海洋真菌生物活性物质研究之管见

Mycosystema 菌 物 学 报 15 March 2011, 30(2): 218-228 jwxt@im.ac.cn ISSN1672-6472 CN11-5180Q ©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved. 基金项目：国家“973”项目“海洋微生物次生代谢的生理生态效应及其生物合成机制”（No. 2010CB83380），国家自然科学基金项目“嗜盐微生物 抗肿瘤活性成分的研究”（No. 30670219） *Corresponding author. E-mail: weimingzhu@ouc.edu.cn 收稿日期: 2011-01-18, 接受日期: 2011-01-29 海洋真菌生物活性物质研究之管见 朱伟明* 王俊锋 海洋药物教育部重点实验室 中国海洋大学医药学院 青岛 266003 摘 要：海洋真菌是活性海洋天然产物的重要来源，到目前为止，已从海洋真菌的发酵产物中分离鉴定了 1,117 个新化合物。 介绍了海洋真菌次生代谢产物的研究历史、现状、特点、研究、存在问及其在新药研究中的应用前景。 关键词：海洋真菌，次生代谢，活性产物，含氮化合物，卤代物 A review on studies of secondary metabolites from marine fungi ZHU Wei-Ming* WANG Jun-Feng Key Laboratory of Marine Drugs Attached to Chinese Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China Abstract: Marine fungi are a kind of important source for active marine natural products. Up to now, 1,117 new compounds have been isolated and identified from the fermentation broth of marine fungi. In this paper, the history, status quo, methods and issues in studying secondary metabolites from marine fungi are presented. The compounds originated from marine fungi and their perspective in drug discovery were also discussed. Key words: marine fungi, secondary metabolites, active compounds, nitrogen compounds, halo-compounds 海洋微生物由于其生活在寡营养、弱碱性的含 盐海洋环境中，形成了独特的耐饥、耐碱和耐盐等 生理特征，具有独特的代谢机制，可产生有别于陆 生微生物的次生代谢产物，成为海洋天然产物的三 大来源之一（Blunt et al. 2009）；其中海洋真菌由于 其次生代谢产物的化学多样性丰富、产量高而成为 Vol.30 No.2 219 菌物学报 海洋天然产物研究的一类重要生物资源。到目前为 止，已从海洋真菌的发酵产物中发现了 1,117 个新 的次生代谢产物，这些代谢产物表现出良好的抗肿 瘤、抗菌、抗病毒等生物活性（Bugni & Ireland 2004； Moore 2005；Saleem et al. 2007）。以从海洋真菌 Aspergillus sp. CNC-139 中获得的化合物为合 成的 Plinabulin（NPI-2358）已进入 II 期临床研究， 用于治疗非小细胞肺癌（Mayer & Ireland 2010）； 而以海洋真菌代谢产物 cephalosporin C 为模板发展 起来的头孢菌素类化合物则是著名的系列抗生素。 本文将结合作者 2005－2010 的研究工作，对海洋 真菌次生代谢产物的研究作一管见。 1 海洋真菌的生物多样性和分布情况 海洋真菌不是一个分类学的概念，而具有生态 学意义，是指那些生活在海洋中、能形成孢子的真 核微生物。