常。 3．CMV无症状 感染者：仅 CMV pp65抗原血 症阳性，而无临床症状者。 结 果 一 、CMV pp65抗原血症 36例骨髓 移植 或 干细 胞移 植患 者 于移 植前 CMV特异性抗体 IgG均阳性，IgM 阴性；移植后 CMV pp65抗原血症检测 阳性者 16例 ，占 44．4％ (16／36)，包括异基 因骨髓移植 或异基 因干细胞移 植者 13例，自体干细胞移植 3例。16例抗原血症 阳性者 中 15例发生 CMV 病 ，占所 有移植患者 的 41．6％，占活动性 CMV感染 的 93．8％(15／16)。 10例健康对照者 CMV特异性抗体 IgG均阳 性 ，IgM 阴性 ，CMV pp65抗原血症检测均阴性。 二、CMV特异性抗体 IgM 36例骨髓移植或外周血干细胞移植者于移植 前测 CMV特异性 IgM抗体均阴性。移植后 16例 pp65抗原血症阳性者中 CMV特异性 IgM抗体阳 转者仅 2例，占 12．5％(2／16)；其中 1例抗原血症 经更昔洛韦治疗阴转后 CMV抗体 IgM 才呈阳转。 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华 传染病杂志 2002年 8月第 20卷第 4期 Chin J Infect Dis，August 2oo2，vol ， ． 三 、CMV活动性感染与其他细菌 、真菌感染的 关 系 pp65抗原阳性 者 16例 中有 13例合并细菌或 真菌感染 ，而 20例抗原 阴性 者 中仅 3例合并 细菌 或真菌感染 (P<0．01)。 四、接受全身放疗(TBI)与 CMV活动性感染 的关系 接受全身放疗组(TBI)的 CMV 活动性感染 的 发病率明显高于未接受组，前者发病率为 90．9％ (10／11)，后者为 12％(3／25)，P<0．01。 五 、CMV 活 动 性 感 染 与 移 植 物 抗 宿 主 病 (GvHD)的关系 pp65抗原 阳性组 16例中有 13例发生 GVHD (81．25％)．而 20例抗原阴性者仅 4例发生 GVHD (20％)，抗原 阳性 与阴性组 GVHD发生率差 异有 显著性 (P<0．01)。 六 、Pre—emptive抗病毒治疗和病死率 16例 CMV pp65抗原阳性患者中，14例接受 更昔洛韦治疗 ，12例患者经治疗后抗原血症 阴转 ， 同时症状消失 ，2例治疗无效死 亡，治疗 组病死 率 为 14．2％。未治人 数 2例 ，死亡 2例 (100％)，治 疗组病死率明显低于未治组(P<0．01)。 讨 论 CMV 间质性肺炎 、GVHD是异基 因骨髓 移植 最常见或最严重的并发症。如发生 CMV肺炎 ，病 死率可高达 80％～90％。因此早期、快速诊 断 CMV活动性感染对降低病死率 、避免过度免疫抑 制和指导抗病毒治疗都有十分重要的意义。传统 病毒培养法获得结 果晚 ，对早期诊断 帮助不 大 ，而 ELISA法检测 CMV特异性 IgM 抗体在免疫抑制 患者中的检 出率低 。本组 16例 pp65抗 原血症 阳 性的骨髓 移 植或 外 周血 干 细胞 移植 者 中仅 2例 IgM抗体阳性，阳性率仅 12．5％，表明严重免疫抑 制患者抗体产生延迟或缺乏抗体反应。据文献报 道 ，CMV抗体 阳转较 pp65抗原出现晚 30 d，本组 结果也证实此点。 本试验是用免疫荧光标记的单克隆抗体检测 周围血中性粒细胞 中 CMV的基质磷蛋 白(pp65)， pp65抗原是 CMV病毒复制的早期蛋 白，在外周血 白细胞 中的含量十分丰富，其功能是将病毒锚定在 受染细胞的核膜上 ，血中 CMV抗原 阳性细胞是病 毒在细胞 内活动性复制 的感染 细胞 。抗原 阳性 细 胞出现 在感 染 的早 期 ，通 常在 CMV 病发 作前 出 现 ，且在 CMV病发作 期 间持续 存在 ，治疗后 随病 毒消失而阴转 。本试验与传统病毒培养 比较 ，有快 速(4～5 h可获结果 )、敏感性 高(活动性 CMV感 染 为 80％ ～90％，CMV病 90％～100％)、特异性 较强(77％～95％)等优点 ，其检出率明显高于血清 学方法。另一优点是可定量检测 ，可预测 CMV病 的发生。缺点 ：①必须 在 8 h内处理标 本 ，如标本 放置过久会导致 阳性抗 原细胞数量减少影 响检测 结果的可靠性 。② 本试 验 中单克隆抗体 的制备是 用病毒原型株 ，可能检测不 出新毒株或抗原决定簇 有氨基酸变异的毒株。③骨髓移植后早期 ，患者 中 性粒细胞低 ，本检测方法的使用受到一定限制 。 人 CMV感染甚为普遍 ，根据健康人 群血清学 调查 ，我国部分 省 市 CMV 抗 体 IgG 的阳性 率 为 83％～100％。免疫功能正常者 CMV感染 多呈亚 临床或潜在感染 ，原发感染后病毒 以非复制状态的 体内长期潜伏 。CMV活动性感染是骨髓移植患者 的重要并 发症 和首位 死亡原 因 ，本组 骨髓 移植后 pp65抗原血症 检测 阳性 者 16例 ，其 中 15例 出现 CMV病 ，14例抗原血症阳性接受更昔洛韦抗病毒 治疗 者的病死 率 14．2％ ，2例未治者均死亡 (P< 0．01)，表明 pp65抗原检测对发现早期感染时抗病 毒治疗使 CMV感染的病死率明显下降。 本研究结果提示 ，人 CMV pp65白细胞抗原血 症检测可作为骨髓移植后 CMV病 的预测 指标 ，指 导移植后抗病毒治疗的开展和疗效评价。 参 考 文 献 l Boeckh M ，Gooley TA，Myerson D，et a1．Cytomegalovirus pp65 antigenemia．．guided early treatment with ganciclovir Versus Ganci— clovin at engraftm ent after allogeneic m arrow transplantatlon： arandomized double-blind study．Blood，1996，88：4063—407l 2 Hibberd PL，Tolkoff—Rubin NE，Conti D．et a1．Preemptive ganci clovir therapy to prevent cytomegalovirus disease in Cytom egalo— vivus antibody—positive renal transplant recipients Ann Intern Med 1995．123：l8．25 3 Turgeon N，Fishman JA，Nesli Basgoz N，et al Effect of oral a— cyclovir or ganciclovir therapy after preemptive intravenous ganci clovir therapy to prevent cytom egalovirus diseases in cy— tomegalovirus seropo sitive renal and liver transplant recipients re ceiving antilymphocyte antibody therapy．Transplantation．1998， 66：l780—1786． (收稿 13期 ：2002 02 20) (本文 编辑 李欣 ) 维普资讯 http://www.cqvip.com