根据其生长和产孢是否一定需要海水， 海洋真菌可分为专性海洋真菌和兼性海洋真菌两 类：专性海洋真菌是海洋中的土著，只能在海洋环 境中生长和产孢；兼性海洋真菌则来源于陆地（水 流或空气带入），但适应了海洋环境，可在海洋环 境中生长和产孢。 据估计，海洋真菌至少有 1,500 种（Hyde et al. 1998）。但到 2000 年为止，被描述过的海洋真菌仅 有约 444 种，不到陆地真菌总数（约 5 万种）的 1%。 因此，海洋真菌仍处在一个探索和研究的阶段，随 着研究的不断深入，新的种属也会不断地被发现 （Hyde et al. 2000）。海洋生境中的真菌大多处在透 光层，特别是近海区域的各种基底上，如动植物（海 绵、海鞘、珊瑚、海藻、海草、红树林等）、海洋 漂浮木或海底沉积物中（图 1，Bugni & Ireland 2004）；但在 1,000m 以深的地方也发现了一些降解 纤 维 素 的 海 洋 真 菌 的 踪 迹 。 Kohlmeryer & Kohlmeyer（1979）认为，决定海洋真菌分布的主 要因素是可利用的营养源或宿主、温度、压力和氧 气等。 图 1 从不同海洋资源上分离到不同真菌种属数量（Bugni & Ireland 2004） Fig. 1 Number of fungal genera based on the marine source (Bugni & Ireland 2004). 2 海洋真菌次生代谢产物研究历史及 现状 海洋真菌次生代谢产物的研究始于 1953 年， 其主要的研究对象是海洋丝状真菌。Abraham 和 Newton 从分自撒丁岛排水沟污泥中的一株海洋真 菌顶头孢霉菌 Cephalosporium acremonium 的发酵 产物中分离鉴定了抗菌化合物 cephalosporin N （Abraham et al. 1953），两年之后，又分离鉴定了 抗菌化合物 cephalosporin C（Newton & Abraham 1955），但随后的几十年里海洋真菌天然产物的报 道极少。直到上世纪 90 年代，海洋真菌次生代谢 产物的研究才进入了一个新的发展期，到 1998 年 和 2002 年，已分别从海洋真菌的发酵产物中分离 鉴定了 173和 273个新天然产物（Biabani & Hartmut 1998；Bugni & Ireland 2004）；2000－2005 年期间， 发现了 103 个新的次生代谢产物（Saleem et al. 2007）；结构类型涉及生物碱、肽、萜类、甾体、 聚酮和大环内酯等。2007 年以后，海洋真菌中天然 产物的发现速度明显加快（Rateb & Ebel 2011，图 2）。据作者统计，2005－2010 年期间，发现了 751 个新的次生代谢产物，这些化合物表现出良好的抗 肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性，成为海洋天然产 物的研究热点（Bugni & Ireland 2004；Saleem et al. 2007；张亚鹏等 2006；Costantino et al. 2004； Sashidhara et al. 2009；Rateb & Ebel 2011）。 220 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn 图 2 1970-2010 年海洋真菌中发现的新化合物数量（Rateb & Rainer 2011） Fig. 2 New compounds from marine fungi published in 1970-2010 (Rateb & Rainer 2011). 3 海洋真菌次生代谢产物的特点 目前，已从海洋真菌的发酵产物中发现了 1,117 个新的次生代谢产物，化合物类型包括生物碱、多 肽、聚酮、萜、甾等多种结构类型及其卤代衍生物， 主要以含氮类化合物和聚酮类化合物为主，并产生 特征性的卤代化合物。表明，部分海洋真菌能利用 培养基中的氯合成氯代化合物。在 Biabani 总结的 173 个海洋真菌的次生代谢产物中，70 个为含氮化 合物、61 个聚酮类化合物、13 个氯代和 1 个溴代 化合物（Biabani & Hartmut 1998）；Bugni & Ireland （2004）总结的 272 个海洋真菌新天然产物中，82 个为含氮化合物、104 个聚酮类化合物、22 个氯代 和 1 个溴代化合物；作者也从一株海洋真菌 Penicillium terrestre LM2-02 中获得了 12 个新的聚 酮类化合物和 5 个新的氯代化合物（Chen et al. 2008；Liu et al. 2005a，b，c）。其生物活性表现为 抗生活性，如抗肿瘤、抗菌和抗病毒活性，可能与 其来源于高竞争性的海洋环境相关。 4 海洋真菌次生代谢产物的研究方法 海洋天然产物研究较多的是海洋丝状真菌（霉 菌）。一般地，欲从海洋丝状真菌中获得新的活性 天然产物，首先要从大量的海洋真菌株中筛选出具 有活性新天然产物的生产菌株，即“天才菌株 （talented strains）”；其次是通过发酵优化、跟踪分 离、结构测定和活性评价，从“天才菌株”的发酵 产物中获得新的活性天然产物。 4.1 海洋微生物“天才菌株”的筛选方法 “Talented organisms”最早出现于 Grabley 和 Thiericke 主编的《Drug Discovery from Nature》一 书中（Grabley et al. 2000）。其对微生物发酵产物进 行化学筛选（主要是薄层色谱 TLC 筛选）时发现， 从代谢产物的角度，微生物可分为 3 类菌，即天才 菌（talented organisms）——能产生大量结构多样 的次生代谢产物、低产生菌（organisms of narrow productivity）——产生 1－2 种主要的次生代谢产 物、非产生菌（non-producing organisms）：0.1－ 1mg/L 的检测限范围内不产生次生代谢产物。由于 结构新奇的化合物往往隐藏在量大的次生代谢产 物中（Monaghan et al. 1995），故天才菌能产生结构 新颖的活性化合物。但天才菌较少，约为 1%。而 研究表明，微生物次生代谢产物的化学多样性主要 取决于微生物的来源（株）及其培养条件；因此， “天才菌株（talented strains）”就是那些代谢产物 产量高、化学多样性丰富并具有生物活性的微生物 菌株。常见的化学筛选技术包括薄层色谱（TLC）、 高效液相色谱 -紫外（HPLC-UV）、液 -质联用 （LC-MS）、液核联用（LC-NMR）等，常用的生 物学筛选技术包括活性测试、基因筛选（Pelzer et al. 2005）等。只有将化学筛选与生物学筛选相集成， 才能从繁多的海洋真菌株中发现“天才菌株”。另 图 3 1999-2003 年专利海洋天然产物的分类（Frenz et al. 2004） Fig. 3 Category of active marine natural products in patents published in 1999-2003 (Frenz et al. 2004). Vol.30 No.2 221 菌物学报 外，Frenz et al.（2004）统计了 1999－2003 年 所报道的专利海洋天然产物（图 3），出新率较高的 活性化合物是生物碱（33%）、聚酮（17%）和萜、 甾类化合物（12%），其主要的生物活性为抗癌活性 （－50%）。筛选生产这几类化合物的产生菌，容易 获得“天才菌株”，故作者主要采用 TLC、HPLC 和抗生活性相集成的筛选方法。 4.2 海洋真菌“天才菌株”的发酵策略 微生物天然产物是微生物生长到一定阶段（通 常在对数生长期末期或稳定期）才产生的小分子化 合物（M≤600Da），其产生受诱导酶催化。由于诱 导酶的种类及其催化活性对环境条件变化很敏感， 故与其他天然产物类似，微生物天然产物的产生是 不连续、量子化的，因微生物种类、株（来源）、 环境（培养条件）的不同而明显变化（Bode et al. 2002）。因此，通过改变或优化培养条件，可以诱 导海洋真菌产生结构新颖的活性化合物，增加海洋 真菌天然产物的化学多样性。 4.2.1 “拟生态”培养（biomimetic culture）：海洋 是一个特殊的生态系统，海洋生物生活在海水配制 的特殊营养液中，它们之间的相生相克均通过海水 为介质来实现。与陆地土壤相比，海水中氮和碳的 含量只有陆地土壤中的 0.8%和 0.14%，而氯和溴的 含量却是陆地土壤中的 193 倍和 7 倍（唐任寰 1996），海水的平均盐度约 3.5%、pH7.9－8.4（平均 pH 8.2），水深每增加 10m，压力约增加一个大气压 （http://en.wikipedia.org/wiki/Seawater），海洋是一 个寡营养、含盐、弱碱性的压力系统。处于寡营养 和局部高盐环境中的海洋微生物也因此形成了有 别于陆地土壤微生物的耐盐或嗜盐、耐饥（寡营养） 等独特生理特征（周雅琳等 2010），通过模拟海洋 生态的拟生态培养，可以诱导海洋真菌产生新的活 性代谢产物。我们选择的拟生态培养基是“寡营养 （低氮源+低碳源）+2%－5%人工海盐或天然海水”。 土青霉Penicillium terrestre LM2-02是作者从青 岛胶州湾海泥获得的一株海洋“天才真菌”，采用 “富营养+天然海水”培养基培养时，产生了 8 个 结构新颖的聚酮类化合物 1－8，其对 A549 等肿瘤 细胞具有细胞毒活性，IC50 值为 0.5－9μmol/L（Liu et al. 2005a，b，c），其中化合物 1 和 2 为新骨架化 合物（Hill & Sutherland 2005）。但采用拟生态培养 时（0.1%蛋白胨+1%淀粉+天然海水），获得了 9 个 新的聚酮类化合物 9－17，其中 5 个是氯代化合物， 对 A549 等肿瘤细胞具有细胞毒活性，IC50 值为 5.1 －9.6μmol/L（Chen et al. 2008）。采用同样的拟生 态培养基，我们从与蕾二岐灯芯柳珊瑚 Dichotella gemmacea 共附生的赭曲霉 Aspergillus ochraceus LCJ11-102 获得了 2 个氯代化合物 18、19（周雅 琳等 2010）。表明在拟生态培养条件下，一些海 洋真菌可以利用含量相对较高的氯合成氯代化合 物（图 4）。 4.2.2 “高盐胁迫”（high-salt stress）：研究表明， 高盐条件造成的极端环境（如高渗透压和营养剥夺 等）可以激活生物体内的沉默基因或次生代谢产物 合成酶，从而诱导出独特的次生代谢途径 （Méjanellel et al. 2001；Park et al. 2010）。因此， 通过高盐胁迫（≥10%人工海盐或 NaCl）可以诱导 海洋等来源的耐盐真菌产生新的活性化合物。 表 1 海水的组成（按质量，盐度=35，from http://en.wikipedia.org/wiki/Seawater） Table 1 Seawater composition (by mass, salinity=35, from http://en.wikipedia.org/wiki/Seawater) 元素组成 Element 氧 O 氢 H 氯 Cl 钠 Na 镁 Mg 硫 S 钙 Ca 钾 K 氮 N 溴 Br 碳 C 百分比 Percent 85.84 10.82 1.94 1.08 0.1292 0.091 0.04 0.04 0.016 0.0067 0.0028 222 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn 图 4 化合物 1-19 的化学结构 Fig. 4 Structures of compounds 1-19. 菌核曲霉 Aspergillus sclerotiorum PT06-1 是从 莆田盐场（海盐）分离获得的一株“天才菌株”， 在“寡营养+高盐（10% NaCl）”胁迫下，产生了 2 个新颖的环六肽——菌核肽 A 和 B（sclerotides A and B，20 和 21），其在光照条件下可以互变；菌核 肽 A 和 B 抑制白色念珠菌 Candida albicans 的 MIC 值分别为 7.0 和 3.5μmol/L，菌核肽 B 抑制 HL-60 细胞增殖的 IC50 值为 56.1μmol/L（Zheng et al. 2009）。该菌株在“富营养+高盐（10% NaCl）”胁 迫下，产生了 11 个新的环三肽 sclerotiotides A－K （22－31），Sclerotiotides A（22）、B（23）、F（27） and I（30）具有抗白色念珠菌 C. albicans 的活性， 其 MIC 值分别为 7.5、3.8、30 and 6.7μmol/L（Zheng et al. 2010）。 变色曲霉 Aspergillus variecolor B-17 是从吉兰 泰盐场分离获得的一株“天才菌株”，采用高盐胁 迫（富营养+9% NaCl+0.5% KCl），产生了 15 个新 的异戊烯基取代的吲哚二酮哌嗪生物碱—— variecolortides A－C（33－35）和 variecolorins A－ L（36－47）、2 个新的聚酮类化合物（48、49）以 及 1个新三萜 50，化合物 48对A549以及 49对P388 和 HL-60 具有细胞毒活性，IC50 值分别为 3.0、3.7 和 1.3μmol/L（Wang et al. 2009a，2007a，b，c）； 其中化合物 33－35 为新骨架化合物（Hill & Sutherland 2008）。 菌株萝卜链格孢 Alternaria raphani THW-18 分 自红岛东风盐场（海盐），采用高盐胁迫（富营养 +10% NaCl），产生了 4 个新的含氮化合物，包括 3 个脑苷脂类化合物（alternarosides A－C，50－52） 和 1 个环二肽类生物碱 53（alternarosin A）（Wang et al. 2009b）。 以上结果表明，高盐胁迫可以诱导海洋等来源 的某些耐盐真菌株产生结构新颖的次生代谢产物， 特别是含氮化合物，推测其产生可能有助于缓解盐 胁迫造成的高渗透压；也再次表明，某些耐盐真菌 株可以利用培养基中高浓度的氯合成氯代衍生物 （图 5）。 4.2.3 “富营养胁迫”（eutrophic culture）：海洋真菌 由于适应了寡营养和低盐（－3%盐）的特殊环境， 可合成卤代化合物等特征产物；那么，增加氮源和 碳源的浓度，即采用陆地土壤培养基的氮源和碳源 和天然海水以及人工海水（浓度 2%－5%）配制的 培养基（富营养胁迫），是否可以诱导海洋真菌合 成含氮和聚酮类化合物呢？ Vol.30 No.2 223 菌物学报 图 5 化合物 20-53 的化学结构 Fig. 5 Structures of compounds 20-53. 烟曲霉 Aspergillus fumigatus HSW-PDA-1 是分 离自灵山岛海参的一株海洋真菌，采用“富营养胁 迫”获得了 4 个新的 N-异戊烯基取代的靛红生物碱 （54－57）、3 个新的吲哚二酮哌嗪生物碱（58－ 60），其对 A549、MOLT-4、BEL-7420 和 HL-60 肿 瘤细胞的 IC50 值为 1.9－6.7μmol/L（Wang et al. 2008）。萨氏曲霉 Aspergillus sydowi PFW1-13（源于 海南白沙门海滩的漂浮木）在富营养胁迫下产生了 1 个新的靛红生物碱 61、2 个新的吲哚二酮哌嗪生 物碱（62、63）、1 个新的氧杂螺内酰胺 64 和 1 个 新的降原萜烷型三萜 65（图 6）。化合物 61－63 具 有细胞毒活性，61－63对A549的 IC50值分别为8.3、 1.3 和 7.3μmol/L、化合物 61 对 HL-60 的 IC50值为 9.71μmol/L；化合物 64 和 65 具有抗菌活性，对大 肠杆菌、枯草杆菌和溶壁微球菌的 MIC 值分别为 3.74、 14.97、 7.49μmol/L 以及 10.65， 5.33 和 224 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn 10.65μmol/L（Zhang et al. 2008a）。 与海绵 Mycale plumose 共生的桔灰青霉 Penicillium aurantiogriseum sp0-19 在富营养胁迫 下，产生了 3 个新的喹唑酮类生物碱 66－68（Xin et al. 2007）、1 个新的对羟基苯甲酸酯 69（Xin et al. 2005）。红树植物桐花树 Aegiceras corniculatum 的 一株内生真菌 Penicillium sp. GQ-7 在富营养胁迫下 产生了 6 个新的 tetramic acid 的衍生物 71－76，化 合物 71 和 73 对 HL-60 细胞的 IC50 值分别为 0.76 和 3.20μmol/L（Lin et al. 2008）。红树植物海漆 Excoecaria agallocha 的 内 生 真 菌 扩 张 青 霉 Penicillium expansum 091006 在富营养胁迫下产生 了 4 个新的酚性没药烷型倍半萜 77、78 及其与二 甲苯醚的偶合衍生物 79、80，化合物 79、80 对 HL-60 细胞以及化合物 80 对 A549 细胞的 IC50 值分别为 15.7、5.4 和 1.9μmol/L（Lu et al. 2010）。 图 6 化合物 54-65 的化学结构 Fig. 6 Structures of compounds 54-65. 图 7 化合物 66-94 的化学结构 Fig. 7 Structures of compounds 66-94. Vol.30 No.2 225 菌物学报 从红树植物木榄 Bruguiera gymnorrhiza 的根泥 中获得一株“天才真菌”：焦曲霉 Aspergillus ustus 094102，在富营养胁迫下产生了 8 个新的倍半萜化 合物 81－88 和 6 个新的苯并呋喃衍生物 89－94， 化合物88对A549和HL-60具有较强的细胞毒活性， IC50值分别为 10.5 和 9.0μmol/L（Lu et al. 2009）。 炭色曲霉 Aspergillus carbonarius WZ-4-F11 是从涠 洲岛海泥中获得的一株海洋真菌“天才菌株”，其 在富营养胁迫下产生了 2 个新的萘并吡喃酮二聚体 95、96（Zhang et al. 2008b）以及 2 个新的酰胺类 化合物 97、98（Zhang et al. 2007），化合物 95 具有 一定的抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv ）活性，其最小抑制浓度（ MIC ）为 43.0μmol/L。绮丽穗霉 Spicaria elegans KLA03 则分 自青岛胶州湾的海泥，在富营养胁迫下主要产生细 胞松弛素（cytochalasin）类生物碱，包括 3 个新的 环状细胞松弛素 Z7－Z9（Liu et al. 2006）、6 个结构 新颖的开链细胞松弛素 Z10－Z15（Liu et al. 2008）； 化合物 Z7（99）和化合物 Z9－Z11（101－103）对 A549 具有细胞毒活性，IC50 值分别为 8.8、8.7、9.6 和 4.3μmol/L。 因此，增加培养基中氮源和碳源的浓度，并采 用天然海水或 2%－5%的人工海水配制时，可以诱 导海洋真菌“天才菌株”合成新的含氮、聚酮和萜、 甾类化合物（图 5－图 8）。 5 海洋真菌次生代谢产物研究中的存 在问题及展望 上世纪 90 年代以来，海洋真菌次生代谢产物 的研究取得了丰硕的成果，同时也存在着很多需要 解决的问题。主要表现在：（1）培养基的选择、诱 导物的添加以及培养方式等直接影响次生代谢产 物的因素，需要从盲目的尝试、经验走向理性设计， 需要化学和微生物学的紧密结合。（2）为了减小对 菌株的重复研究和对化合物的重复分离，最好能建 立共享的海洋微生物筛选数据库及其天然产物数 据库。（3）活性化合物产生的可重复性及其规模化 制备亟待加强。 海洋真菌的生存环境与陆生真菌迥然不同，从 而造成海洋真菌的次生代谢途径和酶反应机制与 陆生真菌显著差异，海洋真菌次生代谢产物结构的 多样性远远超出了人们的想象。随着深海采样技 术、分子生物技术的进步，特别是分子生物技术在 未培养海洋真菌中的应用，必将加速海洋真菌及其 活性次生代谢产物的研究，海洋真菌次生代谢产物 王国将成为人类 21 世纪的另一个大药房。 图 8 化合物 95-107 的化学结构 Fig. 8 Structures of compounds 95-107. 226 Mycosystema http://journals.im.ac.cn/jwxtcn [REFERENCES] Abraham EP, Newton GGF, Crawford K, Burton HS, Hale CW, 1953. 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